ELIS操作流程
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析抗原或者抗体的存在。
该操作规程旨在提供一个标准化的操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 酶标板：96孔酶联免疫吸附板。
2. 抗原或者抗体：待检测的抗原或者抗体样品。
3. 阻断缓冲液：用于阻断非特异性结合位点。
4. 洗涤缓冲液：用于洗涤酶标板孔。
5. 一抗：与待检测抗原或者抗体反应的第一抗体。
6. 二抗：与一抗反应的酶标记的第二抗体。
7. 底物：用于检测酶标记的第二抗体的底物。
8. 住手液：用于终止底物的反应。
三、实验步骤1. 酶标板涂覆a. 取出所需数量的酶标板，并在每一个孔中加入待测抗原或者抗体。
b. 将酶标板置于4℃的冰箱中，静置过夜或者至少2小时，使抗原或者抗体充分吸附在孔壁上。
c. 倒出孔内未吸附的抗原或者抗体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
2. 阻断a. 加入阻断缓冲液至每一个孔中，覆盖整个孔底。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，以防止非特异性结合。
3. 加入一抗a. 倒出阻断缓冲液，并加入稀释后的一抗至每一个孔中。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，使一抗与待检测抗原或者抗体发生特异性结合。
c. 用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
4. 加入二抗a. 倒出洗涤缓冲液，并加入稀释后的二抗至每一个孔中。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育1小时，使二抗与一抗发生特异性结合。
c. 用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
5. 底物反应a. 倒出洗涤缓冲液，并加入底物至每一个孔中。
b. 将酶标板密封，并在室温下孵育一定时间，使底物与酶发生反应。
c. 根据实验要求，控制反应时间，避免过度反应。
6. 反应终止a. 加入住手液至每一个孔中，终止底物的反应。
b. 使用酶标仪测量各孔的吸光度，记录实验结果。
四、质量控制1. 阳性对照：使用已知含有特定抗原或者抗体的样品作为阳性对照，确保实验的准确性和可重复性。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析生物样本中的特定蛋白质、抗体或其他分子。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂准备、样本处理、板涂覆、洗涤、标记物添加、洗涤、底物添加和测量等步骤。
二、实验前准备1. 准备所需试剂和材料，包括ELISA板、标准品、样本、缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等。
2. 检查仪器设备是否正常工作，如酶标仪、洗板机等。
3. 温度控制，确保实验室温度稳定在适宜的范围内。
三、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需要，配制适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三乙胺缓冲盐水）、BSA（牛血清蛋白）溶液等。
2. 标准品的稀释：根据实验要求，将标准品按照一系列浓度稀释，制备标准曲线。
四、样本处理1. 收集待测样本，如血清、尿液等。
2. 根据实验要求，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
五、板涂覆1. 取出ELISA板，将每个孔加入适量的涂层抗体或抗原，覆盖整个孔底。
2. 将板密封，放置在4℃的冰箱中，静置一夜或按照实验要求的时间。
六、洗涤1. 取出ELISA板，将涂层液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
七、标记物添加1. 向每个孔加入适量的标记物，与待测物相互作用。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，使标记物与待测物结合。
八、洗涤1. 取出ELISA板，将标记物液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
九、底物添加1. 向每个孔加入适量的底物液，使其与酶标记物反应。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，观察颜色的变化。
十、测量1. 使用酶标仪测量每个孔的吸光度值。
2. 根据实验设计和标准曲线，计算出待测样本中特定物质的浓度。
十一、数据分析与结果解释根据测量结果和标准曲线，进行数据分析和结果解释，得出实验结论。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤自己收藏的觉得很有用故上传到百度与大家一起分享！ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assayELISA）用于IgG定量测定的文章使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性又保留酶的活性在测定时把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化变为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析由于酶的催化频率很高故可极大地地放大反应效果从而使测定方法达到很高的敏感度方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件可设计出各种不同类型的检测方法（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合形成固相抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量根据同样原理将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）这种双位点一步不但简化了操作缩短了反应时间如应用高亲和力的单克隆抗体测定的敏感性和特异性也显著提高单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS在一步法测定中应注意钩状效应（hookeffect）类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象当标本中待测抗原浓度相当高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成夹心复合物所得结果将低于实际含量钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体故称为间接法操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合从而使该抗体间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量例如欲测人对某种疾病的抗体可用酶标羊抗人IgG抗体（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量本法只要更换不同的固相抗原可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体（四）竞争法竞争法可用于测定抗原也可用于测定抗体以测定抗原为例受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液使之与固相抗体反应如受检标本中无抗原则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合如受检标本中含有抗原则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会使酶标抗原与固相载体的结合量减少参考管中只加酶标抗原保温后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量洗涤（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多故颜色最深参考管颜色深度与待测管颜色深度之差代表受检标本抗原的量待测管颜色越淡表示标本中抗原含量越多（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在后者会干扰IgM抗体的测定因此测定IgM抗本多用捕获法先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上在去除IgG后再测定特异性IgM操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上形成固相抗人IgM洗涤（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合洗涤（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合洗涤（5）加底物显色：如有颜色显示则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在是为阳性反应（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白可由蛋清中提取分子量60kD每个分子由4个亚基组成可以和4个生物素分子亲密结合现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）生物素（biotin）又称维生素H分子量244.31存在于蛋黄中用化学方法制成的衍生物生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimideBNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物亲和素与生物素的结合虽不属免疫反应但特异性强亲和力大两者一经结合就极为稳定由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置可以连接更多的生物素化的分子形成一种类似晶格的复合体因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来就可大提高ELISA的敏感度亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式可用于间接包被亦可用于终反应放大可以在固相上先预包被亲和素原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量而且使其结合点充分暴露另外在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代然后连接亲和素－酶结合物以放大反应信号ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性又保留酶的活性在测定时受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开再加入酶标记的抗原或抗体也通过反应而结合在固相载体上此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例加入酶反应的底物后底物被酶催化成为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析由于酶的催化效率很高间接地放大了免疫反应的结果使测定方法达到很高的敏感度二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原也可用于测定抗体在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体称为"酶联物"、"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件可设计出各种不同类型的检测方法用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质（2）加受检标本保温反应标本中的抗原与固相抗体结合形成固相抗原抗体复合物洗涤除去其他未结合物质（3）加酶标抗体保温反应固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合彻底洗涤未结合的酶标抗体此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关（4）加底物显色固相上的酶催化底物成为有色产物通过比色测知标本中抗原的量在临床检验中此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等只要获得针对受检抗原的异性抗体就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法如抗体的来源为抗血清包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物如应用单克隆抗体一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗分别用于包被固相载体和制备酶结合物这种双位点夹心法具有很高的特异性而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应作一步法检测在一步法测定中当标本中受检抗原的含量很高时过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合而不再形成"夹心复合物"类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同如按常法测读所得结果将低于实际的含量这种现象被称为钩状效应（hook effect）因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落钩状效应严重时反应甚至可不显色而出现假阴性结果因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时应注意可测范围的最高值用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇例如HBsAg的a决定簇也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物但在HBsAg的检测中应注意亚型问题HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性这也是用单抗作夹心法应注意的问题双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体多为IgM型能和多种动物IgG的Fc段结合用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合表现出假阳性反应采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂由于去除了Fc段从而可消除RF的干扰双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原因其不能形成两位点夹心（二）双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似用特异性抗原进行包被和制备酶结合物以检测相应的抗体与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体此法中受检标本不需稀释可直接用于测定因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法本法关键在于酶标抗原的制备应根据抗原结构的不同寻找合适的标记方法（三）间接法测抗体(我公司分装TORCH及传染病试剂盒大多采用本法)间接法是检测抗体常用的方法其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体故称为间接法（见图2-3）操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结形成固相抗原洗涤除去未结合的抗原及杂质（2）加稀释的受检血清保温反应血清中的特异抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去（3）加酶标抗抗体可用酶标抗人Ig以检测总抗体但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合从而间接地标记上酶洗涤后固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法间接法成功的关键在于抗原的纯度虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果但应尽可能予以纯化以提高试验的特异性特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质例如以E.Coli为工程酶的重组抗原如其中含有E.Coli成份很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质例如来自人血浆或人体组织的抗原如不将其中的Ig去除试验中也发生假阳性反应另外如抗原中含有无关蛋白也会因竟争吸附而影响包被效果间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分IgG的吸附性很强非特异IgG可直接吸附到固相载体上有时也可吸附到包被抗原的表面因此在间接法中抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次以封闭（blocking）固相上的空余间隙另外在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）以避免过高的阴性本底影响结果的判断（四）竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时可用此法检测特异性抗体其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合标本中抗体量越多结合在固相上的酶标抗体愈少因此阳性反应呈色浅于阴性反应如抗原为高纯度的可直接包被固相如抗原中会有干扰物质直接包被不易成功可采用捕获包被法即先包被与固相抗原相应的抗体然后加入抗原形成固相抗原洗涤除去抗原中的杂质然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应竞争法测抗体有多种模式可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合抗HBc ELISA一般采用此法另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合洗涤后再加入酶标抗体与结合在固相上的抗原反应抗HBe的检测一般采用此法（五）竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点因此不能用双抗体夹心法进行测定可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合标本中抗原量含量愈多结合在固相上的酶标抗原愈少最后的显色也愈浅小分子激素、药物等ELISA测定多用此法（六）捕获包被法测抗体（经典方法）IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上因此如用抗人IgM作为二抗间接测定IgM抗体必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理以除去IgG的干扰在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法先用抗人IgM抗体包被固相以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）然后加入抗原此抗原仅与特异性IgM相结合继而加酶标记针对抗原的特异性抗体再与底物作用呈色即与标本中的IgM成正相关此法常用于病毒性感染的早期诊断甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体导致假阳性反应因此中和IgG的间接法近来颇受青睐用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功（七）ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语亲和素是一种糖蛋白分子量60000每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成生物素为小分子化合物分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物标记方法颇为简便生物素与亲和素的结合具有很强的特异性其亲和力较抗原抗体反应大得多两者一经结合就极为稳定由于一个亲和素可与4个生物素分子结合因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）在LAB中固相生物素先与不标记的亲和素反应然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度在早期亲和素从蛋清中提取这种卵亲和素为碱性糖蛋白与聚苯乙烯载体的吸附性很强用于ELISA中可使本底增高从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点在ELISA应用中有替代前者的趋势由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂增加了操作步骤在临床检验中ABS-ELISA应用不多科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法ELISA试剂的临床质量评价点击次数：48 发表于：2008-08-04 13:25 转载请注明来自丁香园来源：丁香园ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价符合一定要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的评价以肝炎ELISA诊断试剂为例首先必须通过中国药品生物制品检定以得到生产的许可检定内容除包装、标签、说明书等外对试剂的性能如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定通过对一系列参比品的检测结果符合要求者才为合格ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测以观察其实际应用价值部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作通过质量评价促进了试剂质量的提高一、诊断试剂临床质量评价要点从临床应用角度考核检验试剂的可靠性是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的目前还很难找到100%可靠的试验任何试验都会出现假阳性或假阴性判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示特异性以无病者试验阴性的百分率表示进行这种评价首先需要收集有关的病人血清然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定以确定其为阳性或阴性这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：血清盘结果合计＋－受检试剂结果＋ a b a+b － c d c+d 合计a+c b+d A+b+c+d 表中a为真阳性b为假阳性c为假阴性d为真阴性被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：灵敏度(%)=a/(a+c)×100%特异性(%)=b/(b+d)×100%符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%一般认为灵敏度或特异性>90%为良好符合率是综合灵敏度和特异性的指标二、临床考核血清盘的制备要求1、采用人的原血清；2、血清盘应具有相应的稳定性；3、血清盘中样本不含防腐剂或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；4、血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；5、阳性样本中应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；6、血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品以检验试剂的灵敏度7、血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF因子）的样本以检验试剂的特异性三、临床考核血清盘的建议以抗-HBc-IgM为例部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选选出血清70份其中阳性29份阴性41份组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘在70份样本中除7份为无病历的质控血清外抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例；抗-HBc-IgM阴性的40份样本中含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8例（其中5例为恢复血样）因此这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开具有临床诊断意义。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白质或其他分子在生物样本中的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前的准备工作、样本处理、试剂配制、板上实验步骤和结果分析等内容。
一、实验前的准备工作1.1 样本准备：收集样本时应注意避免污染和交叉污染，避免冻融次数过多。
样本应在规定时间内处理，避免长时间存放。
1.2 试剂准备：根据实验方案准备所需的试剂，如稀释缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等，确保试剂的质量和稳定性。
1.3 仪器准备：准备好ELISA板阅读器和洗板机等设备，确保仪器的正常运行和校准。
二、样本处理2.1 样本稀释：根据实验需求将样本进行适当的稀释，以确保浓度在标准曲线的线性范围内。
2.2 样本处理：对于血清或血浆样本，应先离心去除悬浮物，避免干扰因子的影响。
2.3 样本保存：处理完样本后，应储存于-20℃或更低的温度下，避免多次冻融。
三、试剂配制3.1 稀释缓冲液：根据实验方案准确称取试剂，按照比例稀释，确保最终浓度符合实验要求。
3.2 洗涤缓冲液：配制洗板机所需的洗涤缓冲液，保证洗板的干净程度。
3.3 底物液：根据实验方案配制底物液，确保底物液的质量和稳定性。
四、板上实验步骤4.1 包被：将包被抗体加入到板上，孵育一定时间后洗涤，使包被抗体固定在板上。
4.2 加样本：加入样本和标准品，孵育一定时间后洗涤，去除未结合的物质。
4.3 加底物：加入底物液，孵育一定时间后停止反应，加入停止液终止反应。
五、结果分析5.1 读板：使用ELISA板阅读器测定吸光度值，绘制标准曲线并计算样本的浓度。
5.2 数据处理：根据实验方案进行数据处理，包括样本浓度的计算和结果的统计分析。
5.3 结果解释：根据实验结果进行数据解释，得出结论并撰写实验报告。
总结：ELISA操作规程是一项重要的实验技。
Eclipse使用新手教程
Eclipse使⽤新⼿教程说起java的IDE，朗朗上⼝的⽆⾮是Eclipse了，假若能熟练Eclipse，对于我们编写java程序会起到事半功倍的效果，⼤⼤提⾼我们⼯作效率。
因此本篇博⽂，笔者仅仅是针对刚刚⼊门java的新⼿，以便他们能尽快掌握Eclipse的使⽤。
1. 经常使⽤快捷键这是使⽤⼯具的第⼀步，熟练使⽤快捷键对于我们编敲代码会起到相当⼤帮助，所以这⾥笔者列出的快捷键建议⼤家必须都掌握。
Ctrl + ⿏标左键（类、⽅法、属性的变量名词）：定位跟踪某变量声明或定义的位置Ctrl + S：保存当前⽂件Ctrl + X：剪切Ctrl + C：复制Ctrl + V：粘贴Ctrl + D：删除当前⾏Ctrl + F：查找/替换（当前编辑窗体）Ctrl + H：全局搜索Ctrl + /：凝视当前⾏或多⾏代码Ctrl + Shift + C：凝视当前⾏或多⾏代码Ctrl + Shift + F：格式化当前代码Ctrl + Shift + O：缺少的Import语句被添�，多余的Import语句被删除（先把光标定位到需导⼊包的类名上）Ctrl + Shift + S：保存全部⽂件Ctrl + Shift + X：把当前选中的⽂本所有变为⼤写Ctrl + Shift + Y：把当前选中的⽂本所有变为⼩写Alt + /：代码智能提⽰Alt + Shift + R：重命名（包含⽂件名称、类名、⽅法名、变量名等等，很好⽤）Alt + Shift + J：⽣成类或⽅法的凝视Alt + Shift + S：打开Source窗体（⽣成get、set⽅法，实现、覆盖接⼝或类的⽅法，⾮经常常使⽤）Alt + Shift + D, J：假设有main⽅法⼊⼝，则以Debug⽅式运⾏代码Alt + Shift + X, J：假设有main⽅法⼊⼝，则以Run⽅式运⾏代码2. 插件推荐Eclipse默认情况下是⼀个纯净版的，所以功能简单，⽽开源IDE最为强⼤的莫过于各种插件，通过使⽤插件能够帮助我们降低⼤量编写代码的⼯作量，也帮助我们降低了编写代码的难度，所以懂得安装必要插件，也是熟练使⽤IDE的鉴证。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合 形成固相抗原抗体复合物 经洗涤后 固相载体上只留下特异性抗体 其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合 在洗涤过程中被洗去
类试剂可削弱钩状效应
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇 例如 HBsAg 的 a 决定簇 也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物 但在 HBsAg 的检测中应注意亚型问题 HBsAg 有 adr、adw、ayr、ayw4 个亚型 显然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性 这也是用单抗作夹心法应注意的问题
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常 标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过 加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的
量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液 显色
竞争法可用于测定抗原 也可用于测定抗体 以测定抗原为例 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合 因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比 操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接 形成固相抗体 洗涤
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液 使之与固相抗体反应 如受检标本中无抗原 则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合 如受检标本中含有抗原
中受检物质的量呈一定的比例 加入酶反应的底物后
底物被酶催化成为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析 由于酶的催化效率很高 间接地放大了免疫反应的结果 使测定方法达到很高的敏感度
eclipse初次使用流程
eclipse初次使用流程As a beginner in using Eclipse, the first step is to download and install the Eclipse IDE. You can go to the official Eclipse website and find the latest version of the software to download. 然后，您需要按照网站上提供的安装指南，安装Eclipse到您的计算机上。
这个过程可能会有些复杂，但是一定要仔细阅读指南，按照步骤一步步来。
Once Eclipse is installed, the next step is to familiarize yourself with the user interface. Eclipse has a complex interface with various panels, tabs, and options. It may feel overwhelming at first, but take your time to explore each element and understand its purpose. 另外，您还需要熟悉Eclipse的用户界面。
这个软件的界面非常复杂，有很多不同的面板、选项卡和选项。
一开始可能会感到有些压力，但是慢慢来，逐个去了解每个元素及其作用。
Moreover, it is essential to understand the basic concepts of project, workspace, and perspective in Eclipse. A project is a collection of files and folders that are maintained in a specific directory structure. A workspace is a directory on your computer where your work is stored.A perspective is a way of looking at and working with yourworkspace and its resources. 此外，了解Eclipse中的项目、工作空间和透视图的基本概念也非常重要。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
Elecsys 2010操作简介
E L E C S Y S2010操作简介罗氏诊断(上海)有限公司正确的操作正确的结果功能键说明：1.按此键启动测试2.按此键加样停止，但已加样的继续分析3.按此键停止仪器工作4. 按此键进入急诊模式,处理急诊样本5. 按此键显示刚发生的警报信息，并可关闭报警声音6. 滚屏键.7 . 删除键8. 取消键.9. 确认键10.打印或手工发送报告菜单键说明:1.按此键查看试剂,消耗品装载情况及蒸馏水及废液水平2.按此键进入样本,定标,质控编辑界面3. 按此键查看标本结果,定标结果,质控结果4. 按此键进入质控统计情况5. 按此键查看当前仪器工作情况(样本,定标,质控处理情况).6. 按此键进入功能界面.操作菜单:1. 开机1.1注意: 在开机前，必须检查数据备份盘是否存在，是否打开打印机开关。
1.2检查数据备份盘:打开操做台前的门，检查数据备份盘是否在软驱内。
1.3打开打印机如果打印机未开启，打开位于打印机前右侧的开关。
当打印机打开时,绿灯亮。
同时检查打印纸是否足够。
注意：打印机型号可根据国家而不同1.4打开分析仪分析仪的开关通过位于操做台前的开关来控制。
按开关的右端使之处于ON的位置,开关上的绿灯亮表明电源已打开。
1.5登录开机短时间后，仪器启动完成.触摸屏幕显示状态的是分析仪关闭时的最后状态。
根据下列步骤操作：按STATUS进入STATUS屏幕，如下所示:不管系统是否被使用，OPERATOR ID总在屏幕上的相同位置❑按OPERATOR ID，输入你的号码（1－99）。
❑按ENTER确认。
2.开始样本检测前的注意事项2.1目测检查❑各针是否良好，是否有粘附物。
❑管道是否被夹和被折。
❑吸液针管路是否有气泡，如有，检查接头部分并作冲洗。
❑样品/试剂加载区和孵育器表面保持干净，吸样区和孵育器上的液体可能引起加样头(TIP)或反应杯被黏着，是造成抓手机械故障的隐患。
样品/试剂加载区和孵育器2.2检查各耗材库存情况按INVENTORY显示库存屏幕。
eclipse的使用方法总结
eclipse的使用方法总结Eclipse是一款功能强大的集成开发环境（IDE），被广泛用于Java开发和其他编程语言的开发。
它提供了许多工具和功能，使开发人员能够更高效地编写、调试和管理代码。
下面是关于Eclipse使用方法的总结，包括创建项目和其他一些常用操作。
1. 创建项目：- 打开Eclipse，选择File菜单，点击New，然后选择Project。
- 在弹出的对话框中，选择适合你项目类型的选项，比如Java Project或者Dynamic Web Project。
- 输入项目名称和位置，点击Finish完成项目的创建。
2. 导入现有项目：- 打开Eclipse，选择File菜单，点击Import。
- 在弹出的对话框中，选择General -> Existing Projects into Workspace。
- 选择你要导入的项目所在的目录，点击Finish完成项目的导入。
3. 编写和编辑代码：- 在项目资源管理器中选择你要编辑的文件，双击打开。
- Eclipse提供了智能代码补全、语法高亮等功能，可以帮助你更快速地编写代码。
- 可以使用快捷键Ctrl + Space进行代码补全，Ctrl + /注释/取消注释代码块。
4. 调试代码：- 在需要调试的代码行左侧点击添加断点，然后点击Debug按钮启动调试模式。
- 当程序运行到断点处时，程序会暂停，你可以逐行查看代码执行过程，并观察变量的值。
- 可以使用F5进行单步调试，F6进行跳过当前方法，F8继续执行。
5. 运行和测试代码：- 选择要运行的项目或者文件，点击Run按钮，Eclipse会自动编译并执行代码。
- 对于Java项目，可以创建JUnit测试用例来进行单元测试，使用Eclipse内置的JUnit功能进行测试。
6. 版本控制：- Eclipse集成了多种版本控制系统，如Git、SVN等，可以方便地进行代码的版本管理和协作开发。
ells实验流程设计
ells实验流程设计下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!1. 实验准备确定实验目的和检测指标。
选择合适的 ELISA 试剂盒，根据试剂盒说明书准备所需的试剂和材料。
ELISA知识
ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.0的碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA操作规程
ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学实验技术，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
本文将详细介绍ELISA操作规程，并按照一、二、三、四、五这样的顺序，分为五个部份进行阐述。
一、试剂准备1.1 根据实验需要，准备ELISA板、酶标板液、洗涤缓冲液、样本稀释液等试剂。
1.2 检查试剂的有效期和储存条件，确保试剂的质量。
1.3 根据实验方案，按照规定的比例和方法，将试剂进行稀释和配制。
二、样本处理2.1 采集样本，并根据实验要求进行标记和编号。
2.2 根据实验方案，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
2.3 确保样本的质量和数量符合实验要求，并进行必要的记录和标记。
三、板涂覆3.1 将ELISA板放置在工作台上，并按照实验方案要求，在每一个孔中加入特定抗原或者抗体。
3.2 保持ELISA板在适当的温度下孵育一段时间，以确保抗原或者抗体的吸附。
3.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未吸附的物质。
四、标记物检测4.1 准备酶标记的抗体或者抗原，并按照实验方案要求进行稀释和标记。
4.2 将标记物加入到ELISA板的每一个孔中，并在适当的温度下孵育一段时间，使标记物与抗原或者抗体结合。
4.3 将孔中的液体倒出，并用洗涤缓冲液洗涤孔，以去除未结合的标记物。
五、结果分析5.1 加入底物溶液，使酶标记物发生可见的颜色反应。
5.2 在适当的时间内住手反应，并用酶标仪或者其他仪器测量吸光度。
5.3 根据实验方案和标准曲线，计算样本中目标物质的浓度或者活性。
总结：ELISA操作规程是进行ELISA实验的基本指南。
通过试剂准备、样本处理、板涂覆、标记物检测和结果分析等五个部份的详细阐述，可以确保实验的准确性和可重复性。
在操作过程中，需要严格遵守实验室的安全操作规范，并根据实验方案进行操作。
惟独正确操作，才干获得准确可靠的实验结果。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在和浓度。
本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。
常用的缓冲液有PBS、TBST等。
按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。
确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。
2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。
标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。
3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。
尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。
三、样品处理1. 样品收集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。
确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。
2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。
通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。
3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。
确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。
四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。
每个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。
2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。
同样，每个样品应该有至少两个孔进行重复测量。
3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。
阳性对照应该包含所需的抗原或抗体，而阴性对照则不含。
4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。
可以使用密封膜或盖板进行封闭。
五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。
ELISA分析采用间接ELISA检测抗血清效价
ELISA分析采用间接ELISA检测抗血清效价。
用pH 9.6, 0.05 mol.L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组热休克蛋白稀释为20μg·mL -1 , 包被酶标板, 每孔100μL, 4℃包被过夜。
次日每孔加入100μL 5%的脱脂奶粉, 37℃封闭1 h后, 用pH 7.4 的PBST洗涤3次。
然后每孔加入200～51 200倍稀释的兔抗血清100μL, 阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清, 空白对照为兔抗血清稀释液( PBS) , 每份样品均做1平行, 37℃孵育1 h后, 同上洗涤3次。
再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG, 37℃孵育1 h后, 同上洗涤3次。
接下来每孔加入100μL TMB显色液, 37℃避光反应20 min后, 每孔再加入50μL 2 mol·L-1硫酸终止液。
最后, 在酶标仪上测450 nm下的OD值。
EL ISA分析结果兔抗蚌热休克蛋白的血清进行间接ELISA 检测时, 当(样品吸光值-空白吸光值) / (阴性吸光值- 空白吸光值) > 2.1即认为是阳性,经计算,此研究制备的兔抗血清效价为1：12800 (表1)。
间接ELISA 的操作按间接ELISA法进行测定: 用0.1 mol/ L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液将包被抗原稀释至工作浓度,每孔加100μL，37℃孵育1h ,再放入4℃冰箱过夜,弃去孔内液体,用PBST洗涤缓冲液洗三遍,每遍3min (以下简称洗涤)；每孔加1.5% 明胶封闭液200μL,37℃温箱放置1h后,洗涤;将血清百倍比稀释后每孔加入100μL ,37℃温箱放置1h后,洗涤;每孔加入1∶1500HRP-羊抗鼠IgG 100μL, 37℃温箱放置1h后,洗涤,每孔加新鲜配制的TMB-H2O2底物液100μL室温反应15min;每孔加终止液1mol/L硫酸50μL,15min内用酶标仪于波长450nm 处测定OD值。
用 Eclipse 执行业务流程
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ELISA操作流程
（一）、基本操作流程
方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）
1. 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；
3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；
4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；
5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；
6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；
7. 洗板：同步骤2；
8. 加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；
9. 洗板：同步骤2；
10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法（用于检测未知抗体）
1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；
2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；
3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；
4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；
5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；
6. 加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；
7. 洗板：同步骤2；
8. 加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；
9. 洗板：同步骤2；
10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定：裸眼观察结果或用酶标仪测OD值，有色产物的生成量＝抗体量。
(二) 、ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加入底物；结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加待检抗体, 形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体（抗抗体）；
加入底物；结果判定：有色产物的生成量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);
加入底物；结果判定：有色产物的生成量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
加入酶标抗原和待测抗原；
加入底物；
结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。