细胞凋亡、细胞周期

Cat No.
550480 550914
PARP cleaved –Caspase 3水解产物
• PARPs：一类由DNA链断裂而被激活 的DNA 修复酶。PARP可以被Caspase3水解成两个大小分别为24-和89-kDa 的片段而失活
• PARP cleaved是凋亡细胞中活化的 Caspase-3水解产物，代表Caspase酶 失去活性
小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段 。
• 检测方法 — Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋
亡百分比 — 末端转移酶标记技术
细胞核DNA检测原理：APO-BrdU
TdT: 脱氧核糖核苷酸末端转移酶
Brd UTP的渗入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高
TUNEL法: 流式分析晚期凋亡
细胞凋亡与疾病的关系
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细胞凋亡事件发生表
细胞膜事件 线粒体事件 Caspase事件 细胞核事件
1. 细胞膜变化的检测：Annexin V/PI
磷脂酰丝氨酸 (PS) 的检测：早期凋亡
Biblioteka Baidu
早期凋亡PS检测及结果判定
早期凋亡特征：
• 磷脂膜(PS)外翻，但是 细胞膜保持完整性， 因此PI染色为阴性
• DNA没有发生断裂
Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I
556570 559763
提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500 等多种荧光标记的Annexin V以及纯净的Annexin V。
Annexin V检测常见问题
Caspase-3 data（FCM）
Jurkat T-Cells
Mouse Thymocytes
Caspase-3 Kits
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit
PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit
细胞周期的样本制备
样本来源
• 培养的细胞、血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手术活检、细针 穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析。 • 新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样 本均可。通常最好的结果来自新鲜标本。 • 标本的细胞数应>106
注意事项： 获得单个细胞，尽量避免DNA的降解
BD流式系列课堂-1：
研究细胞生命活动的流 式解决方案
细胞凋亡概述
• 又称为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death) 是机体主动的、高 度有序地清除无用细胞的过程。和细胞坏死 (Necrosis) 相区别，坏死 是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程 。 薄膜有小泡状形成
细胞周期样本检测
DNA检测的常用术语
1. 变异系数（Coefficient of Variation，CV）
• 表示流式分析中DNA含量的分 辨率或精确度。 • 通常由G0/G1峰的CV来反映 【%CV=（SD/mean）x 100】 • 影响CV的因素主要包括两方面 ：仪器因素（如液流、光路、机 器调试等）和样本制备及染色过 程对标本的人为影响。优化 DNA分析条件就是指最大程度 地减少这两大因素带来的变异。
JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（ FL-2 Channel）； 细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降 低，JC-1 以单体形式存在于胞浆内，荧光 强度减弱甚至消失 ，故用 荧光信号的变化判别凋亡的发生。
p 操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测
JC-1检测结果流式图
P.S. CV在5%的精度足够，CV值的可信度在8%以内，但 要视样本的固定和染色方法而定
DNA检测的常用术语
2. DNA指数（DNA index，DI）和倍体（Ploidy）
• DI (DNA index)：DNA指数，指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均荧光强 度与正常二倍体G0/G1 峰的平均荧光强度（Mean）之间的比值。 DI为1 意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。
PI/Rnase staining buffer Reaction buffer Rising buffer Wash buffer
Part B (store at －20℃) Br-dUTP
Negative control cells Positive control cells TdT Enzyme
注意事项：
1. 细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性 2. 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子
BD Annexin V 流式检测试剂盒
Kit
Cat no.
Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I 556547
Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains unlabeled recomb. Annexin V
• 倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中为描述总的DNA含量。
二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。 DI为0.85-1.15为近二倍体，DI为1.9-2.1 的细胞为四倍体（CV为5%时 ），DI> 2.1的为多倍体，其余DI值均为非整倍体。一般把非二倍体统 称为异倍体。
结果分析
早期凋亡PS检测及结果判定
Annexin V-FITC
PI
细胞膜变化的检测：Annexin V/PI
优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞
样本设置：
1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电 压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。 2. 阴性对照：未诱导的，Annexin V/PI双染，细胞绝大部分都 在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非 特异性结合。 3. 单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿 4. 单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿
APO-DIRECT™ KIT 50 tests cat. 556381
Part A (store at 4℃)
PI/Rnase staining buffer
Reaction buffer Rising buffer Wash buffer
Part B (store at －20℃)
FITC-dUTP
1. 是否 Annexin V Kits 可以检测小鼠或其他物种?
• Annexin V试剂盒可以检测多种属
2. 这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细 胞、或组织?
• No. 上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，这样的 样本建议用免疫荧光技术 (Cat. No. 550911)
3. 是否与细胞表面标记兼容? CD11B/MAC-1 LY-71
Negative control cells Positive control cells TdT Enzyme
TUNEL法: 流式分析晚期凋亡
APO-BrdU™ KIT 60 tests cat. 556405
Part A (store at 4℃) FITC-Labeled Anti-BrdU mAb
JC-1 (Fl-2)
Jurkat T Cells
Control
R1
Mouse Thymocytes
Control
R1
R1
R2
Staurosporine
R1
R2
Camptothecin
R1
R2
Fas mAb
R1
R2
R2
R2
JC-1 (Fl-1)
3. 凋亡相关酶的检测- Caspase
• 背景知识
– 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通 常被降解，调节这一过程的蛋白叫做 Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）
– Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞 的重要组分，即Caspase 3激活==细胞 凋亡
– 检测原理：是通过特异性抗体检测 全长或者剪切后的Caspase活性。
Caspase-3 data（IHC）
Jurkat T-Cells
6 µM camptothecin for 4 h untreated
• 细胞凋亡的标志
PARP cleaved –Caspase 3水解产物
Jurket细胞用不同浓度的喜树碱处理结果
Hela 细胞 A. 未处理组 B. 星孢菌素处理组裂解的PARP cleaved阳性
化疗前后胃癌活检标本中PARP Cleaved+细胞
4. 细胞核DNA检测
• 凋亡晚期 — DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核
• 备注：该软件可以自动分析，也可手动分析；可以分析凋亡 、异倍体、各期比例等；结果均自动计算。
结果分析
正常细胞周期分析
肿瘤组织中的各种DNA倍体
肿瘤细胞
细胞周期与DNA倍体分析应用
FACS应用：辅助肿瘤早期诊断与鉴别诊断
药物对细胞周期的影响
更多的产品或技术信息，详见…
http://www.bdbiosciences.com/cn
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总结
BD流式系列课堂-1：
研究细胞生命活动的流 式解决方案
DNA含量与细胞周期
检测原理
利用特殊的荧光染料(PI等)与 细胞内DNA碱基结合，被这些 荧光染料染色的细胞在激光 照射下发射出荧光，荧光强 度与DNA含量成正比。流式细 胞仪通过测定细胞的荧光强 度推算出细胞的DNA含量。
PI染色
• CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要 手工进行参数统计和计算；
• 推荐使用ModFit分析软件（分析如下：） 1. 打开软件； 2. 在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1），去除聚集细 胞，必要时可以设两个门。 3. 在FL2-A直方图中显示R1中细胞的DNA含量直方图
• 只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做
2. 线粒体水平的检测
激活Caspase 9—激活Caspase 3—启动细胞凋亡
2. 线粒体水平的检测
• 凋亡与线粒体膜电位的去极化相关 • BD Mitoscreen (JC-1) Cat# 551302 25 tests • JC-1: 可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素 • 原理：
• 样本最关键的就是减少碎片（EDTA/不可过度吹打/离心rpm） • PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解 • PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂 • 污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌
细胞周期样本检测
注意事项：
1. 进样速度：一般检测细胞浓度调整为2E5–2E6/ml，进样速度为低速。若 峰形较宽，可能就是进样速度太快 2. 仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽 3. 排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W） 通过电压脉冲信号的宽度和面积区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最 大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果
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