组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
2014-5-6 PI法细胞周期检测
细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。
一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。
因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。
通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。
PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)产品简介：Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。
碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。
细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。
细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。
在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。
在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。
细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。
Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。
PI染色法检测细胞周期
PI染色法检测细胞周期一．实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。
值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。
2.试剂配制RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。
PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。
二．实验步骤1.细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。
2.细胞的固定：将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。
（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）3.RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500μL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。
PI染色法
流式细胞仪检测细胞凋亡——PI单染色法碘化丙啶（propidium iodide，PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，细胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料(如PI)不能进入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变.这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2。
光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加.细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
细胞周期：PI染色
细胞周期：PI染色
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。
它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm。
实验方法：
取生长期的XXX细胞，加入3mL PBS，去掉液体加入1mL胰蛋白酶消化1~5min。
加入5mL PBS制成细胞悬液，移至15mL离心管中1500rpm离心5min，去上清液。
加入500μL PBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2 mL 20℃95%冷乙醇，混匀后固定30 min。
加入5mL PBS，1500 rpm离心5min，去上清液。
加入5mL PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。
加入800μL PI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min。
用流式细胞仪上机检测。
PI染色检测细胞周期实验步骤
P I染色检测细胞周期实
验步骤
标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
p r o t o c o l：P I染色检测细胞周期1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。
2、用预冷的PBS清洗细胞两次。
3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。
4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8mL 的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入100μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30min （常温或4℃均可）
【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用PBS临时配好总量，其中PI50ug/ml、RNaseA100ug/mL、TritonX-10 00.2%）4℃避光染色30分钟】
5、流式分析
以标准程序用检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)
流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis) 本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。
基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。
由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。
由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。
另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。
Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。
它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。
所需试剂：1、PI染液：用于检测细胞周期的PI配制如下：方法一：10×PI配制方法,用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--EDTA10ml----PBS2、RNaseA——2mg方法二,直接配制PI工作液：PI -----5mgRNaseA——2mg1.0%Trition X-100——0.25ml枸椽酸钠——100mg生理盐水——65ml调pH值至7.2-7.5加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。
PI染色法测细胞周期
流式细胞仪的结构
液流系统
将细胞引导至检测点
光学系统
产生并收集光学信号
电子系统
将光信号转换成电信号，使之数字化，输入 计算机并分析
分选系统
液流系统
流动室 鞘液
酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液 或蒸馏水。
样本流
单细胞悬液，浓度51051 106/mL
宽度（FL2-W）常用来区分双联体细胞。 由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细 胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信 号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到 的测量数据G2期细胞比例会增高，影响 测量准确性
ModFit LT
是由美国Verity Software House 公司设计， 专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软 件。它通过对DNA 含量直方图进行曲线拧合， 能快速计算出分析细胞周期各时相细胞的含量、 G1/S/G2+M 细胞的百分比，并测量肿瘤细胞的 DNA 指数 (DNA Index)、及分析凋亡细胞亚二 倍体所占的比例。此外，2.0 版本还增加了 “同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分 別进行同步化细胞和增值细胞的研究 (Synchronized or Drug-Perturbed Cells)
液流系统
-FLOW CELL(流动室)：是仪器的核心部件，
被测样品在此与激光相交。
Байду номын сангаас
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
光学系统
光学激发系统
激光 激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相 干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的 光照
PI染色法测细胞周期
PI染料与DNA结合
PI染料能够选择性地结合DNA，通过 荧光显微镜可以观察到染色后的细胞 核。
数据分析
通过特定的软件对数据进行处理和分 析，可以获得细胞周期的分布情况。
细胞周期分析
通过对染色后的细胞核进行荧光强度 和面积的测量，可以分析细胞的细胞 周期状态。
PI染色法的应用
肿瘤研究
通过PI染色法可以研究肿 瘤细胞的细胞周期变化， 为肿瘤的诊断和治疗提供 依据。
05
注意事项
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中进行，以减少有毒气体的吸入。
02
实验过程中应佩戴实验服和化学防护眼镜，以防止试剂溅到皮
肤或眼睛。
实验后应将废液倒入指定的废液收集容器中，不要随意倾倒。
03
实验操作注意事项
确保细胞浓度适中， 以保证计数准确性。
在洗涤过程中要彻底 去除多余的染料，以 免影响计数结果。
02
PI染色法原理
PI染料的特性
01
02
03
高荧光强度
PI染料具有高荧光强度， 能够有效地与DNA结合， 发出强烈的荧光信号。
专一性
PI染料只与DNA结合，不 与其他细胞成分结合，具 有专一性。
细胞膜通透性
PI染料能够透过细胞膜， 与细胞核中的DNA结合， 实现对细胞核的染色。
PI染色法的原理
干燥细胞
让涂片自然干燥，以便更好地观察染色效果。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察涂片，记录不同时期细胞的 染色情况。
04
结果分析
细胞周期各期的划分
G1期
细胞开始生长，DNA合成前期 ，细胞体积逐渐增大。
S期
DNA复制期，细胞核内DNA含 量加倍。
PI染色检测细胞周期的方法
PI 染色检测细胞周期protocol1、 离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS 洗细胞两次。
2、 加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。
3、 细胞染色：离心收集细胞，以1mL 的PBS 洗细胞一次，加入500uLPBS 含50ug/mL 溴化乙锭（PI ）(1/100)，100ug/mL RNase A(1/1000)， 0.2% Triton X-100(1/500)， 4℃避光孵育30分钟（PI 我是直接用PBS 配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA 酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响） 。
4、 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit 分析。
分析时，使用FL2-w 和FL2-A 显示，去除联体细胞，具体如下图。
细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M 期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。
5、 结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76G2/M 期占13.07，峰位于横座标的91.43S 期占25.73G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）峰的变异系数为4.54%（好）细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。
总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）CV 是变异系数。
一般CV 越小，峰形越好，越尖锐。
能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
PI染色的讨论
关于PI（碘化丙啶）的讨论组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min －1h。
5 、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
PI染色法
流式细胞仪检测细胞凋亡——PI单染色法碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，细胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能进入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
PI染色检测细胞周期实验步骤
PI染色检测细胞周期实验步骤PI（Propidium Iodide）染色是一种常用的细胞周期分析方法，可用来定量分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
下面是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤：实验步骤：1.细胞培养：将要进行细胞周期实验的细胞株在无菌条件下培养至富有活力的生长期，并确保细胞数目足够。
2.细胞收获：将培养皿中的细胞用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤2次，以去除残留的培养基和衰老细胞。
然后用细胞解离液将细胞从培养皿上彻底剥离。
3.细胞计数：采用显微镜或血球计算板等工具计数细胞数目。
确保每个实验条件下的细胞数相似。
4. 固定细胞：用70%（体积比）的乙醇在-20℃的环境中将细胞固定。
将乙醇均匀地加入细胞悬浮液中，一般细胞浓度为1×10^6/ml。
放置细胞悬液在-20℃的冰箱中固定1小时。
5.染色：将固定的细胞在室温下洗涤2次PBS。
制备PI染色液，可以选择适当的PI浓度（如50μg/mL）然后将染色液加入洗涤后的细胞悬液中，使之均匀包涵。
在黑暗中静置15分钟以便细胞充分染色。
6.流式细胞仪检测：使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。
在流式细胞仪前，将细胞过滤，以去除聚团的细胞。
7.数据分析：使用流式细胞仪的软件或其他分析软件对所得数据进行细胞周期分析。
基于DNA含量，细胞可以被分为G0/G1、S和G2/M三个周期阶段，通过计算这些细胞的百分比可以得到细胞周期分布情况。
注意事项：1.实验要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。
2.在染色时，应在黑暗的环境中操作，以避免PI受光照的影响。
3.使用流式细胞仪时，要注意正确设置仪器参数，以获取准确的测量结果。
4.实验前后仔细清洁工作区和实验设备，以防止交叉污染。
以上就是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤，根据实验的需求和细胞类型的不同，还可以对实验步骤进行适当的调整。
PI(碘化丙啶)测细胞周期
PI(碘化丙啶)测细胞周期实验准备：配置70%乙醇存于-20℃冰箱。
PBS预冷在4℃冰箱。
每孔需PBS 4ml，需70%乙醇1ml，需胰酶0.3ml。
A.种板：细胞种6孔板（105-106/孔,1-2ml完全培养基/孔），培养24小时（或过夜）。
B.同步化：过夜后吸去完全培养基，每孔加入1ml无血清培养基，37℃培养12-18小时同化。
C.加药培养：同化后吸去培养液，加入含不同浓度药物的培养液（完全）培养24小时后收集细胞。
D. 收集细胞: 对于贴壁细胞，小心收集细胞培养液到1.5ml离心管内备用。
1mlPBS洗2遍。
300uL/孔胰酶消化细胞2min，加入1.0ml前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到1.5ml离心管内。
300g 左右离心3-5分钟，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液。
E.制作细胞悬液：加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml 离心管内。
再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
F. 细胞固定：加入1ml冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或过夜。
300g离心3-5分钟，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇。
加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。
再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
G.碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘H. 染色：每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min。
随后可以4℃或冰浴避光存放。
染色完成后宜在24h 内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。
I. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。
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组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
核染色剂（核染料）yuanaiyu：用流式细胞仪测脑组织细胞悬液中细胞线粒体的膜电位，需先将细胞与细胞碎片区分开来，现考虑用一种亲细胞核的染料将细胞分选出来，已尝试用过PI，但pI分子量大，过分破坏细胞膜而影响了线粒体膜电位。
请问有没有一种小分子的核染料，既能进入细胞核又对对细胞膜的影响很小？何处能买到？shaman3: 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI4（6-diamidino 2-phenyl-indole dihydrochloride）。
三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
至于什么地方能买到，DAPI常用在免疫荧光中，各大试剂公司都可订到，本人比较偏于DAPI，就是因为用过后发现它将细胞核染得很漂亮，如图（自己做的）：flyingrisker: 流式本身就有区别细胞和细胞碎片的功能的呀。
只要你在选要分析的细胞群落的时候，只选相对比较密集的细胞区域，就可以把碎片的感染去掉了。
你如果一定要用核染料，我觉得Hoechst33258不能用，因为它是紫外激发的，可能会对你的细胞线粒体膜电位有影响。
至于核染色的漂亮与否，大家可以比较一下。
这是我用Hoechst33258染的细胞核，如图PI的配置deardeer：PI怎样配制？怎样保存？有的文献说要用柠檬酸钠溶解，这对实验有影响吗？如果不这样，那直接加入而不用柠檬酸钠溶解可以吗？hinavy：PI配制I 15mg ,枸缘酸钠0.1g, NP-40 0.3ml,加蒸馏水至100ml,4度避光保存sunandsuny：也有的直接用PBS配的,也有的用1.0%Triton-X100*0.9%NaCL配的,浓度都是1mg/ml.andywang：我用来做流式的PI配制方法是: 5mg PI +0.1ml Triton X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4度避光保存。
为储存液，用时稀释10倍。
PI染液配方，用于DNA倍体检测hawaii_flyer：请大侠给个PI染液配方，用于DNA倍体检测cells：一般好象有两个浓度。
可购自PHARMAGIN或SIGMA。
1、比如用流式细胞仪测定神经细胞凋亡取缺氧-复氧培养各组海马神经元, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化(37℃、30 min)分散, 置于4℃冷乙醇中固定后, 在1×109个细胞/L密度的细胞悬液中加入1 ml碘化丙啶(PI)染液(100mg/L), 4℃染色30 min, 用FACS流式细胞仪测定荧光强度，激发波长488 nm，每次测定106 个细胞。
采用Modfit 分析软件进行细胞DNA含量分析，低于G1 期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。
2、 FACS检测凋亡细胞的亚二倍体DNA. 新鲜小鼠胸腺细胞细胞加入75％乙醇过夜, 次日用PBS洗2次, 加入PI(碘化丙啶)低渗染液(50 μg/mL PI, 0.1%柠檬酸钠, 0.1% Triton X-100), 以FACS检测细胞核DNA中亚二倍体的凋亡DNA 波峰.1）冰乙醇固定后无需穿孔？2）低渗PI染液中Triton用量是多少？有的是100染液中用1％Triton 0.5ml。
对吗？3）配方：柠檬酸三钠0.25gTriton-X 100 0.75mlPropidium iodide 0.025g核糖核酸酶0.005g蒸馏水250mlPI染色的剂量问题midas：我要用PI染色培养的细胞，科里的PI浓度是50ug/ml，但是这是染组织切片用的，但是我要用它来染细胞，不知此时PI的应用浓度是多少，jmtang：流式细胞仪PI染色死细胞方法。
PI能够插入双链DNA中。
它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。
Ⅰ、材料1、PI（e.g.,Cat #537059,Calbiochem,San Diego,CA）2、缓冲体系：1×PBS(Ca2+ and Mg2+ free,e.g.,Cat#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鲜小牛血清＋0.1%叠氮钠A、PI缓冲液：用缓冲液将PI溶解至终浓度为1mg/ml中，于4℃下密封避光保存1个月。
B、PI浓缩液：用缓冲液将PI溶解至终浓度为500mg/ml，于4℃下密封避光保存。
我们已经检测过将PI浓缩液放置数月后，并无观察到染色活性的丢失。
Ⅱ、方法：将样品细胞按程序描述的方法用FITC标记的单克隆抗体进行单色染色。
A、在最后的洗涤步骤后，将样品细胞悬浮于PI缓冲液中，于4℃下密封避光保存以备通过流式细胞仪分析；B、在最后的洗涤步骤后，如前述将样品细胞悬浮后备用。
如果您想检测样品细胞活力，在每一管中加入2μl的PI浓缩液，混匀。
将样品置于4℃下密封避光保存以备流式细胞仪分析。
注意：此法并不适用于甲醛固定的样品。
在根据Sasaki等人的方法（Cytometry 8:413,1987）用PE标记的抗体对样品进行染色时可以适用此方法。
然而，由于PI和PE的发射光谱的广泛交迭，因此本方法适于用7-氨基-放线菌素D将死细胞加以区分。
midas：昨天用PI染色出现灾难性后果，加入PI后，细胞全部脱壁、死亡，荧光下看一片红色，可惜我养了好久的细胞一下子就完蛋了！分析原因，我用的PI本来是用于然组织片的，为了增加膜的通透性，里面加了triton-X 100，这可能就是给我细胞带来灾难后果的原因，所以再次提醒自己：做细胞染色以及电镜时，一定不能加triton。
一切都要重来！再次请教：1、配PI的PBS的浓度是多少？2、做细胞染色PI的应用浓度（培养液中的终浓度）是多少？Huolj8：我染细胞PI用10ug/ml ，这是终浓度。
midas：用于配制PI的PBS浓度是0.01mM吗？Huolj8：PBS是一种缓冲液，其成分包括NACL，KCL，等。
好象不能用多少mM 算吧。
PBS:1000mlKCL:0.2gNaCl:8gNa2HPO4:1.15g or:Na2HPO4.12H2O:2.9gKH2PO4:0.2schover：用PI染色来区分死细胞和活细胞,浓度可以从5ug~20ug，我都试过，都可以，至于PBS没有什么特殊要求，只要是能够满足细胞培养即可。
用Hank's 液、生理盐水也可以代替。
碘化丙啶（PI）有没有毒guagua：我要做细胞荧光染色了，要用碘化丙啶（PI），与PI分子结构类似的EB（溴化乙啶）是强致癌剂，PI致癌性如何啊？gy：有毒的，荧光染料，染DNA的试剂都有毒的Fang CY：对每一个爱惜生命的人，发出如此只问是可以理解的。
但也相信提这样问题的人都是些刚进实验室的新手。
他们对一切充满了好奇，对一切所谓有毒，有害的事情又充满了恐惧。
他们总是希望收获好东西，而让坏东西离自己远远的。
但这样的事情很难两全其美。
要收获，就要付出，当然并不是要一定付出生命代价。
在实验室里，有太多的东西都是所谓的有害，有毒的，要想完全避开它们是不可能的，因此，有两点要做到：1. 适当注意防护，如戴手套，口罩等，有很多人平时实验时不传隔离衣，(包括老外，例如我们研究所，平时根本看不到有人穿)，但在某些特定实验下，还是要穿的。
2.克服心里障碍，这是最重要的一点。
如果在实验时，心里总是想者接触的试剂如何有毒，不但实验做不好，很可能会产生某些对身体的伤害，而这些伤害不是由於试剂本身的毒性导致而是由於心里因素导致。
我现在有一同事，由於对同位素恐惧，一到同位素实验室便大汗淋漓，腿脚发软！而一接触到病毒，就要再三的用酒精擦手，洗多次手。