蝇蛆壳提取壳聚糖的综合评价解析

【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
０引
言
料【５］，广泛应用于工业、农业及医药等领域。在医药 领域主要用于止血、抗菌消炎和促进伤口愈合㈣。 在自然界中，壳聚糖分布十分广泛，在菌类、藻类植
物等细胞以及虾、蟹外壳中含量较高。此外，壳聚糖
出血与渗血是目前外科手术中常见的难题。近
年来，优秀的可吸收医用止血材料引起了医学界和 产业界的广泛关注：随着临床对止血材料性能要求
１
【摘要】目的壳聚糖具有良好的水溶性、生物相容性、生物降解性、成膜性及止血、愈创、消炎等作用，
在医用生物材料应用方面具有广阔前景：蝇蛆的皮中含有大量壳聚糖成分，是获得较纯壳聚糖的方式之一： 对蝇蛆提取的壳聚糖创伤敷料进行综合评价。方法按照国家统一标准对蝇蛆壳聚糖进行理化分析（相对 分子质量、脱乙酰度和重金属含量）、抑菌、皮肤致敏、细胞毒性和溶血实验。结果蝇蛆壳聚糖的相对分子 质量为２６６ ｋｕ，脱乙酰度为７５％，重金属含量小于１０一，细胞毒性总评级为１级，具有较轻细胞毒性：致敏和 溶血实验结果表明，蝇蛆壳聚糖材料不具有致敏反应，材料的溶血率为０．７６９％，小于５％，即没有溶血现象。 此外，蝇蛆壳聚糖还具有抑菌作用：结论蝇蛆壳聚糖具有较好的综合特性，可以满足生物医药方面 的要求：
法”进行检测ｍ｝：实验分３组，浸提液组，生理盐水组
和甲醛组，每组随机分１０只豚鼠。豚鼠腹部剃毛，
在去毛区域注射材料浸提液。阴性对照液为生理盐 水，阳性对照液为甲醛：将浸透材料浸提液和阴、阳 性对照液的纱布敷贴于腹部，封闭同定２４ ｈ。分别 在２４和４８ ｈ观察激发部位的皮肤反应情况。 １．２．６溶血实验
在昆虫的外壳中含量也比较高，如蝇蛆外壳。目前， 壳聚糖的工业提取主要来源于废弃的虾、蟹壳。由 于水污染及虾、蟹过量打捞等原因，使得壳聚糖的 纯度和品质难以得到满足ｊ此外，虾、蟹壳中含有大 量的石灰质及蜡质，壳聚糖的含量低，生产工艺较 复杂，成本较高：而家蝇属于再生资源，且苍蝇的繁 殖能力很强，１对苍蝇４个月可繁殖２ ６６０亿个蝇 蛆。干蛆皮中壳聚糖含量约为３０％。５５％，高于虾、 蟹中壳聚糖的含量，因此具有可利用价值。除了壳 聚糖的含量高以外，蝇蛆壳中石灰石及蜡质含量相
本研究以蝇蛆壳提取的壳聚糖为研究对象，依 照国家对医疗器械的规定，对来源于蝇蛆壳的壳聚 糖粉进行物理、化学以及生物安全性评价。实验结
果有助于预测临床试验中可能出现的不良反应，为
溶液至酚酞指示液出现粉红色，再向溶液中加入醋 酸盐缓冲液，稍微加至完全没有沉淀，将样品转移 至纳氏比色管中，加入蒸馏水稀释至２５ ｍ１，将该处 理液作为甲管；另取加标准铅溶液作为乙管。向甲、
ｈ，
材（美国Ｇｉｂｅｏ公司），Ｌ９２９细胞（中围医学科学院 细胞库）。选取３０只２月龄豚鼠（清洁级），雌雄各 半，无皮肤疾病或者皮肤损伤，平均体质量为３５０ ｇ
（中国医学科学院放射医学研究所）。 ＩＶＳ６００—４Ｓ全自动乌氏黏度仪（杭州中旺科技
有限公司），ＳＭ８００多功能酶标仪（上海永创医疗器
械有限公司）。 １．２方法 １．２．１相对分子质量测定 精确称取０．０５ ｇ恒重样品加至０．１
ｏｎｅ
ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏＤ－ｅｆｆｅｅｔｓ．Ｆｌｉｅｓ ｍａｇｇｏｔ ｓｈｅｌｌ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｍｕｃｈ ｃｈｉｔｏｓａｎ．ｗｈｉｃｈ ｉｓ
ｒａｗ
ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ
ｗｅｒｅ
选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念 球菌作为初始菌悬液二实验方法按照《消毒技术规 范》（２０１２年版）执行二
１．３统计学方法
品糊状物作用２ ｒａｉｎ，对金黄色葡萄球菌和铜绿假 单胞菌的平均抑菌率为９５％，对白色念球菌平均抑
菌率为８３％＝ ３讨论与结论
采用ＳＰＳＳ １ ５．０统计学软件进行统计分析，数据 以均值±标准差（互±ｓ）表示，实验结果进行方差分
光度计比色皿中，在５４５ ｎｍ处测量ＯＤ值：计算溶 血．率
万方数据
溶蟀％，＝斋糍器嚣器ｘ１００％㈩
１．２．７抑菌能力的测定
国际生物医学工程杂志２０１６年６月第３９卷第３期Ｉｎｌ
Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１６，Ｖ０１．３９，Ｎｏ．３
血毒性。 ２．５抑菌活性分析 在１９～２ｌ℃条件下，用质量浓度为２５ ｇ／Ｌ的本
公司），ＲＰＭｌｌ６４０培养基、小牛血清和相关试剂耗
聚糖样品的细胞毒性试验¨０Ｉ，用含血清培养基浸 提实验样品…Ｉ，样品的质量浓度为０．１ ｇ／ｍｌ；使用 ＲＰＭｌｌ６４０培养基作为空白对照组；高密度聚乙烯
作为阴性对照组；５ ｇ／Ｌ的苯酚溶液作为阳性对照 组：将对数生长期Ｌ９２９细胞用胰酶消化后制成细 胞悬液，将悬液置于５％的ＣＯ：培养箱中培养２４
ｒａｔｅ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｎ
ｔｈａｔ
ｎｏ
ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｚｅｒｏ
ｐｒａｃｔｉｃａｌｌｙ
ｗａｓ
０．７６９％．ｗｈｉｃｈ
ｗａｓ
ｌｅｓｓ
５％．ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｈｉｔｏｓａｎ；Ｆｌｉｅｓ ｍａｇｇｏｔ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ
（２）
采用双突跃电位滴定法。准确称取蝇蛆壳聚糖
样品０．５ ｇ，加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ盐酸至过量，均匀缓慢搅
拌至样品完全溶解。用ＮａＯＨ标准溶液滴定样品溶 液，准确记录突跃点前后的ＮａＯＨ标准溶液体积
差，计算脱乙酰度
脱乙酰度（％）＝—ＡＶｘＣＮ，，ｏＨ—Ｘ１０－３Ｘ１６
ｍｘＯ．０９９ ４
阳性对照组为生理盐水；阴性对照组使用蒸馏 水；实验组使用蝇蛆壳聚糖生理盐水浸提液？分别
血。作用机制主要有：①壳聚糖分子能携带大量阳
离子，所带的正电荷可以和血液中红细胞表面带负 电荷的物质发生相互吸引，有助于伤口形成血凝 块，起到止血目的。此外，壳聚糖大分子物质可以在
ｔｅｓｔｓ
ａｓ
ｏｆ ｈｅａｖｙ
ｍｅｔａｌ），ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｔｅｓｔ，ｓｋｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
ｗｅｌｌ
ａｓ
ｈｅｍｏｌｖ，ｓｉｓ
ｔｅｓｔ
ａｃｃｏｒｄｉｎｇ
ｔｏ
ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃｈｉｎａ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｆ
Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｗａｓ ２６６ ｋｕ，ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ
ｔｏ
ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ
ｏｎ
ｃｈｉｔｏｓａｎ
ｔｒａｕｍａ
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Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓａｍｐｌｅｓ
ｃｏｎｔｅｎｔ
ｓｕｔ）ｊｅｅ｜ｅｄ
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ｐ｝１ｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ（ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ，ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ
万方数据
国际生物医学工程杂志２０１６年６月第３９卷第３期Ｉｎｌ
Ｊ ＢｉｔｉｍｅｄＥｎｇ，Ｊｕｎｅ
２０１６．、１一Ｉ
３９．Ｎｏ．３
对较低，且碳酸盐和重金属含量低，色素少，因此蝇 蛆壳是提取甲壳素的极好原料：
品，炽灼处理后取遗留的残渣，加硝酸蒸干，向残渣 中加入盐酸，水浴蒸干后再加水：向溶液中ｆｉ萄Ｄｉ：ｉ氨
乙两管中分别加入２ ｍｌ硫代乙酰胺溶液，摇动混匀， 放置２ ｒａｉｎ后置于白纸上仔细观察，比较两管颜色， 进行重金属含量检查： １．２．４体外细胞毒性实验 依据国家ＧＢ／Ｔ１４２３３．２—２００５标准进行蝇蛆壳
下一步临床试验提供实验依据：
１材料与方法 １．１主要材料与仪器
蝇蛆壳聚糖粉（天津普生元医疗科技发展有限
ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
待细胞完全贴壁后弃去原培养液：样品组加入蝇蛆 壳聚糖浸提液，放置于５％的ＣＯ：培养箱中培养。培
养３ ｄ后加入噻唑蓝（Ｍ１Ｔｒ）溶液，继续培养４ ｈ，加
入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）：将溶液震荡混匀后放人酶
标仪中，在５７０ ｎｍ波长下测定其溶液的吸光度（ＯＤ）
溶液中充分搅拌混合均匀。取１ ５．０ ｍｌ样品溶液置于 乌式黏度计中，在３０℃恒温水浴中放置１０ ｍｉｎ，并用 秒表分别测定溶剂和样品溶液的流出时间，重复５次 取其平均值。利用公式（１）计算样品的黏均分子量
式中：ＡＶ为两个突跃点消耗的ＮａＯＨ溶液体积之
差（ｍ１），Ｃ、舯。为氢氧化钠标准溶液浓度（ｍｏｌ／Ｌ），ｍ为
样品质量。 １．２．３重金属含量 按照中国药典（２００５版）标准方法测量。取样
放入３７℃水浴中保温，加入稀释抗凝兔血Fra Baidu bibliotek轻轻混 匀：继续在３７℃恒温水浴中保温６０ ｍｉｎ。水浴结束 后倒出管内液体，离心后吸取上清液置于紫外分光
ＮＩ斜－．物医学工程杂志２０１６年６月第３９卷第３期Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｔ—ｅｄ Ｅｎｇ．Ｊｕｎｅ ２０１６．Ｖ０１．３９．Ｎｏ．３
・论著・
蝇蛆壳提取壳聚糖的综合评价
垢德双闵昌敏 ３００１９１天津市医疗器械技术审评中，心
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１８１．２０１６．０３．Ｏｌ
式中：７７为特性黏度，相对黏度哺＝Ｔ／Ｔｏ，增比黏度 ７７，＝＇Ｏｒ－１，Ｃ为样品溶液的质量浓度（ｇ／ｍ１），７１为溶液 的流出时间，死为纯溶剂的流出时间： 用黏度方程ｍ】－７．９２ｘ１０‘５Ｍ１ ００计算黏均分子量。 １．２．２脱乙酰度测定
析综合评价，３～５级判为不合格。
１．２．５致敏实验
依据国家ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０标准第七章“最大剂量
【关键词】壳聚糖；蝇蛆；生物学评价
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｆｒｏｍ ｆｌｉｅｓ ｍａｇｇｏｔｓ ｓｈｅｌｌ Ｇｏｕ Ｄｅｓｈｕａｎｇ，Ｍｉｎ Ｃｈａｎｇｍｉｎ
Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｍｅｄｉｃ（ｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆＴｉａｎｊｉｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００１９１，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｕｅ
ｔｏ
ｔｈｅ ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ
ｉｔｓ
ｇｏｏｄ
ｗａｔｅｒ
ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ，ｆｉｌｍ—ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｌｙ，ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，
析，以Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义： ２结果 ２．１蝇蛆壳聚糖理化性质 蝇蛆壳聚糖的相对分子质量为２６６ ｋｕ，脱乙酰 度为７５％，重金属含量为６ｘ１０。６： ２．２细胞毒性实验 实验结果显示，阴性对照组与空白对照组的细
壳聚糖材料使红细胞发生凝集反应、促进血液
中血小板和其他补体系统激活，最终来实现伤口止
的不断提高，开发可降解、无刺激及无毒副作用的 止血材料是亟需解决的问题。目前常用的止血材料 可分为天然材料（如胶原、壳聚糖和海藻酸钠），合 成材料（如聚氨酯、聚乙烯醇）和复合材料（如将纤 维蛋白原、凝ｆＩＩＬ酶等复合在壳聚糖、氧化多糖等天
然材料上制成止血绷带等）【１Ｉ：近年来，壳聚糖因具
有止血效果好刚、生物相容性高Ｈ等特点，成为止血 材料的研究热点之一： 壳聚糖是天然获取的，无毒性的高分子多糖材
ｎ’
值：计算相对增殖率（ｒｅｌａｔｉｖｅ
ｍ］＝４ｒ／印ｌ－。２１ｎ而‰
相对增殖率（％）＝ｊｉ；耋雩荨器×ｌ。。％（３）
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｔａｔｅ，ＲＧＲ）
样品毒性分级标准：０级≥１００；１级，８０～９９；
２级，５０～７９；３级，３０～４９；４级，ｌ～２９；５级，０。样品合
格与，否标准：０级和１级判为合格，２级结合形态分
ｏｆ ｈｅａｖｙ
ｃｈｉｔｏｓａｎ ｗａｓ ７５％，ａｎｄ ｔｈｅ
ｍｅｔａｌ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １ ０～．Ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｅｉｔｙ ｌｅｖｅｌ
ｔｅｓｔ
ｗａｓ
ｅｖａｈｌａｔｅｄ
ａｔ
ｔｈｅ
ｗａｓ
ｆｉｒｓｔ
Ｉｅｖｅｌ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ＩＯＷ ｃｅｌＩ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｓｋｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，Ｔｈｅ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ