生物化学与分子生物学-第六章第四节 维生素C
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四、血浆中维生素C的测定
• 分光光度法：2,4-二硝基苯肼分光光度法 光度法样品前处理相对复杂，结果易受样 品基体干扰； 可测定脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸；
• 高效液相色谱法：准确，不能区分脱氢型和还 原性抗坏血酸，测总抗坏血酸。
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（一）2,4-二硝基苯肼分光光度法法
1. 原理：血浆沉淀蛋白后，还原性抗坏血酸被 Cu2+氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与 2,4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，经85% 硫酸脱水生成橘红色无水化合物，520nm比 色，外标法定量。测总抗坏血酸
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O HO O O O OH
H2N
NH
+
O N+
O-
O N+
O-
脱氢型抗坏血酸 2,4-二硝基苯肼
橘红色化合物， A520
•返回
2．样品处理和测定
• 沉淀蛋白 2.0mL血浆中加入2.0mL硫脲还原剂和 偏磷酸混合溶液沉淀蛋白。
–硫脲：防止抗坏血酸氧化，保证测定准确进行。 –不加硫脲至少将有 4 0 %左右的还原性抗坏血酸自
• 悬液浓度确证 用流式细胞仪计数、确证淋巴细 胞的浓度和纯度，使纯度>95%，悬液分散在含 有10%亚磷酸（pH1.8）和2mmol/L的EDTA缓冲 液中
还原性抗坏血酸
脱氢抗坏血酸
二酮古洛糖酸
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二、代谢和生物监测指标
1. 来源：膳食摄入（蔬菜和水果）
2. 代谢
维生素C
小肠吸收
经血液循环分布各组 织，肾上腺、垂体、 脑、眼、中性粒细胞 和淋巴细胞中浓度高
超出组织储存阈 值，以原型或脱 氢形式随尿排出
组织代谢，2,3二 酮古洛糖酸
长期大量服用Vc引起 草酸盐尿或尿道草 酸盐结石
草酸、木质酸 并随尿排出
因此，血清和组织细胞中Vc水平及负荷试验可评 价机体Vc营养状况。•返回
3. 生物监测指标 • 负荷试验：受试者口服5mgVc，收集此后
4h内全部尿液，测定其中Vc的含量
– 结果评价标准：排出Vc<5mg为缺乏，5~13 mg为合格，>13g充裕。
•返回
• 血清中Vc含量是体内Vc水平特异性指标，但在 反映缺乏状态方面并不灵敏：其含量与组织Vc 相关度弱，且含量受多种因素影响。
发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出，且至少有 1 0%的总抗坏血酸可能由于氧化分解从样品中消失而 无法测出。 –随着硫腺浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强 ，抗坏 血酸的氧化率逐渐降低 ，最大抗氧化率达 4 1.9%。
•返回
• 还原显色 离心，取上清液，加H2SO4、2,4-二硝 基苯肼、硫酸铜混合显色液，混匀，37℃，3.5h 。
– 即使在组织Vc严重耗竭的情况下血清Vc含量仍可 能维持正常水平；
– 影响因素：年龄、性别、昼夜节律等； – 脱氢抗坏血酸与还原型抗坏血酸的比值与糖尿病
等疾病有相关关系。
•返回
• 白细胞和淋巴细胞中Vc含量更准确反映组织 Vc的水平 – 白细胞中Vc：受感染、肿瘤、糖尿病、吸 烟等影响而降低； – 淋巴细胞中Vc：分布均匀是评价组织Vc 含量水平更理想的指标。
• 脱水 加85% H2SO41.5mL，放置15min测定A520
•返回
脱氢抗坏血酸测定：用还原剂硫脲取代显色剂中 的硫酸铜，其他过程与总抗坏血测定相同。 • 硫脲：保证在保温过程中还原型抗坏血酸不
自发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出。 • 显色剂中硫脲浓度需严格控制，因其影响脱
氢抗坏血酸和二硝基苯肼显色反应。 参考《2- 4 二硝基苯麟法联合测定血浆总抗坏 血酸、脱氢抗坏血酸及还原型抗坏血酸》
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三、样品的采集和保存
1. 血样：静脉血肝素抗凝， 3h内低温离心 分离血浆和血细胞
• 血浆：-70 ℃冷冻，存放不超过8天。 • 测淋巴细胞中Vc：采血后2h内离心制备淋巴
细胞悬液
2. 尿样：随机尿或负荷试验4h尿，稀释尿 液加草酸或磷酸，4 ℃保存，3h内测定。
• Vc易分解，在酸性溶液中稳定
•返回
4. 注意事项
（1）维生素C的保留时间<5min，该条件下尿酸也 有色谱峰，其保留时间约为10min，为避免干扰 ，每一样品的分析总时间应>10min。
（2）抗坏血酸易在储存和检测过程中被氧化，-70 ℃冷冻方式抗氧化能力较强，可保存抗坏血酸9天
（3）样品处理及放置过程尽量避光在冰浴中操作 ，防止维生素C氧化。
•返回
五、高效液相色谱法测定淋巴细胞中 总抗坏血酸
1. 原理：分离血中的淋巴细胞，提取维生素C制 成淋巴细胞悬液，C18色谱柱分离，紫外检测 器检测，保留时间定性，工作曲线法定量。 检出限1.25µg/108淋巴细胞； 线性范围1.0~200µg/108淋巴细胞
•返回
2．样品处理和测定
• 制备淋巴细胞悬液 pH7.4PBS缓冲液洗涤分离出 的淋巴细胞3次，用含1%抗生素（100U青霉素 和100ug/mL链霉素）的PBS缓冲液制成 1×108/mL淋巴细胞悬液。
•返回
（二）高效液相色谱法 测定血浆中维生素C
1. 原理：血浆样品经稀释后，偏磷酸沉淀蛋白 离心后取上清液，C18色谱柱分离，紫外检 测器245nm检测，保留时间定性，峰面积外 标法定量。
2. 检出限 1.0µmol/L；线性范围1.0~200µmol/L
•返回
2．样品处理和测定 30 µL血浆，加入30 µL水及60 µL偏磷
酸，混匀后4 ℃离心，取上清液．仪器参考条件P83
• C18色谱柱 （250mm×4.6mm, 5µm） • 流动相 0.2mol/L，pH3.0，PBS，含
2mmol/LEDTA – EDTA：掩蔽Fe3+，防止其氧化抗坏血酸 – pH3.0，维生素C稳定存在
• 流速 1.0mL/min。 • 柱温 22 ℃；紫外检测器 波长245nm。
第四节 维生素C
一、理化特性
维生素C（vitamin C，Vc）又称抗坏血酸（ascorbic acid)，酸性多羟基化合物， L、D两种旋光异构体。
6
54
1
3
2
维生素C
有酸性：含烯二醇基，C3位OH由 于受共轭效应的影响，酸性较强； C2位OH由于形成分子内氢键，酸 性极弱
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耐酸，光、热、碱、氧化剂条件下均可使Vc氧化失去活性， 氧化产物为脱氢抗坏血酸（有生理活性）和二酮古洛糖酸。
四、血浆中维生素C的测定
• 分光光度法：2,4-二硝基苯肼分光光度法 光度法样品前处理相对复杂，结果易受样 品基体干扰； 可测定脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸；
• 高效液相色谱法：准确，不能区分脱氢型和还 原性抗坏血酸，测总抗坏血酸。
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（一）2,4-二硝基苯肼分光光度法法
1. 原理：血浆沉淀蛋白后，还原性抗坏血酸被 Cu2+氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与 2,4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，经85% 硫酸脱水生成橘红色无水化合物，520nm比 色，外标法定量。测总抗坏血酸
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O HO O O O OH
H2N
NH
+
O N+
O-
O N+
O-
脱氢型抗坏血酸 2,4-二硝基苯肼
橘红色化合物， A520
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2．样品处理和测定
• 沉淀蛋白 2.0mL血浆中加入2.0mL硫脲还原剂和 偏磷酸混合溶液沉淀蛋白。
–硫脲：防止抗坏血酸氧化，保证测定准确进行。 –不加硫脲至少将有 4 0 %左右的还原性抗坏血酸自
• 悬液浓度确证 用流式细胞仪计数、确证淋巴细 胞的浓度和纯度，使纯度>95%，悬液分散在含 有10%亚磷酸（pH1.8）和2mmol/L的EDTA缓冲 液中
还原性抗坏血酸
脱氢抗坏血酸
二酮古洛糖酸
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二、代谢和生物监测指标
1. 来源：膳食摄入（蔬菜和水果）
2. 代谢
维生素C
小肠吸收
经血液循环分布各组 织，肾上腺、垂体、 脑、眼、中性粒细胞 和淋巴细胞中浓度高
超出组织储存阈 值，以原型或脱 氢形式随尿排出
组织代谢，2,3二 酮古洛糖酸
长期大量服用Vc引起 草酸盐尿或尿道草 酸盐结石
草酸、木质酸 并随尿排出
因此，血清和组织细胞中Vc水平及负荷试验可评 价机体Vc营养状况。•返回
3. 生物监测指标 • 负荷试验：受试者口服5mgVc，收集此后
4h内全部尿液，测定其中Vc的含量
– 结果评价标准：排出Vc<5mg为缺乏，5~13 mg为合格，>13g充裕。
•返回
• 血清中Vc含量是体内Vc水平特异性指标，但在 反映缺乏状态方面并不灵敏：其含量与组织Vc 相关度弱，且含量受多种因素影响。
发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出，且至少有 1 0%的总抗坏血酸可能由于氧化分解从样品中消失而 无法测出。 –随着硫腺浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强 ，抗坏 血酸的氧化率逐渐降低 ，最大抗氧化率达 4 1.9%。
•返回
• 还原显色 离心，取上清液，加H2SO4、2,4-二硝 基苯肼、硫酸铜混合显色液，混匀，37℃，3.5h 。
– 即使在组织Vc严重耗竭的情况下血清Vc含量仍可 能维持正常水平；
– 影响因素：年龄、性别、昼夜节律等； – 脱氢抗坏血酸与还原型抗坏血酸的比值与糖尿病
等疾病有相关关系。
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• 白细胞和淋巴细胞中Vc含量更准确反映组织 Vc的水平 – 白细胞中Vc：受感染、肿瘤、糖尿病、吸 烟等影响而降低； – 淋巴细胞中Vc：分布均匀是评价组织Vc 含量水平更理想的指标。
• 脱水 加85% H2SO41.5mL，放置15min测定A520
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脱氢抗坏血酸测定：用还原剂硫脲取代显色剂中 的硫酸铜，其他过程与总抗坏血测定相同。 • 硫脲：保证在保温过程中还原型抗坏血酸不
自发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出。 • 显色剂中硫脲浓度需严格控制，因其影响脱
氢抗坏血酸和二硝基苯肼显色反应。 参考《2- 4 二硝基苯麟法联合测定血浆总抗坏 血酸、脱氢抗坏血酸及还原型抗坏血酸》
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三、样品的采集和保存
1. 血样：静脉血肝素抗凝， 3h内低温离心 分离血浆和血细胞
• 血浆：-70 ℃冷冻，存放不超过8天。 • 测淋巴细胞中Vc：采血后2h内离心制备淋巴
细胞悬液
2. 尿样：随机尿或负荷试验4h尿，稀释尿 液加草酸或磷酸，4 ℃保存，3h内测定。
• Vc易分解，在酸性溶液中稳定
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4. 注意事项
（1）维生素C的保留时间<5min，该条件下尿酸也 有色谱峰，其保留时间约为10min，为避免干扰 ，每一样品的分析总时间应>10min。
（2）抗坏血酸易在储存和检测过程中被氧化，-70 ℃冷冻方式抗氧化能力较强，可保存抗坏血酸9天
（3）样品处理及放置过程尽量避光在冰浴中操作 ，防止维生素C氧化。
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五、高效液相色谱法测定淋巴细胞中 总抗坏血酸
1. 原理：分离血中的淋巴细胞，提取维生素C制 成淋巴细胞悬液，C18色谱柱分离，紫外检测 器检测，保留时间定性，工作曲线法定量。 检出限1.25µg/108淋巴细胞； 线性范围1.0~200µg/108淋巴细胞
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2．样品处理和测定
• 制备淋巴细胞悬液 pH7.4PBS缓冲液洗涤分离出 的淋巴细胞3次，用含1%抗生素（100U青霉素 和100ug/mL链霉素）的PBS缓冲液制成 1×108/mL淋巴细胞悬液。
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（二）高效液相色谱法 测定血浆中维生素C
1. 原理：血浆样品经稀释后，偏磷酸沉淀蛋白 离心后取上清液，C18色谱柱分离，紫外检 测器245nm检测，保留时间定性，峰面积外 标法定量。
2. 检出限 1.0µmol/L；线性范围1.0~200µmol/L
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2．样品处理和测定 30 µL血浆，加入30 µL水及60 µL偏磷
酸，混匀后4 ℃离心，取上清液．仪器参考条件P83
• C18色谱柱 （250mm×4.6mm, 5µm） • 流动相 0.2mol/L，pH3.0，PBS，含
2mmol/LEDTA – EDTA：掩蔽Fe3+，防止其氧化抗坏血酸 – pH3.0，维生素C稳定存在
• 流速 1.0mL/min。 • 柱温 22 ℃；紫外检测器 波长245nm。
第四节 维生素C
一、理化特性
维生素C（vitamin C，Vc）又称抗坏血酸（ascorbic acid)，酸性多羟基化合物， L、D两种旋光异构体。
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维生素C
有酸性：含烯二醇基，C3位OH由 于受共轭效应的影响，酸性较强； C2位OH由于形成分子内氢键，酸 性极弱
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耐酸，光、热、碱、氧化剂条件下均可使Vc氧化失去活性， 氧化产物为脱氢抗坏血酸（有生理活性）和二酮古洛糖酸。