生物化学与分子生物学-第六章第四节 维生素C
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脱氢型抗坏血酸 2,4-二硝基苯肼
橘红色化合物， A520
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2．样品处理和测定
• 沉淀蛋白 2.0mL血浆中加入2.0mL硫脲还原剂和 偏磷酸混合溶液沉淀蛋白。
–硫脲：防止抗坏血酸氧化，保证测定准确进行。 –不加硫脲至少将有 4 0 %左右的还原性抗坏血酸自
•返回
四、血浆中维生素C的测定
• 分光光度法：2,4-二硝基苯肼分光光度法 光度法样品前处理相对复杂，结果易受样 品基体干扰； 可测定脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸；
• 高效液相色谱法：准确，不能区分脱氢型和还 原性抗坏血酸，测总抗坏血酸。
•返回
（一）2,4-二硝基苯肼分光光度法法
1. 原理：血浆沉淀蛋白后，还原性抗坏血酸被 Cu2+氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与 2,4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，经85% 硫酸脱水生成橘红色无水化合物，520nm比 色，外标法定量。测总抗坏血酸
– 即使在组织Vc严重耗竭的情况下血清Vc含量仍可 能维持正常水平；
– 影响因素：年龄、性别、昼夜节律等； – 脱氢抗坏血酸与还原型抗坏血酸的比值与糖尿病
等疾病有相关关系。
•返回
• 白细胞和淋巴细胞中Vc含量更准确反映组织 Vc的水平 – 白细胞中Vc：受感染、肿瘤、糖尿病、吸 烟等影响而降低； – 淋巴细胞中Vc：分布均匀是评价组织Vc 含量水平更理想的指标。
还原性抗坏血酸
脱氢抗坏血酸
二酮古洛糖酸
•返回
二、代谢和生物监测指标
1. 来源：膳食摄入（蔬菜和水果）
2. 代谢
维生素C
小肠吸收
经血液循环分布各组 织，肾上腺、垂体、 脑、眼、中性粒细胞 和淋巴细胞中浓度高
超出组织储存阈 值，以原型或脱 氢形式随尿排出
组织代谢，2,3二 酮古洛糖酸
长期大量服用Vc引起 草酸盐尿或尿道草 酸盐结石
•返回
（二）高效液相色谱法 测定血浆中维生素C
1. 原理：血浆样品经稀释后，偏磷酸沉淀蛋白 离心后取上清液，C18色谱柱分离，紫外检 测器245nm检测，保留时间定性，峰面积外 标法定量。
2. 检出限 1.0µmol/L；线性范围1.0~200µmol/L
•返回
2．样品处理和测定 30 µL血浆，加入30 µL水及60 µL偏磷
•返回
4. 注意事项
（1）维生素C的保留时间<5min，该条件下尿酸也 有色谱峰，其保留时间约为10min，为避免干扰 ，每一样品的分析总时间应>10min。
（2）抗坏血酸易在储存和检测过程中被氧化，-70 ℃冷冻方式抗氧化能力较强，可保存抗坏血酸9天
（3）样品处理及放置过程尽量避光在冰浴中操作 ，防止维生素C氧化。
• 脱水 加85% H2SO41.5mL，放置15min测定A520
•返回
脱氢抗坏血酸测定：用还原剂硫脲取代显色剂中 的硫酸铜，其他过程与总抗坏血测定相同。 • 硫脲：保证在保温过程中还原型抗坏血酸不
自发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出。 • 显色剂中硫脲浓度需严格控制，因其影响脱
氢抗坏血酸和二硝基苯肼显色反应。 参考《2- 4 二硝基苯麟法联合测定血浆总抗坏 血酸、脱氢抗坏血酸及还原型抗坏血酸》
酸，混匀后4 ℃离心，取上清液4 ℃保存 ，待进样。
•返回
3．仪器参考条件P83
• C18色谱柱 （250mm×4.6mm, 5µm） • 流动相 0.2mol/L，pH3.0，PBS，含
2mmol/LEDTA – EDTA：掩蔽Fe3+，防止其氧化抗坏血酸 – pH3.0，维生素C稳定存在
• 流速 1.0mL/min。 • 柱温 22 ℃；紫外检测器 波长245nm。
第四节 维生素C
一、理化特性
维生素C（vitamin C，Vc）又称抗坏血酸（ascorbic acid)，酸性多羟基化合物， L、D两种旋光异构体。
6
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维生素C
有酸性：含烯二醇基，C3位OH由 于受共轭效应的影响，酸性较强； C2位OH由于形成分子内氢键，酸 性极弱
•返回
耐酸，光、热、碱、氧化剂条件下均可使Vc氧化失去活性， 氧化产物为脱氢抗坏血酸（有生理活性）和二酮古洛糖酸。
• 悬液浓度确证 用流式细胞仪计数、确证淋巴细 胞的浓度和纯度，使纯度>95%，悬液分散在含 有10%亚磷酸（pH1.8）和2mmol/L的EDTA缓冲 液中
•返回
三、样品的源自文库集和保存
1. 血样：静脉血肝素抗凝， 3h内低温离心 分离血浆和血细胞
• 血浆：-70 ℃冷冻，存放不超过8天。 • 测淋巴细胞中Vc：采血后2h内离心制备淋巴
细胞悬液
2. 尿样：随机尿或负荷试验4h尿，稀释尿 液加草酸或磷酸，4 ℃保存，3h内测定。
• Vc易分解，在酸性溶液中稳定
•返回
五、高效液相色谱法测定淋巴细胞中 总抗坏血酸
1. 原理：分离血中的淋巴细胞，提取维生素C制 成淋巴细胞悬液，C18色谱柱分离，紫外检测 器检测，保留时间定性，工作曲线法定量。 检出限1.25µg/108淋巴细胞； 线性范围1.0~200µg/108淋巴细胞
•返回
2．样品处理和测定
• 制备淋巴细胞悬液 pH7.4PBS缓冲液洗涤分离出 的淋巴细胞3次，用含1%抗生素（100U青霉素 和100ug/mL链霉素）的PBS缓冲液制成 1×108/mL淋巴细胞悬液。
发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出，且至少有 1 0%的总抗坏血酸可能由于氧化分解从样品中消失而 无法测出。 –随着硫腺浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强 ，抗坏 血酸的氧化率逐渐降低 ，最大抗氧化率达 4 1.9%。
•返回
• 还原显色 离心，取上清液，加H2SO4、2,4-二硝 基苯肼、硫酸铜混合显色液，混匀，37℃，3.5h 。
草酸、木质酸 并随尿排出
因此，血清和组织细胞中Vc水平及负荷试验可评 价机体Vc营养状况。•返回
3. 生物监测指标 • 负荷试验：受试者口服5mgVc，收集此后
4h内全部尿液，测定其中Vc的含量
– 结果评价标准：排出Vc<5mg为缺乏，5~13 mg为合格，>13g充裕。
•返回
• 血清中Vc含量是体内Vc水平特异性指标，但在 反映缺乏状态方面并不灵敏：其含量与组织Vc 相关度弱，且含量受多种因素影响。
O HO O O O OH
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O N+
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O N+
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脱氢型抗坏血酸 2,4-二硝基苯肼
橘红色化合物， A520
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2．样品处理和测定
• 沉淀蛋白 2.0mL血浆中加入2.0mL硫脲还原剂和 偏磷酸混合溶液沉淀蛋白。
–硫脲：防止抗坏血酸氧化，保证测定准确进行。 –不加硫脲至少将有 4 0 %左右的还原性抗坏血酸自
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四、血浆中维生素C的测定
• 分光光度法：2,4-二硝基苯肼分光光度法 光度法样品前处理相对复杂，结果易受样 品基体干扰； 可测定脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸；
• 高效液相色谱法：准确，不能区分脱氢型和还 原性抗坏血酸，测总抗坏血酸。
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（一）2,4-二硝基苯肼分光光度法法
1. 原理：血浆沉淀蛋白后，还原性抗坏血酸被 Cu2+氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸与 2,4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，经85% 硫酸脱水生成橘红色无水化合物，520nm比 色，外标法定量。测总抗坏血酸
– 即使在组织Vc严重耗竭的情况下血清Vc含量仍可 能维持正常水平；
– 影响因素：年龄、性别、昼夜节律等； – 脱氢抗坏血酸与还原型抗坏血酸的比值与糖尿病
等疾病有相关关系。
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• 白细胞和淋巴细胞中Vc含量更准确反映组织 Vc的水平 – 白细胞中Vc：受感染、肿瘤、糖尿病、吸 烟等影响而降低； – 淋巴细胞中Vc：分布均匀是评价组织Vc 含量水平更理想的指标。
还原性抗坏血酸
脱氢抗坏血酸
二酮古洛糖酸
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二、代谢和生物监测指标
1. 来源：膳食摄入（蔬菜和水果）
2. 代谢
维生素C
小肠吸收
经血液循环分布各组 织，肾上腺、垂体、 脑、眼、中性粒细胞 和淋巴细胞中浓度高
超出组织储存阈 值，以原型或脱 氢形式随尿排出
组织代谢，2,3二 酮古洛糖酸
长期大量服用Vc引起 草酸盐尿或尿道草 酸盐结石
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（二）高效液相色谱法 测定血浆中维生素C
1. 原理：血浆样品经稀释后，偏磷酸沉淀蛋白 离心后取上清液，C18色谱柱分离，紫外检 测器245nm检测，保留时间定性，峰面积外 标法定量。
2. 检出限 1.0µmol/L；线性范围1.0~200µmol/L
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2．样品处理和测定 30 µL血浆，加入30 µL水及60 µL偏磷
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4. 注意事项
（1）维生素C的保留时间<5min，该条件下尿酸也 有色谱峰，其保留时间约为10min，为避免干扰 ，每一样品的分析总时间应>10min。
（2）抗坏血酸易在储存和检测过程中被氧化，-70 ℃冷冻方式抗氧化能力较强，可保存抗坏血酸9天
（3）样品处理及放置过程尽量避光在冰浴中操作 ，防止维生素C氧化。
• 脱水 加85% H2SO41.5mL，放置15min测定A520
•返回
脱氢抗坏血酸测定：用还原剂硫脲取代显色剂中 的硫酸铜，其他过程与总抗坏血测定相同。 • 硫脲：保证在保温过程中还原型抗坏血酸不
自发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出。 • 显色剂中硫脲浓度需严格控制，因其影响脱
氢抗坏血酸和二硝基苯肼显色反应。 参考《2- 4 二硝基苯麟法联合测定血浆总抗坏 血酸、脱氢抗坏血酸及还原型抗坏血酸》
酸，混匀后4 ℃离心，取上清液4 ℃保存 ，待进样。
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3．仪器参考条件P83
• C18色谱柱 （250mm×4.6mm, 5µm） • 流动相 0.2mol/L，pH3.0，PBS，含
2mmol/LEDTA – EDTA：掩蔽Fe3+，防止其氧化抗坏血酸 – pH3.0，维生素C稳定存在
• 流速 1.0mL/min。 • 柱温 22 ℃；紫外检测器 波长245nm。
第四节 维生素C
一、理化特性
维生素C（vitamin C，Vc）又称抗坏血酸（ascorbic acid)，酸性多羟基化合物， L、D两种旋光异构体。
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维生素C
有酸性：含烯二醇基，C3位OH由 于受共轭效应的影响，酸性较强； C2位OH由于形成分子内氢键，酸 性极弱
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耐酸，光、热、碱、氧化剂条件下均可使Vc氧化失去活性， 氧化产物为脱氢抗坏血酸（有生理活性）和二酮古洛糖酸。
• 悬液浓度确证 用流式细胞仪计数、确证淋巴细 胞的浓度和纯度，使纯度>95%，悬液分散在含 有10%亚磷酸（pH1.8）和2mmol/L的EDTA缓冲 液中
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三、样品的源自文库集和保存
1. 血样：静脉血肝素抗凝， 3h内低温离心 分离血浆和血细胞
• 血浆：-70 ℃冷冻，存放不超过8天。 • 测淋巴细胞中Vc：采血后2h内离心制备淋巴
细胞悬液
2. 尿样：随机尿或负荷试验4h尿，稀释尿 液加草酸或磷酸，4 ℃保存，3h内测定。
• Vc易分解，在酸性溶液中稳定
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五、高效液相色谱法测定淋巴细胞中 总抗坏血酸
1. 原理：分离血中的淋巴细胞，提取维生素C制 成淋巴细胞悬液，C18色谱柱分离，紫外检测 器检测，保留时间定性，工作曲线法定量。 检出限1.25µg/108淋巴细胞； 线性范围1.0~200µg/108淋巴细胞
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2．样品处理和测定
• 制备淋巴细胞悬液 pH7.4PBS缓冲液洗涤分离出 的淋巴细胞3次，用含1%抗生素（100U青霉素 和100ug/mL链霉素）的PBS缓冲液制成 1×108/mL淋巴细胞悬液。
发氧化而被作为脱氢型抗坏血酸测出，且至少有 1 0%的总抗坏血酸可能由于氧化分解从样品中消失而 无法测出。 –随着硫腺浓度的增加，抗氧化能力逐渐增强 ，抗坏 血酸的氧化率逐渐降低 ，最大抗氧化率达 4 1.9%。
•返回
• 还原显色 离心，取上清液，加H2SO4、2,4-二硝 基苯肼、硫酸铜混合显色液，混匀，37℃，3.5h 。
草酸、木质酸 并随尿排出
因此，血清和组织细胞中Vc水平及负荷试验可评 价机体Vc营养状况。•返回
3. 生物监测指标 • 负荷试验：受试者口服5mgVc，收集此后
4h内全部尿液，测定其中Vc的含量
– 结果评价标准：排出Vc<5mg为缺乏，5~13 mg为合格，>13g充裕。
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• 血清中Vc含量是体内Vc水平特异性指标，但在 反映缺乏状态方面并不灵敏：其含量与组织Vc 相关度弱，且含量受多种因素影响。