实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验八、聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳
点样：取血清100µl，40%蔗糖100µl，溴酚蓝100µl于 白磁盘中混匀，上样15µl。 电泳：浓缩胶时电压80V（约40min）,分离胶160V(约 3h)。 待溴酚蓝快到管口时停止电泳，倒出缓冲液。 取胶：带长针头的注射器吸水，沿管壁慢慢插入同 时注水，慢慢转动，胶会慢慢滑出或用洗耳球吹出 于试管中。不要用力过猛，且试管应先放些水，以 防止胶断裂。 染色：将试管里水倒掉，加入染色液，染色40min。 脱色：倒出染色液，加入脱色液，更换3次脱色液每次 脱色10min，然后隔一天换一次脱色液，直到蛋白带 清晰为止。
电荷效应
当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后，甘氨酸离 子的电泳迁移率很快赶上蛋白质，高电势梯度也随 之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各 种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场 中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白 质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
分子筛效应
由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不 同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同， 故因迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样 品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小 分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分 子大小顺序排列成相应的区带。
结果
观察管状胶条染色条带。
注意事项
1. 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性 ， 尽 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺具有神经毒性， 量避免吸入和接触。 量避免吸入和接触。 2.考马斯亮蓝染色、脱色，染液回收。 考马斯亮蓝染色、脱色，染液回收。 3.电泳注意正负极。 电泳注意正负极。
聚合反应是由溶于水的AP产生自由基S2O8-→SO4-自 由基SO4-，催化TEMED使之成为带不成对电子的活化 分子，活化的TEMED可随机与Acr分子或Bis分子结合 并转移自由基使之活化。被活化的Acr可以同样的方 式结合另一分子Acr并转移自由基使其活化，如果反 应物中只有Acr分子，按反应机理可以使所有Acr分 子结合成长链，使其末端的Acr分子始终带有被转移 的自由基活性，但仅Acr分子的多聚体只能形成长链， 尽管呈黏稠状，但不能形成带孔的凝胶。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶
两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）
作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。
合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法
化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED）
实验结果的分析
相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
分 布(%)
清蛋白
6.9
6.1
55
1-球蛋白 2.1~30.8 7.3
5.0
2-球蛋白 4.1~72.5 6.8
9.0
-球蛋白
1.2~25 7.6
13.0
-球蛋白
15.6
8.0
11.0
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白 清蛋白 前清蛋白
光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED）
聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度
凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100%
a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂 （一般a:b=30左右，根据T可适当调整））
蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）
电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场 的作用下在特定的介质中向与其电荷性 质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异
电荷性质 电荷数量
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10 脆硬乳白交联度：a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
03
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高分辨率和分离范围广的优点，广泛应用于蛋 白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
03
实验材料与设备
实验材料
01
02
03
04
05
血清样品
丙烯酰胺和N,N'- 分离胶和浓缩胶 甲…
电泳缓冲液
Байду номын сангаас
染色液和脱色液
用于电泳分离的血清样品 ，应保证新鲜、无菌，且 无杂质。
用于制备凝胶的原材料， 应保证纯度高、无杂质。
电泳仪
用于电泳分离的设备，应保证 性能稳定、精度高。
电源
用于提供电泳仪所需的电流和 电压，应保证安全、稳定。
电子天平
用于称量实验材料，应保证精 度高、稳定性好。
04
实验步骤与操作
实验前的准备
准备试剂
准备凝胶板
确保所有试剂都已正确配制，包括丙烯酰 胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、 Tris-HCl、甘氨酸、过硫酸铵等。
用于电泳分离的不同浓度 的凝胶，应保证性能稳定 、无杂质。
用于维持电泳过程中的pH 值和离子强度，应保证质 量稳定、无杂质。
用于染色和脱色分离后的 凝胶，应保证无毒、无害 、无污染。
实验设备
垂直电泳槽
用于放置凝胶和电泳缓冲液的 容器，应保证密封性好、不易 变形。
离心机
用于制备血清样品，应保证性 能稳定、易于操作。
结合其他技术
结合质谱分析、免疫印迹等其他技术，对分离出的蛋白质进行定性和 定量分析，以更深入地了解蛋白质的性质和功能。
应用于临床研究
进一步研究血清中特定蛋白质与疾病之间的关系，探索其在临床诊断 和疾病监测中的应用价值。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
【课件】实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt
2.2 电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
1.电荷差异 (1)电荷性质 (2)电荷数量
2.分子差异 (1)分子大小 (2)分子形状
2.3 电泳分离蛋白质的原理
1. 蛋白质两性解离与等电点
若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同， 此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（PI）。
电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为： （1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构； （2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 （P138）
1.1 分离胶的配制
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每组总 体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）
封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可进行 下一步操作）
注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验八 表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续SDS-PAGE：
①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
产生三种物理效应：
①电荷效应： ②分子筛效应: ③浓缩效应:
浓缩胶的作用机理
• 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较 大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的 迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓 缩胶选 TRIS/HCl 缓冲液，电极液选 TRIS/ 甘氨酸。电 泳开始后， HCl 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的 甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移 动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中 。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在 后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比， 因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅 速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面 附近，浓缩成一中间层。
思考题：
•1、影响电泳的主要因素有哪些？ •2、简答不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个 不连续，及三种物理效应。
6．样品处理：向各管中加入80 μl H2O，悬浮细胞后，加入20 μl 5X上洋缓冲 液，混匀后，放金属浴5-10 min,取出后12000rpm离心10 min.
7．上样 取10μl诱导诱导后的和未诱导的样品按顺序依次加入样品池中，并 加入10μl标准分子量蛋白标准品作对照。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加 样孔中，也可加在离边的第2道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。 8. 电泳 在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下， 电泳时，积层胶电压60V电泳约20min，分离胶电压120V电泳约60min ，电泳 至溴酚兰刚出电泳槽下端的时候停止 9. 关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用刀片撬开两玻 璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分切掉不要，分离胶放到玻璃平皿中染色。 10. 染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色过夜（摇床上缓慢振荡）， 然后倾去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝 胶上和玻璃平皿中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），每1小时 后换一次脱色液，振荡脱色（共需3次）。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰， 背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
一、实验目的 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 2．了解该电泳的特点及适用范围。 ．了解该电泳的胺凝胶电泳的三种效应： 讲解聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应： 1、浓缩效应。 1、浓缩效应。 2、电荷效应。 、电荷效应。 3、分子筛效应。 、分子筛效应。
实验思考
1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 2、由本次实验结果解释醋纤薄膜电泳分离后 、 各条区带清晰度的差别。 各条区带清晰度的差别。
四、实验材料
1．圆盘电泳槽。 ．圆盘电泳槽。 2．电泳仪。 ．电泳仪。 3．玻璃管（10×0.6 cm）。 ．玻璃管（ × ）。 4．50l微量注射器、5ml注射器。 微量注射器、 注射器。 ． 微量注射器 注射器 5．10 cm长的局麻针头，10号针头。 长的局麻针头， 号针头 号针头。 ． 长的局麻针头 6．试剂 ．
三、实验原理
本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。 本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。电 荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效 电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。 应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好， 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成5～ 个组分 个组分， 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成 ～7个组分， 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12～ 个 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出 ～30个 组分。 组分
五、实验方法
（一）凝胶柱的制备 1．凝胶玻璃管的准备 ． 2．分离胶的制备 ． 3．浓缩胶的制备 ． 4. 装柱
(二)加样 二 加样 (三)电泳 三 电泳 (四)剥胶 四 剥胶 (五)固定和染色 五 固定和染色 (六)漂洗 六 漂洗
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
实验八、聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
根据电泳槽的容积，配制适量的 电极缓冲液，用于维持电泳过程 中的稳定电场。
安装凝胶板和电极
将凝胶溶液倒入电泳槽中，用吸水纸吸干凝胶板的多余水分。 将凝胶板放入电泳槽中，确保凝胶板与电极接触良好。
加样和电泳
用移液管将样品加入样品槽中，注意 不要产生气泡。
连接电源，开始电泳，根据实验需求 调整电流和电压。
缓冲液
选择合适的缓冲液对于 保持电泳过程中的pH 稳定至关重要，从而确
保分离效果。
温度
温度对电泳的影响较小 ，但过高的温度可能导 致凝胶变形，影响分离
效果。
03
实验步骤
准备实验材料和器具
1 2
聚丙烯酰胺凝胶粉
用于制备凝胶溶液，根据实验需求选择合适的规 格和浓度。
电泳槽
用于电泳的容器，需选择合适的尺寸和规格。
染色与脱色
电泳结束后，将凝胶取出，进 行染色和脱色处理，使蛋白质
条带显现。
了解聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的应用
蛋白质分离
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳常用 于蛋白质的分离和纯化，可分离 出不同分子量和电荷的蛋白质。
疾病诊断
通过聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技 术对生物样品中的蛋白质进行分析， 有助于疾病的早期诊断和监测。
电泳分离效果的评价
分辨率评价
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的分辨率取决于凝胶的孔径和浓度，以及电泳条件。评价电泳分离效果时 ，应关注分辨率的高低。
重复性评价
为了确保实验结果的可靠性，需要评价电泳的重复性。可以通过多次重复实验，观察电泳谱带的重现 性来评价。
实验数据的处理和结果分析
数据整理
将电泳谱带的位置、宽度、亮度等信息进行整理，以便进一步分析。
结果分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析在很多地方看到大家都在讨论关于聚丙烯酰胺凝胶电泳的知识。
看了好多观点以后，不如自己做一个实验来分析。
更何况对于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析必须要通过实验来验证观点。
下面就是关于聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析：明确实验目的：1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。
3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。
了解实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。
用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。
此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。
由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-9～10-12g样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。
它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。
不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是使用最广泛的凝胶电泳。
不连续是指电泳的pH值不连续（样品浓缩胶缓冲液pH 6.8, 电极缓冲液pH 8.3, 分离胶pH 8.8）、凝胶不连续（一般分成样品浓缩胶和样品分离胶两层）。
变性是指样品蛋白经SDS和巯基乙醇作用后，所有蛋白质都解聚成为其构成亚基，并且都带上负电荷，形状都近似于长椭园棒状。
这种SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与园棒的长度也就是蛋白质的分子量有关。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于灌制凝胶时聚丙烯酰胺的浓度和交联度，二者决定凝胶分子筛的孔径大小，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。
二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。
通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。
三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。
四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。
五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。
根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。
通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。
六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。
本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因如下：
1. 聚丙烯酰胺凝胶具有均一的孔隙结构，能够将待分离的DNA、RNA或蛋白质分子按大小分离。
这种凝胶的孔隙大小和形状可以通过调整聚合物交联程度、孔隙添加剂以及电场强度等方式进行调节，从而实现高精度和高分辨率的分离。
2. 不连续的凝胶结构可以避免样品分子在运动过程中的扩散和混合，从而使分离更为准确和精确。
与连续凝胶电泳相比，不连续凝胶电泳可以获得更高的分离效率，特别是在分离小分子或高度相似的分子时。
3. 不连续凝胶电泳具有更高的网络稳定性和耐久性，可以长期稳定地运行，从而确保分离结果的重复性和可靠性。
此外，不连续凝胶电泳还可以进行多重分离，即将同一个横向凝胶纵向切成若干块，每块分别进行不同物质的电泳分离，这样一次实验就可以达到多种物质的分离效果。
因此，不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，可以用于高精度和高分辨率的DNA、RNA或蛋白质分离，是分子生物学、生物化学和医学等领域的重要实验技术。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验原理
电泳：带电粒子在电场中泳动的现象。
泳动的速度取决于粒子带电的多少、 分子的大小和形状
聚丙烯酰胺凝胶电泳：被电泳的物质
在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分出的组分形 成不连续的圆盘形区带。 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有电泳和分子 筛的双重作用。
实验原理
不连续体系：凝胶孔径大小不连续
→ 甩去封顶掖
上电泳槽
电极缓冲液 样品 浓缩胶 1cm 绿色胶塞 分离胶 7cm 电极缓冲液
下电泳槽
操作步骤
二、安装凝胶管
1. 去除白胶塞，将凝胶小玻管依次垂直安装 在电泳仪上槽小孔内, 塞紧绿胶塞。 注意：不能漏水，上槽先加少许缓冲液M检漏
2. 电泳仪下槽加电极缓冲液，应浸没下槽 中的电极及小玻管的下端
红B黑
通直流电. 恒流
3mA/管，3×12管=36mA 3×24管=72mA 电压180-400v（自动，不用调）
600v 100mA 推进 推进 恒流 不推 开 推进 调整
调整mA →36 mA/72mA
电泳时间1小时 → 绿胶塞下出现染料蓝色带 → 关电泳仪开关 →拔电源插头 →取下电极线 →取玻管→ 倒去上槽中的缓冲液
2 4 4 10 mL
沿玻管壁加至绿胶塞顶部高度→ 沿管壁滴入封顶液X 3滴 →15-20分成胶
→ 甩去封顶掖
操作步骤
2. 浓缩胶：核黄素-TEMED系统，光聚合 依次加入 B:D:E:F 8mL →轻搅匀 → 1cm/管
1 2 1 4 mL
→ 封顶液X 3滴 → 垂直放入圆盘电泳仪孔中
→ 紫外线照射5-10分成胶
胶蓝色、蛋白质蓝黑色带
结果分析
一、 浓缩胶中的浓缩效应 二、 分离胶中的蛋白质分离
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[实验目的]学习和掌握不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和测定蛋白质相对分子质量的基本原理和实验技术。
[实验原理]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂β-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
[器材与试剂]一、器材垂直板电泳槽、电泳仪（直流稳压）、电子天平、移液器、烧杯、量筒、离心管、灭菌tip头、大培养皿、漏斗、滤纸、镊子、玻棒、电炉二、试剂1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液3、10% SDS溶液4、10%过硫酸铵：新鲜配制5、TEMED溶液：4℃保存6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl （pH8.0）缓冲液。
8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
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四、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.2 聚丙烯酰胺凝胶的特性
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中
不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，
通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳 等有更高的分辨率。
3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类
1. 根据其有无浓缩效应，分为： （1）连续系统——连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带
电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为： （1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构； （2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子
注意事项：
1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。 2、配胶后立即灌胶（用滴管） 3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于管中。 4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于电泳槽上 （竖直，防漏） 5、加电极缓冲液（注意液面）
1.3 安装、加样、电泳
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、 不漏水、除气泡）
2. 溶液pH与蛋白质等电点决定蛋白质电荷性质与数量 3. 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异
2.4 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分 类）
1. 纸电泳：是最早使用的一种电泳技术，滤纸为支持物 2. 醋酸纤维膜电泳：醋酸纤维膜为其支持物 3. 凝胶电泳
（1）琼脂糖凝胶电泳 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.去电荷：由于SDS（十二烷基硫酸钠）产生的十二烷基硫酸根带负电， 使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋 白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别； 2.破坏结构：SDS能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋 白分子的二、三级结构。如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中 可能会形成分别对应于各个亚基的几条带； 3.统一构象：SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合 物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长 度都一样，约为18A；
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定.
2.2 电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
1.电荷差异 (1)电荷性质 (2)电荷数量
2.分子差异 (1)分子大小 (2)分子形状
2.3 电泳分离蛋白质的原理
1. 蛋白质两性解离与等电点
若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同， 此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（PI）。
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 （P138）
1.1 分离胶的配制
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每组总 体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）
量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
3.根据电泳槽体系的类型，分为： （1）圆盘电泳 （2）板状电泳
两者电泳原理完全相同。
四、变性聚丙烯酰-PAGE的原理
SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术 最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分 子量的大小（可以忽略电荷因素），其原理在于：
加buffer（没过上下管口） 样品处理并加样（20ul）
电泳（6mA/管，距底1cm时停止） 剥胶
固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮
二、电泳基本原理及相关知识
2.1 电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其 电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis， 简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
1、聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲基双丙烯酰胺聚合而形成 的三维网状结构，聚合过程由自由基催化完成。 2、催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。 (1)在化学聚合过程中，以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙 二胺（TEMED）为加速剂, TEMED催化AP产生自由基； (2)在光聚合过程中，以核黄素为催化剂，光催化核黄素产生自由 基。自由基引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲基双丙烯酰胺与丙烯 酰胺链间产生甲基键交联，从而形成三维网状结构。
封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可进行 下一步操作）
注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
1.2 浓缩胶的配制
浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，B1D2E1F4，每组总体积为8ml） 倒掉正丁醇 灌浓缩胶（灌胶高度为1.5cm,上面留1cm空隙加样） 封正丁醇3mm（观察界面，10分钟左右出现折光线时可倒去正丁醇）