重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定

• 例如：
• 非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性 基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌 可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但 是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段, 就会造成氨苄青霉素抗性基因失活, 变成ApsTcr, 携带这 种 质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长, 而不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
重点介绍的筛选方法
抗药性筛选 遗传表型直接选择法 a互补 快速裂解菌落鉴定分子大小 限制性内切酶酶切法 间接选择法 PCR方法筛选鉴定重组子 菌落杂交筛选
遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选
• 基本原理 • 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，与目的 基因重组后，转入受体菌，能使受体菌带有相应抗药性， 另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片 段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛 选。
所得到的活力b-半乳糖苷酶（ a-肽加w片段）将底物XGal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使b-半 乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。 a-肽编码区读码框内小的 插入片段产生浅蓝色菌落，因b-半乳糖苷酶只是部分失活。
• 通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的 。这样 一次筛选 可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空 载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组 质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
间接筛选法
• 间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷 酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。 • 一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检 测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。
重组子筛选的方法
DNA水平
重 组 子 筛 选
遗传表型直接筛选法 核酸分子杂交法 PCR法 DNA序列分析法 直接凝胶电泳法 酶切片段分析法 检测特定外源基因是否转录及转录的强度 （Northern杂交印迹法)
B类插入失活筛选步骤
• 注意事项：
• （1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37℃培养时间 约12~16h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。 • （2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的 菌落在LB培养基中震荡培养。
遗传学表型筛选的方法二—a互补
• 基本原理：
• 这种筛选方法适用于含b-半乳糖苷酶基因的载体。载体在 b-半乳糖苷酶的a-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中 的插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的b-半乳糖苷酶， 所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉LacZM15基因， 导致内源a-肽失活。载体或其他含LacZ基因的a-肽互补 细菌，具有b-半乳糖苷酶的w片段。
• 4 将平皿置于 37℃培养 2－3h，菌落长到1mm时，把滤 膜转移到另一块含有氯霉素（170ug／ml）的琼脂糖平皿 上，菌落面向上，37℃培养15－20h，扩增质粒。另一个 菌落对照平皿 37℃培养过夜后，密封，4℃保存。 • 5 把滤膜从平皿中取出，菌落面朝上，置于有一薄层变性 液的塑料膜上，变性处理10min，然后用干滤纸吸干变性 液；再将菌落面朝上置于有一薄层中和溶液的塑料膜上， 中和两次，每次15min。室温晾干后，再置于80℃真空干 燥1－2h。
依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一 快速裂解菌落鉴定分子大小
• 基本原理： • 由于外源片段插入的重组质粒与载体大小不同，我们可以 利用琼脂糖凝胶电泳将重组体分离出来。利用此种方法就 需要将用裂解液将菌体悬浮，保温15min~30min，再 12000rmp离心10min,上清中既含我们所需获得质粒。
• 注意事项： • 如需检测插入片段及其方向，使用载体特异引物和方向 插入特异引物或互换。如只需确认是否存在插入片段， 可用2个插入片段特异引物。扩增反应前在94℃变性两 分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。
重组质粒DNA的菌落杂交筛选
• • 1． 主要原理 • 用体外标记目的基因DNA或相应的RNA为探针同转化后的 菌落进行原位杂交，筛选含重组DNA的克隆。这个方法可 以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组DNA的克隆。 • 该方法的优点是通用性比较强，可以用来检测任何一种插 入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子杂交的原理， 而不以插入的DNA序列能否实现基因表达为前提，因此， 只要有可利用的标记探针就可检测出重组质粒DNA。
• 合适的抽滤器上，用水泵或负压抽至菌落接近于干燥（l－ 2min）。然后用120ml中和液分4次抽过滤膜，室温干燥 后，80℃真空干燥2h。
• (3) 硝酸纤维素膜经过碱溶液处理后容易变脆。因此，随 后的杂交和压X线片时，操作必须小心，以免膜破碎。转 录与扩增的敏感性可检出 1ng RNA中的特异基因。
a类筛选
• 基本原理 • 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。 因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因，转 化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上 生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。
a类筛选的实验方法
• LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； • 将转化后的菌液均匀涂布在平板上； • 放在37℃培养箱培养12~16小时； • 观察菌落生长情况。
总结
• 重组子的筛选往往需要几种方法综合起来，仅用一种方法 可能不能很好的筛选出我们所需的重组体。一般先用直接 筛选法初步筛选，再用间接法筛选进一步筛选。 • 例如： 实验中常先利用抗药性进行初步筛选，再进行电泳检测， 最后甚至会去测序，确定重组子已插入。
• 6 杂交：把滤膜浸入预杂交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
重组体分子的选择与鉴定方法及原理
重组体分子的选择与鉴定方法
我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因 阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个 重 要环节。 涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。 因此，我们需要进一步进行筛选。 常用的筛选方法概括起来有两大类：①直接筛选法；②间 接筛选法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~170µ g/ml
水 乙醇
是 否
-20℃ -20℃
10mg/ml
50µ g/ml
10µ g/ml（液） 12.5µ g/ml 12.5mg/ml （固）
水
是
-20℃
Leabharlann Baidu
20mg/ml
25µ g/ml
A 如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物。 含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。 b：如果外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插人失活 效应 。
直接筛选法
• 直接筛选法是借助遗传学表型来进行筛选的方法。 • 重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表 达，会导致宿主的某些表型的改变，通过琼脂平板中添加 相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒 上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不 能 表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。
• 注意事项： • (1) 菌落杂交与DNA的吸印转膜杂交与斑点杂交不同，后者 一般只有DNA，而菌落杂交时，许多菌体成分与DNA一起 形成斑点，即使经过固定步骤之后，DNA与膜的结合很不 牢固。因此，菌落杂交与纯核酸的杂交最适温度不同，一 般温度略低一些可防止DNA从膜上脱落。 • (2) 为防止滤膜上菌落脱落或移位，可采用抽吸方法进行 DNA变性：即将滤膜菌落面向上，置于4层用变性液浸透 的 Whatman 3MM滤纸上，放置5min，然后把滤液放到一
• 此方法直观快捷，适用于插入片段较大的重组子的筛选。 • 电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体，但不能鉴别插入 片段大小相近的非目的基因片段。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二 ——限制性内切酶酶切方法鉴定重组子
• 基本原理： • 根据已知的外源DNA序列的限制酶切图谱，选择一两种 内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA的带数和 长度）。或用合适的内切酶酶切插入片段，再用其它酶 酶切这个片段，电泳后比较电泳结果是否符合预计的结 果。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
蓝白斑筛选
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，IPTG (异丙基硫代-β-D-半乳糖苷) X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝
无质粒的 受体菌
b-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性 b-半乳糖苷酶 的缺失被载体 产物a互补，能 分解Xgal。且 有抗菌素抗性 载体产物失活， 不能互补b-半乳 糖苷酶的缺失。 不能分解Xgal， 但有抗菌素抗性
不能 正常 生长 在含抗菌 素和Xgal 的培养基 上培养
无菌斑 生长
质粒转化 的受体菌
有蓝 色菌 斑生 长
有白 色菌 斑生 长
带外源DNA插 入的质粒转 化的受体菌
在含抗菌 素和Xgal 的培养基 上培养
蓝白斑筛选
实验中的蓝白斑筛选
• 注意事项：
（1）菌液涂布量为90mm平皿50~100 l; （2）由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长时间，因 此，观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。 与37℃温箱取出后放4 ℃冰箱几小时后观察效果更好； （3）为了防止假阳性需挑菌进一步验证； （4）宿主菌的b-半乳糖苷酶的a-肽编码区应在染色体或附 加体上缺失。
• 方法：
1 硝酸纤维素膜的准备：将硝酸纤维素膜剪成直径为8cm 的圆形，放人一个干净的平皿内，高压灭菌，待用。 • 2 将无菌的作有标记的硝酸纤维素膜铺在含有相应抗生素 的琼脂糖培养基平皿上，用无菌的L型玻璃棒去除膜与培 养基间的气泡，约1－2min，培养基即可将滤膜浸湿。 • 3 用无菌牙签将转化平皿中选择的菌落接种到滤膜上，同 时接种到另一含有相应抗生素的琼脂糖平皿的对应位置， 并作为标记菌落参照。每个90mm的平皿上大约可接种 100个菌落。
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。