罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达重点

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罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性

罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性王蓓;李桂欢;王培;汤菊芬;鲁义善;吴灶和;简纪常【期刊名称】《渔业科学进展》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】Streptococcus is a genus of spherical gram-positive bacteria that can infect a wide range of hosts. Streptococcal diseases of cultured fish caused by Streptococcus agalactiae have been frequently reported in South China, which incurred catastrophic economic losses. Vaccine is one of effective ways to control and eradicate infectious diseases, and so far no effective subunit vaccine for S. agalactiae diseases has been developed. To test whether Hemolysin (Hly) is a potential candidate for vaccine development of Oreochromis niloticus, we cloned hly gene based on bioinformatics analysis and constructed and expressed it. The open reading frame of hly gene contains 1335 bp that encodes 444 amino acid residues. Alignment analysis indicated that the Hly protein was highly homologous to Hly proteins from other Streptococcus(99%). SDS-PAGE confirmed the expression of Hly (51.7 kD) in Escherichia coli BL21(DE3). Then, the recombinant Hly protein was purified by affinity chromatography, which was used for vaccination in Tilapia, O. niloticus. Immunogenicity was confirmed by subsequent western blotting. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis demonstrated that Hly produced an observable antibody response in all vaccinated fish, and the maximum antibody titersin the sera reached 1:4096. The RPS value for the Sip vaccine was 70. Tilapia vaccinated with Hly was highly resistant to the infection of the contaminant S. agalactiae. These results indicate that Hly is an effective vaccine candidate against S. agalactiae for tilapia, O. niloticus.%为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin, Hly)对鱼体的免疫保护作用，根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因，定向克隆于原核表达载体pET-28a中，构建原核重组质粒pET-28a-hly，经IPTG诱导表达后，制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼，并分析疫苗的免疫保护力。

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达

吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常【摘要】利用重叠延伸（SOEing）PCR技术，将吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae） ZQ0910株表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein，Sip）基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因通过Linker序列融合，构建成为Sip-GAPDH融合基因。

将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达。

结果表明，重组质粒pET-32a-Sip-GAPDH在大肠杆菌BL21（DE3）中表达后所获得的融合蛋白Sip-GAPDH分子量为102.01 kD，表达最佳条件为37℃，IPTG浓度0.1 mmol/L，诱导5 h。

Western blot鉴定结果表明融合基因得到了成功表达。

%The DNA fragment encoding the Sip and GAPDH gene of Streptococcus agalactiae strain ZQ0910 isolated from GIFT Strain of Nile Tilapia(Oreochromis niloticus)were obtained by PCR. The Sip-GAPDH gene was constructed in a Sip-linker-GAPDH format with the standard 15-amino acid linker(Gly4Ser)3 by SOEing PCR technique, and the final full length product was cloned into the pET-32a(+)vector for protein expression in Escherichia coli strain BL21(DE3). The result showed that the expression fusion protein Sip-GAPHD were about 102.01 kD and Western blotting analysis confirmed that the 102.01 kD protein was the fusion protein, because it was specifically recognized by mouse anti-His monoclonal antibody. Inducing the cells at 37℃in 0.1 mmol/L of IPTG for 5 hours wasthe optimal conditions for expression of the recombinant Sip-GAPDH fusion protein.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】6页(P137-142)【关键词】无乳链球菌;Sip-GAPDH融合基因;重叠延伸PCR技术;原核表达【作者】王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常【作者单位】广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东海洋大学水产学院，湛江 524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江524088; 广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088; 仲恺农业工程学院，广州 510225;广东海洋大学水产学院，湛江524088; 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088;广东省水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088【正文语种】中文罗非鱼，又被称为“白色三文鱼”，是联合国粮农组织推荐的21世纪最有发展前景的淡水养殖品种［1，2] 。

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立赵光军;李高俊;佟延南;李芳远;王世锋【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2018(000)006【摘要】本文利用终浓度为0.5％(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法.此检测方法的抗原最适包被浓度为1×107 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1:100(v/v),二抗最适工作浓度为1:2000(v/v),最低检测限为1×104 CFU/mL.利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80％,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应.【总页数】4页(P213-215,219)【作者】赵光军;李高俊;佟延南;李芳远;王世锋【作者单位】海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南省海洋与渔业科学院,海南海口 571126;海南大学【正文语种】中文【中图分类】S943【相关文献】1.基于奶牛乳腺炎无乳链球菌rSip-PGK-FbsA融合蛋白的间接ELISA检测方法的建立 [J], 吴金花;布日额;王金良;陈金龙;锡林高娃;孙立杰;王华;王学理;刘燕2.牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白pgk抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立 [J], 布日额;任晓峰;吴金花;王学理;刘燕;锡林高娃;孙立杰;刘洋3.牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立[J], 郎景民;布日额;孙立杰;刘娣;吴金花;锡林高娃;刘燕;史芬芳4.罗非鱼源无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法 [J], 祝璟琳;李大宇;肖炜;邹芝英;杨弘5.以重组无乳链球菌GapC1-150作抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立[J], 刘硕;崔玉东;王欣;李皖豫;马骏;范钊伟;王然;段旭阳;周玉龙;朱战波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

罗非鱼无乳链球菌 EsxA 基因克隆与原核表达

罗非鱼无乳链球菌 EsxA 基因克隆与原核表达马艳平;梁志凌;马江耀;刘振兴;郝乐;柯浩【摘要】Ⅶ型分泌系统（T7SS）是近年来发现的分泌系统，分泌两种胞外蛋白，EsxA 基因编码的 ESAT6蛋白和 EsxB 基因编码的 CFP-10蛋白。

分泌蛋白具有良好的免疫原性，促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能，与致病性密切相关。

以罗非鱼源无乳链球菌为模板，克隆到294 bp 的 EsxA 基因，将目的序列克隆到 pMD18-T 载体，经测序，目的序列与无乳链球菌 EsxA 基因同源率在99％以上。

EsxA 基因克隆到 pET32a 载体中，重组载体在28℃、0．5 mmol／L IPTG 诱导条件下表达量最大，可溶性表达。

将纯化的ESAT6蛋白免疫 Balb／c 鼠，成功制备 ESAT6蛋白鼠多克隆抗体，经 Western blot，ESAT6蛋白具有良好的反应原性。

研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。

%New discovered type Ⅶ secretion system (T7SS)secrets two extracellular proteins including Es-xA coded ESAT6 and EsxB coded CFP-10,which is related to pathogenicity closely.ESAT6 and CFP-10 proteins have diverse functions such as promoting bacteria from phagosome of macrophage,impacting mac-rophage apoptosis and lysis.The two secreted proteins in T7SS of Streptococcus agalactiae form the ho-mologous dimmers,collectively known as ESAT6 protein,may be bacterial adhesion protein showing im-portant for host-cell attachment and invasion in S.agalactiae through bioinformatics analysis.But ESAT6 protein whether has the virulence and its pathogenesis is not clear,therefore it is necessary to study on it. We cloned 294 bp sequence from tilapia Streptococcus agalactiae .And the sequencewas cloned into pMD18-T vector,the homology is 99% with tilapia Streptococcus agalactiae EsxA gene.EsxA gene was cloned into pET32a vector.The best solouble expression was under 0.5 mmol/L IPTG,28℃.In addition, the purified protein was used to immunize Balb/c mice to prepare mouse anti-ESAT6 protein antibody.ES-AT6 protein had sastisfied reactogenicity through Western blot test.These results encouraged further re-search for the immunological function of S.agalactiae ESAT6 protein.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)004【总页数】5页(P35-39)【关键词】Ⅶ型分泌系统;无乳链球菌;EsxA 基因;克隆与表达【作者】马艳平;梁志凌;马江耀;刘振兴;郝乐;柯浩【作者单位】广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640;广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640【正文语种】中文【中图分类】S852.4;Q789Ⅶ型分泌系统(type Ⅶ secretion system, T7SS)由多种组分构成，分泌两种具有免疫原性的胞外蛋白，即EsxA基因编码的早期分泌抗原靶6(earlier secreted antigen target 6，ESAT6)和EsxB基因编码的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10, CFP-10)。

罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55的研发

罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55的研发关键词：罗非鱼；无乳链球菌；口服纳米疫苗；安全性；免疫保卫效果1. 探究背景罗非鱼（Oreochromis niloticus）是一种广泛分布于非洲及其周边地区的淡水鱼类，在我国南方也有一定的养殖量。

然而，罗非鱼的养殖过程中常会受到无乳链球菌（Streptococcus iniae）的侵略，造成罗非鱼免疫力下降，生长缓慢，死亡率高等问题，影响养殖产业的健康进步。

传统的防治方法主要接受化学药物，但存在着毒性大、残留问题、对环境造成污染等弊端。

因此，研发一种安全有效、环保的预防性疫苗，成为当下解决该问题的重要途径。

2. 探究内容本探究接受纳米技术制备了罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55，将其利用口服方式给罗非鱼接种，从而降低给药难度，提高了防治效果。

起首，通过搭建无乳链球菌的鼠亚急性毒性试验，评判了该疫苗的毒性，结果显示该疫苗具有较好的安全性。

同时，对该疫苗的免疫保卫效果进行了探究。

体外试验发现，该疫苗能够增进罗非鱼细胞的增殖，并提高它们对无乳链球菌的保卫能力；动物试验结果表明，该疫苗的接种能够显著降低罗非鱼患病率，提高罗非鱼的存活率。

3. 结论本探究成功制备了一种安全有效的罗非鱼无乳链球菌口服纳米疫苗SIP-MSN@HP55，该疫苗具有良好的免疫学安全性和免疫保卫效果，为罗非鱼养殖防病提供了新的、安全有效的防治手段。

同时，本探究对口服纳米疫苗的研制提出了新的思路和方法，具有一定的理论和实践意义。

关键词：罗非鱼；无乳链球菌；口服纳米疫苗；安全性；免疫保卫效果养殖产业是重要的经济支柱，但由于养殖环境狭窄、密度高等原因，导致养殖动物易发生疾病。

传统的防治方法主要接受化学药物，但由于毒性大、残留问题、对环境造成污染等问题，导致养殖业成为了环境和食品安全的重要隐患。

因此，研发一种安全有效、环保的预防性疫苗，成为解决该问题的重要途径。

罗非鱼源无乳链球菌S-核糖基高半胱氨酸酶基因(1uxS)的克隆及其推导蛋白的三维结构预测

（ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｕｂｌｉｃＬａｂ．ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｆｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ）
进行了扩增、克隆和序列测定，采用ＥｘＰＡｓｙ软件包预测了推导蛋白的特性，利用ＳｗｉｓＳ — Ｍｏｄｅｌ服务器建立了ｌｕｘＳ
三维结构，利用ＳｗｉｓＳ — ＰＤＢｖｉｅｗｅｒ软件进行了蛋白质三维结构的分析。预测结果显示，罗非鱼源无乳链球菌ｌｕｘＳ
第９卷第１期２０１３年２月
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５— ０７８０．２０１３．０１．００７
南方水产科学
ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ
（广东省农业科学院兽医研究所，广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州５１０６４０）
摘要：利用ＰＣＲ技术对罗非鱼源无乳链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）Ｓ－核糖基高半胱氨酸酶（１ｕｘＳ）基因全长ＤＮＡ

罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析

罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的原核表达及免疫原性分析陈雪;可小丽;卢迈新;刘志刚;高风英;朱华平;曹建萌【摘要】LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一.为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因.分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48％.LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位.将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6h.SDS-PAGE显示,诱导表达蛋白的分子量为108.9 ku,并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在.经His Bind亲和柱纯化及超滤管浓缩后,LrrG可溶蛋白浓度达3.40 mg/mL.鱼体注射免疫实验表明,LrrG可溶蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28％,且免疫后4周的血清抗体滴度为1:800.该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2014(038)005【总页数】9页(P713-721)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;LrrG蛋白;原核表达;蛋白纯化;免疫原性【作者】陈雪;可小丽;卢迈新;刘志刚;高风英;朱华平;曹建萌【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广东广州510380【正文语种】中文【中图分类】Q785;S941罗非鱼(Oreochromis spp.)具有食性杂、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，是世界范围主要养殖品种之一。

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用张险朋;丁文桂;胡毅军;李小军;李永福;黄育浩;李敏;李建军【期刊名称】《水产学杂志》【年(卷),期】2024(37)2【摘要】通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。

结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。

结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

【总页数】9页(P46-54)【作者】张险朋;丁文桂;胡毅军;李小军;李永福;黄育浩;李敏;李建军【作者单位】东莞市动物疫病预防控制中心;佛山科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】S965.125【相关文献】1.罗非鱼无乳链球菌巢式 PCR 检测方法的建立2.基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法的建立及应用3.罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR 检测方法建立4.罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析

析表明新菌株的血清型与早期的不同，且试验证实
２０年的高温季节广东和海南两省养殖罗非鱼发０９生暴发性链球菌病，与往年的发病情况比较，本次病害发生的范围广、鱼感染率与死亡率均较高，个
别发病率超过５％，发病鱼死亡率超过９％［。０５】２１年罗非鱼链球菌病仍有发生。球菌病给我国００链罗非鱼养殖业带来极大的威胁。在链球菌的免疫预防上，以色列的Ｅｄｒｅａ．ｌａ，ｔ１
第３卷第４６期
２２年７月０１
水生生物学报
ＡＣＴＡＨＹＤＲ０ＢＩＬ０ＧＣＳＮＩＯＩＡＩＣＡ
ＶＯ１．３６，ＮＯ．４Ｊｕ１．２０１２．
Ｄ０Ｉ０３２／ＰＪ１３．０２０６６：１．７４Ｓ．０５２１．０２
在１９９３年开发了虹鳟海豚链球菌（ｔｐｏｏｃｓｎａ１Ｓｒｔｃｃｕｉｅｅｉ全菌灭活疫苗，从１９年到１９年，以色列的９５９７
达２％一６６Ｂ也是动物，括牛、山羊和绵％【。ＧＳ】包
羊等的急、慢性乳腺炎的主要病原菌之一［］１。Ｒｂｓｎｅａ．６年第一次报道在淡水鱼金色美鳊ｏｉｏ，ｔ１１６ｎ９（ｏｅｇｎｓｃｓｌｕａ）Ｎｔｏｕｒｏｅｃｓ中分离出Ｂ群链球菌，ｍｉｙ们随后相继有包括罗非鱼在内的多种鱼类受无乳链球菌感染而大量死亡的报道ｌ加一。鱼类受链球菌感，染后出现的典型症状之一是运动失控，组织切片显示链球菌可侵袭鱼类脑部神经系统『。罗非鱼是世ｌ刮界性养殖鱼类，也是我国重要的淡水养殖鱼类［，近１年来链球菌病给罗非鱼养殖业造成极大的威胁ｌ，。增Ｊ

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果研究罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。

2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌（Streptococcus iniae）和无乳链球菌（S.agalactiae）。

目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。

疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。

目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。

研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。

本研究构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein,Sip）的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了研究。

研究内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型穿梭表达质粒pNZ8148-sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。

采用SDS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测。

研究结果显示:构建的分泌型重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48KDa的特异性蛋白,非分泌型的表达蛋白为45KDa,与目的蛋白大小一致;SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以胞内可溶性蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。

罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立及应用

在增加了公共卫生安全的风险，这就需要研发采取一种快速、１．１．１细菌菌株罗非鱼ＧＢＳ菌株、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
灵敏和可靠的污染链球菌检测方法，通过采取适当的防控措ｃｏｌｉ）、沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
施，保护易感染群体免受这种人畜共患病原体的侵袭。
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｉｔｒｉｃａｃｉｄｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｂｉｏｍａｓｓ
２０１７，１９：３１２－３２１．
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ＆Ｗａｔｅｒ
［１７］ＬｉＬＸ，ＹａｎｇＸＭ，ＬｉＡ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
科学基金（编号：２０１５ＧＸＮＳＦＡＡ１３９０６８）。作者简介：余艳玲（１９７６—），女，陕西咸阳人，硕士，工程师，主要从事
水产动物分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｅｌｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ。
（Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）与海豚链球菌（Ｓ．ｉｎｉａｅ），均由广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室鉴定和保存。１．１．２主要试剂细菌全基因组ＤＮＡ提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ扩增试剂盒购自日本荣研生物科技公司；ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、钙黄绿
包括野生鱼类［６－７］和养殖鱼类［８－９］严重的疾病，也可导致新生评价。
儿严重的脑膜炎［１０］和成人败血症［１１－１２］。人类或牲畜的ＧＢＳ对罗非鱼具有潜在的感染性［１３］，而来自罗非鱼的ＧＢＳ也可能导致人类感染［１４］。因此，罗非鱼和／或水环境中ＧＢＳ菌株的存

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究

Ｖｏｌ＿１３．Ｎｏ．３
Ｊｕｎ．，２０１７
罗非鱼无乳链球菌ＬｒｒＧ — Ｓｉｐ融合蛋白免疫原性研究
曾祖聪一，可小丽，卢迈新，刘志刚，曹建萌，高风英，朱华平，王淼
（１．中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州，５１０３８０；２．上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）
摘要：为探究无乳链球菌ＬｒｒＧ（Ｌｅｕｃｉｎｅ — ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＧＢＳ）和表面免疫原性蛋白Ｓｉｐ（ｓｕｒｆａｃｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）串联表达的ＬｒｒＧ．ｓｉｐ重组融合蛋白的免疫原性，该研究将原核表达的ＬｒｒＧ — ｓｉｐ重组融合蛋白分别以０．５ｔｘｇ・ｇ（Ｒ１组）、１．０恤ｇ・ｇ（Ｒ２组）和１．５Ｉ．ｚｇ・ｇ（Ｒ３组）每尾２００腹腔注射免疫尼罗罗非鱼（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ
ＺＥＮＧＺｕｃｏｎｇ，ＫＥＸｉａｏｌｉ，ＬＵＭａｉｘｉｎ，ＬＩＵＺｈｉｇａｎｇ，ＣＡＯＪｉａｎｍｅｎｇ，
ＧＡＯＦｅｎｇｙｉｎｇ，ＺＨＵＨｕａｐｉｎｇ。ＷＡＮＧＭｉａｏ
，

罗非鱼源无乳链球菌重组GroEL蛋白疫苗的制备方法及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610314912.5(22)申请日 2016.05.13(71)申请人中山大学地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路135号(72)发明人李安兴　李薇　李云　(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人陈卫(51)Int.Cl.C12N 15/31(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C07K 14/315(2006.01)A61K 39/09(2006.01)A61P 31/04(2006.01)(54)发明名称罗非鱼源无乳链球菌重组GroEL蛋白疫苗的制备方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种罗非鱼源无乳链球菌重组GroEL蛋白疫苗的制备方法及其应用。

所述重组GroEL蛋白疫苗由罗非鱼源无乳链球菌重组GroEL蛋白制备得到。

所述罗非鱼源无乳链球菌重组GroEL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明以罗非鱼源无乳链球菌为研究对象，从罗非鱼源无乳链球菌基因组中克隆到GroEL 基因，与pET28a(+)载体连接构建表达载体，在E.coli BL21(DE3)中进行原核表达和纯化，获得一种特异性强、具有免疫保护效力为68.61±7.39%的重组GroEL蛋白疫苗，为罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治奠定了基础。

权利要求书1页说明书7页序列表7页附图2页CN 105861521 A 2016.08.17C N 105861521A1.一种罗非鱼源无乳链球菌groEL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种罗非鱼源无乳链球菌重组 GroEL蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 根据权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌重组 GroEL蛋白，其特征在于，所述重组 GroEL蛋白是由权利要求1中所述罗非鱼源无乳链球菌groEL基因编码得到。

罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究

罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究林楠【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2018(033)004【摘要】为研究无乳链球菌Streptococcus agalactiae表面免疫蛋白(surface immunogenic protein,SIP)微胶囊口服疫苗对罗非鱼Oreochromis niloticus的免疫效果,将制备的无乳链球菌SIP微胶囊疫苗口服免疫健康的罗非鱼,以注射免疫无乳链球菌灭活疫苗为阳性对照,口服包埋PBS的微胶囊颗粒为阴性对照,分别于免疫后0、7、14、28 d取脾脏组织,通过实时荧光定量PCR方法检测脾脏组织中的白细胞分化抗原CD4、白介素IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子TNF-α、核转录因子NF-κB等5种免疫相关基因表达的变化,并于第5周进行人工感染攻毒试验,计算无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗对罗非鱼的相对免疫保护率.结果显示,免疫接种之后,SIP微胶囊疫苗口服免疫组(SIP疫苗组)和全菌灭活疫苗注射免疫组(灭活疫苗组)罗非鱼脾脏中的5种免疫相关基因表达均不同程度上调,且相对表达量显著高于阴性对照免疫组(阴性对照组)(P<0.05).在人工感染攻毒试验中,SIP疫苗组和灭活疫苗组的死亡率均显著低于阴性对照组(P<0.05),灭活疫苗组比SIP疫苗组得到了更高的免疫保护率,但两组的死亡率差异不显著(P>0.05).说明罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果好,在罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治中有良好的应用前景.【总页数】6页(P351-356)【作者】林楠【作者单位】福建省水产技术推广总站 ,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S943【相关文献】1.罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究 [J], 曾祖聪;可小丽;卢迈新;刘志刚;曹建萌;高风英;朱华平;王淼;;;;;;;;;2.罗非鱼无乳链球菌微胶囊口服疫苗的研制及其免疫效果 [J], 吴斌;樊海平;张新艳;郑磊;钟全福;张国庆;翁祖桐3.罗非鱼无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗制备及其免疫效果的研究[J], 袁玉梅; 石存斌; 陶家发; 张德锋; 孙承文; 巩华; 黄志斌; 赖迎迢4.尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果 [J], 蔡玉臻; 刘志刚; 卢迈新; 可小丽; 高风英; 曹建萌5.罗非鱼无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗制备及其免疫效果的研究[J], 袁玉梅; 石存斌; 陶家发; 张德锋; 孙承文; 巩华; 黄志斌; 赖迎迢因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

无乳链球菌Sip基因的克隆与原核表达

无乳链球菌Sip基因的克隆与原核表达杨学云;王蒴;吴建勇;王登峰;李建军【期刊名称】《草食家畜》【年(卷),期】2016(000)001【摘要】Streptococcus Agalactiae surface immunogenic protein (Sip) is a highly conservative important target for the study of Streptococcus Agalactiae vaccine. The Sip gene was amplified by PCR and be inserted into vector pET-22b from a recombinant vector pET-22b-Sip. After identified by PCR, restriction enzyme digestion and sequencing methods, the recombinant plasmid was transformed into BL21 (DE3) and induced to express by IPTG. The size and reactionogenicity of recombinant protein was detected. The results showed that the sip gene was 1300bp and was 99.16% in homology with reference sequence of GeneBank. The recombinant protein was found to be about 50KDa as expected and showed good reactionogenicity. This research provided the basis and foundation for the immunization against Streptococcus Agalactiae.%无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic proteins, Sip)具有高度保守性,是无乳链球菌疫苗研究的重要靶标.通过PCR技术扩增Sip基因,将其插入pET-22b 载体构建重组质粒pET-22b-Sip,并对重组质粒进行双酶切、PCR鉴定及测序;转入BL21(DE3)中诱导表达,检测重组蛋白的大小及反应原性.结果表明,所扩增Sip基因大小为1 300bp,与GeneBank参考序列同源性为99.16%;蛋白分析表明,目的蛋白大小为50KDa,具有良好的反应原性,为无乳链球菌的免疫预防提供依据和基础.【总页数】6页(P36-41)【作者】杨学云;王蒴;吴建勇;王登峰;李建军【作者单位】新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830000;新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830000;新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830000;新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐 830000【正文语种】中文【中图分类】S917【相关文献】1.无乳链球菌SIP基因的克隆和原核表达 [J], 褚明亮;陈创夫;刘君;乔军;曹旭东2.罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析 [J], 黎炯;叶星;可小丽;卢迈新;迟妍妍;田园园3.吉富罗非鱼源无乳链球菌Sip-GAPDH融合基因的构建及其原核表达 [J], 王蓓;李桂欢;鲁义善;汤菊芬;黄郁葱;吴灶和;简纪常4.罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达 [J], 曾祖聪;曹建萌;卢迈新;可小丽;刘志刚;高风英;朱华平5.罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达 [J], 曾祖聪;曹建萌;卢迈新;可小丽;刘志刚;高风英;朱华平;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

罗非鱼无乳链球菌微胶囊口服疫苗的研制及其免疫效果

罗非鱼无乳链球菌微胶囊口服疫苗的研制及其免疫效果吴斌;樊海平;张新艳;郑磊;钟全福;张国庆;翁祖桐【摘要】为了建立罗非鱼无乳链球菌病免疫防控方法,以原核表达SIP (surface immunogenic protein)蛋白为芯材,天然多糖为壁材,制备罗非鱼无乳链球菌聚丙烯酸树脂Ⅱ微胶囊口服疫苗,SIP口服疫苗微胶囊颗粒平均直径约826.5 μm,包封率为72.02％,载药量最高达6.11％.微胶囊包裹的SIP蛋白在5种缓冲液中释放效果:pH 6.80＞pH 7.20＞pH 9.18＞pH4.68＞pH 2.00.体外实验证实微胶囊颗粒在模拟胃酸环境中蛋白释放量极小,数值为395.5μg;而在模拟肠液中,释放量最高达5426.0 μg,其中240 min释放量为4911.1μg,释放度达90.51％,说明微胶囊能避免胃酸的破坏且肠溶性好.SIP微胶囊口服疫苗以投喂的方式免疫“新吉富”罗非鱼,分别以每克罗非鱼体质量免疫5和10 μg SIP蛋白的剂量分组测试,4次免疫过程中,5μg免疫剂量组特异性血清效价为100-1～400-1,10μg免疫剂量组特异性血清效价为200-1～1600-1.4次免疫后,攻毒实验表明,5和10μg的免疫剂量组的免疫保护率分别为44.45％和66.67％.研究表明,微胶囊口服疫苗免疫为罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治提供方便、安全、有效的途径.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2016(040)008【总页数】7页(P1258-1264)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;表面免疫相关蛋白(SIP);微胶囊口服疫苗【作者】吴斌;樊海平;张新艳;郑磊;钟全福;张国庆;翁祖桐【作者单位】福建省淡水水产研究所,福建福州350002;福建省水产技术推广总站,福建福州350002;福建省淡水水产研究所,福建福州350002;福建省淡水水产研究所,福建福州350002;福建省淡水水产研究所,福建福州350002;福建省淡水水产研究所,福建福州350002;福州博立医药科技有限公司,福建福州 350002;福建省水产技术推广总站,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S942.5罗非鱼（Oreochromis sp.）链球菌病近年来在广东、广西、海南等罗非鱼养殖地区（省份）大规模暴发，造成了重大的经济损失，严重影响了罗非鱼产业的稳定发展［1］。

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曾祖聪 , 曹建萌 , 卢迈新 , 可小丽 , 刘志刚 , 高风英 , 朱华平
2. 上海海洋大学水产与生命学院 , 上海 201306)
1, 2 1 1 1 1 1 1
( 1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所 , 农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室 , 广东广州 510380;
摘要 : LrrG 和表面免疫原性蛋白 ( Sip) 是无乳链球菌 ( Streptococcus agalactiae) 的 2 种表面蛋白 , 具有良好的免疫原性。为获得罗非鱼无乳链球菌表面蛋白 LrrG 和 Sip 蛋白的融合蛋白 , 该试验采用基因拼接技术中的双酶切法分 2 步逐个将 Sip 和 LrrG 基因插入 pCold Ⅱ载体中 , 构建原核表达载体 pCold Ⅱ -LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞 BL21( DE3) , 进行诱导表达条件的优化。结果显示 , 15 ℃、 IPTG 0. 5 mmol ・ L kDa) , 说明成功构建了融合基因 , 为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。关键词 : 罗非鱼 ; 无乳链球菌 ; LrrG; Sip; 融合基因 ; 原核表达载体中图分类号 : Q 786 文献标志码 : A 文章编号 : 2095 - 0780 - ( 2014) 05 - 0017 - 07
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( 1. Key Lab. of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture; Pearl River Fisheries
Abstract: LrrG ( leucine-rich repeat protein from GBS) and Sip ( surface immunogenic protein) , which are two kinds of surface antigen proteins from Streptococcus agalactiae in tilapia, have good immunogenicity. To obtain the LrrG-Sip fusion protein via coalescing surface antigen protein LrrG and Sip of S . agalctiae in tilapia, we cloned Sip and LrrG genes into vector pCold Ⅱ one by one using double enzyme method of gene splicing technology, and constructed a prokaryotic expression vector pCold Ⅱ -LrrG-Sip. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21( DE3) , and the result indicated that 9 h, 15 ℃ , 0. 5 mmol ・ L - 1 IPTG were the optimum inducing conditions under which fusion protein was most soluble and abundant. Western blotting test showed that the LrrG-Sip fusion protein was about 160 kDa, consistent with the prediction ( 162 kDa) , which suggested the prokaryotic expression vector pCold Ⅱ- LrrG- Sip was constructed successfully and laid the foundation for developing subunit vaccines for S. agalctiae in tilapia. Key words: tilapia; Streptococcus agalactiae; LrrG; Sip; fusion gene; prokaryotic expression vector
第 10 卷第 5 期 2 01 4 年 1 0 月 doi: 10. 3969 / j. issn. 2095 - 0780.outh China Fisheries Science
Vol. 10, No. 5 Oct. , 2014
罗非鱼无乳链球菌 LrrG-Sip 融合基因原核表达载体的构建及表达
ZENG Zucong
1, 2
, CAO Jianmeng , LU Maixin , KE Xiaoli , LIU Zhigang , GAO Fengying , ZHU Huaping
Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China; 2. College of Fisheries & Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)
- 1
诱导 9 h, 目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。 Western Blot 检测结果显示 LrrG-Sip 融合蛋白大小与预测一致 ( 162
Construction and expression of prokaryotic expression vector for LrrG-Sip fusion gene of Streptococcus a ga lactia e in tilapia