基因表达载体的构建3.7

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如何构建载体

如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。

由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。

目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。

在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。

然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。

为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。

已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。

例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。

这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。

例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。

在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。

对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。

例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。

吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。

载体构建介绍

5.常见问题

选择标记类型和选择 1、选择性标记类型药物抗性（如Kan，Amp等）营养依赖性标记（如SC-Leu 等） 2、如何选择根据所选载体上所带的标记
5.常见问题

Gateway系统引物设计-需要对读码框
这是因为中间载体和终载体上某些编码氨基酸或者抗性基因同目的片段共用一个起始密码子。
载体构建
戎浩 2015.12
C
ONTENTS
目录
1 2 3 4
载体简介载体构建
注意事项常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
生理检测纯化
载体构建
大肠转化，质粒提取与鉴定
移栽
分子检测
继代繁殖农杆菌的转化与活化
外植体制备
筛选
浸
染
共培养
1.1载体
载体（vector），能将外源DNA或基因片段携带入宿主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
退火温度不合适，设置梯度，选择最适退火温度
2、条带不单一
引物不特异，适当增长引物序列长度；
适当提高退火温度
5.常见问题

载体酶切的问题 1、酶切质粒浓度和纯度要好 2、酶切温度和时间
如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在
用另一个酶切，时间最好过夜切。 3、没有切开可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是否好用
5.常见问题

克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的
片段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段
反向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这会使得酶切效率大大提高。

表达载体的构建方法及步骤

For personal use only in study and research; not for commercial use表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

第三章第一节基因工程（基因表达载体的构建）

4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测蛋白质个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。有内质网和高尔基体
2．病毒感染法用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞

基因表达载体的构建操作流程

基因表达载体的构建操作流程一、了解基因表达载体。

基因表达载体就像是一个小货车，它要把我们感兴趣的基因（就好比是货物）运到细胞这个大工厂里，然后让基因在里面表达出我们想要的东西。

这个载体得有一些特定的部件。

比如说启动子，这就像是货车的发动机，启动整个表达过程。

还有终止子呢，就像是刹车，告诉基因什么时候停止表达。

另外，标记基因也很重要，它就像是货车上的独特标志，方便我们在细胞里找到这个载体是不是成功进去工作了。

二、获取目的基因。

那我们怎么得到想要的目的基因呢？这里有好多办法。

有一种是从基因文库里面找，基因文库就像是一个超级大的基因超市，里面各种各样的基因都有。

我们可以像在超市里找东西一样，用一些特殊的方法把我们要的基因挑出来。

还有一种方法是通过反转录法，如果我们知道这个基因表达出来的RNA长啥样，就能通过反转录把它变成DNA，也就是我们要的目的基因啦。

另外，化学合成法也能用，不过这个比较适合那些比较小的基因片段哦。

三、构建基因表达载体。

当我们有了目的基因，就要开始构建载体啦。

这就像是给我们的货物装到货车上的过程。

我们要把目的基因和载体用同一种限制性核酸内切酶来处理，这种酶就像是一把特殊的剪刀，它能在特定的位置把基因和载体都剪开，而且剪出来的口子是可以互相配对的。

然后呢，再用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，这个酶就像是胶水，把它们粘得牢牢的。

这样，我们的基因表达载体就初步构建好啦。

四、导入受体细胞。

构建好的载体得送到受体细胞里去才能发挥作用。

根据受体细胞的不同，导入的方法也不一样呢。

如果是细菌这样的细胞，我们可以用转化的方法，就像是偷偷地把东西送进去一样。

要是植物细胞的话，农杆菌转化法就比较常用啦，农杆菌就像是一个小邮差，把我们的载体送到植物细胞里面。

动物细胞的话，显微注射法是一种选择，就像是用一个超级小的注射器把载体注射到细胞里。

五、检测与鉴定。

载体送进去了，我们得看看它有没有成功呀。

首先就是检测目的基因是不是真的到了受体细胞里面。

(完整word版)基因表达载体构建

一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。

1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：（1）结构基因均有调控序列；（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。

2．不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。

真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。

3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。

其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。

否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。

（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。

（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。

二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。

2．主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。

第1课时目的基因的获取、基因表达载体的构建

1．2基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的获取、基因表达载体的构建课堂知能验收对应学生用书P0051．基因工程主要操作步骤的顺序是()①基因表达载体的构建②将目的基因导入受体细胞③目的基因的检测与鉴定④目的基因的获取A．③②④①B．②④①③C．④①②③D．③④①②答案 C解析基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。

2．(2018·黑龙江哈尔滨三中高二验收试题)获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是()A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取C．直接从受体细胞中提取D．利用PCR技术获取答案 C解析获取目的基因的方法有多种，例如可以从基因组文库中获取目的基因，可以从cDNA文库中获取目的基因，也可以利用PCR 技术获取目的基因，故A、B、D不符合题意；受体细胞是接受导入的目的基因的细胞，受体细胞自身不含目的基因，C符合题意。

3．下列关于基因文库的说法，错误的是()A．可分为基因组文库和部分基因文库B．cDNA文库属于部分基因文库C．基因组文库的基因在不同物种之间均可进行基因交流D．同种生物的cDNA文库中基因数量较基因组文库少答案 C解析基因组文库中只有部分基因能够在不同物种之间进行基因交流。

4．下列有关PCR技术的说法，不正确的是()A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B．PCR技术的原理是DNA双链复制C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA答案 D解析PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，其原理是DNA双链复制，A、B正确；利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C正确；PCR扩增中目的基因受热变性后解链为单链，不需要解旋酶解开双链DNA，D错误。

植物表达载体构建

（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因；表达载体是适于在受体细胞中表达外源基因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基因工程启动子。现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用于各种不同的转化目的。
2．常用的中间载体及其构建：（1）广谱中间载体：所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点，因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。

基因表达载体的构建步骤

基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤：
①目的基因获取首先需从cDNA文库基因组DNA中PCR扩增出所需片段或通过化学合成方法得到纯净的目的基因；
②载体骨架选择根据后续实验需求如原核表达真核细胞表达植物动物体内表达等挑选合适质粒作为载体骨架；
③双酶切处理使用限制性内切酶对载体DNA进行特异性切割产生与目的基因相同的粘性末端或平末端便于连接；
④凝胶电泳检测将酶切产物加入琼脂糖凝胶中通过电泳分离出预期大小片段并用EB染色紫外灯照射观察；
⑤回收纯化利用商业化试剂盒或自制酚氯仿异丙醇沉淀法回收去除杂蛋白小分子RNA等杂质获得高纯度DNA；
⑥DNA连接取等摩尔浓度的目的基因与载体在T4DNA连接酶缓冲液中孵育过夜使两者以磷酸二酯键相连；
⑦大肠杆菌转化将连接产物热击转入感受态细胞中涂布含相应抗生素的选择平板37度培养箱过夜长出克隆；
⑧阳性克隆筛选挑取单菌落PCR鉴定插入片段大小测序比对确认无误后扩大培养提取质粒保存备用；
⑨启动子匹配根据目的基因表达调控需要从启动子文库中选出与宿主细胞相容性好诱导性强的启动子片段；
⑩多顺反子构建有时为了实现联合表达还需将多个基因串联起来形成多顺反子结构其间用IRES元件连接；
⑪终止子添加在多顺反子3'端加上终止子序列帮助RNA聚合酶识别转录终止位点防止下游基因串扰；
⑫安全评估构建好完整表达载体后还需对其遗传稳定性毒性免疫原性进行评估确保对人体环境友好无害。

谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

中山大学硕士学位论文谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达姓名：***申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：***20070608半醛（ｓｓＡ）和谷氨酸，然后ＳＳ＾在琥珀酸半醛脱氢酶（Ｓｕｃｅｉｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，简称ＳＳＡＤｒＩ）氧化下形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和谷氨酸脱羧酶（ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＥＣＡ．１．１．１５）催化的谷氨酸脱羧反应一起，构成了Ｙ一酮戊二酸氧化形成琥珀酸的另一条支路（Ｓｔｒｅｅｔｅｒｅｔａｌ，１９７２），称之为ＧＡＢＡ支路（如图１—１、卜２）。

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镕，ｌｇｔ鬻Ｙ－－黧—整鏊麓—㈨谷氯缒Ｉ；Ｉ舔氮毅脱羧醮ｌ‘ｌｌ置蔽联镛拜）骧期蘸辅ｉ跷了一氮蕊Ｔ馥’ｔｉｌ｝泓繁氟酶廷勰索酸—４琥珀麓≮器萄瑟甄萄嚣基毒嘲酸拳蒸图１－１：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＦｉｇ．１·１：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩ图１－２：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＩＦｉｇ．１—２：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩＩ１．２．１ＧＡＢＡ的生理功能（１）改善脑机能，延长记忆力。

研究表明，ＧＡＢＡ可以提高葡萄糖磷酯酶的活性，从而促进动物大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能。

（２）改善视觉功能。

据报道，将带有毛细管的电极插入老年猴子的大脑视觉神经皮层中，通过毛细管给神经细胞注入微量的ＧＡＢＡ。

比较给药前后视觉神经细７马倩中山大学硕士学位论文ＧＡＤ６７３４８８ｂｐ图．２．７ＧＡＤ６７的基因结构分析Ｆｉｇ．２·７ＴｈｅｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＡＤ６７马倩中山大学硕士学位论文细菌表达载体ｐＱＥ３０由本室保存。

物理图谱见图３—２。

ｐＱＥ－３０，ｐＱＥ·３Ｔ，ａｎｄｏＱＥ－３２ＶｅｃｔｏｒｇＰｏｓｉｔｉｏｎｓ研’ｅｌｅｍｅｎＩｓｉｎｂａｓｅｓ“ｐＱＥ·３０割０Ｅ－３１ｐＱＥ－３２Ｖ＊ｃｔｏｒ赫｛ｂｐｌ３４６１钍醴＋泓６２跏一ｏｆｎｕｍｂｅｒｉｎｇ耐热ｏｌ（ＣＴＣＧＡＧ）１蠢１－６ｌ毒Ｔ５ｐｒｏｍｏ栅／ｌａｃｏｐ烈司垂ｃ盱ｄｅｍｅｎｔ７－－８７瑚７７迎７ｒＴ５ｔｒｏｒ％ｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｄ＂６１６１６ｌ６】ｃＨｉｓ－ｔａｇ∞ｄｉｎｇｓｅｑｕｅｍ：枣１２７—１４４他７－１钳１２７－ｔ４４Ｍｕｌ矗ｐｌｅｃ｜ｏｎｉｎｇ钳翻ｅ１４５一１９２１４７－１９４１４｛缸１９３ｈｂ如，Ｂ细ｎ５ｃ打ｐ如ｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ理赫２０８－－３０２２１０．－３０４２０９－３０３咖８Ｔ１ｔｍｎｓｃｎ两ｏｎａｌｈ冀啊瞄抟ｃｌ｜；ｏｒｒｆｅ叠ｉｏ“１０６４－１１６２１０６６＿１１６４１０６．孓．１１６署Ｃｏｌ￡１ｏ南ｉｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｍｎ１６３０１６４０１６３９参｛ｑ馥确瞅ｃｏｄｉｎｇｓｅｑ臼ｅｎｃ邑零２Ｓ垂－２３９６９２５＆－２３９８嚣２５７卫３９７叠竺‰燃盛驺§隔∞啼‘图３－２ｐＱＥ３０载体物理图谱、多克隆位点及测序引物占Ｆｉｇ．３－２Ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｏｆｐ０Ｅ３０ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐ一ｍｄｌ＇ｓ。

基因工程-基因表达载体构建(2)

（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交方法，用 DNA与RNA杂交方法检测目的基因是否转录，用免疫（抗原抗体反应）法检测目的基因是否表达。另外也让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞受精卵等。动物常把细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有等；农杆菌转化农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的显微注射法上，导入动物细胞的方法有；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌细胞壁粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常，在很短的时间内就能够获快得大量的目的基因。
途径方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶许多DNA片段 ↓载入运载体 ↓导入受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离目的基因
人工合成基因（真核细胞）反转录法
目的基因mRNA ↓反转录单链DNA ↓合成双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物共用一套遗传密码。基因工程的意义：。目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？

基因表达载体的构建

02
转化后，目的基因需要在宿主细胞中复制和表达，这一过程需要适当的诱导剂和调控元件。
03
表达产物可以是目的基因的蛋白质产物，也可以是RNA产物，具体取决于目的基因的性质和实验需求。
表达产物的检测
01 表达产物的检测可以通过免疫学方法、生物化学方法、分子生物学方法等多种手段进行。
02 检测的目的包括确定目的基因是否成功表达、表达产物的性质和含量等。
基因表达载体的构建
• 基因表达载体概述 • 基因表达载体构建流程 • 克隆基因的表达 • 基因表达载体的应用与展望
01
基因表达载体概述
基因表达载体的定义
基因表达载体是用于将目的基因导入细胞并使其表达的载体，通常由质粒或病毒等构成。
它能够将目的基因带到细胞内，并在细胞内复制和扩增，从而使目的基因在细胞内得到表达。
THANKS
感谢观看
01
宿主细胞应具备繁殖快速、容易培养、容易转染等特性，以便于基因表达产物的生产。
02
宿主细胞应具备低免疫原性，以减少免疫反应对基因表达产物的影响。
03
宿主细胞应具备对表达产物的加工和分泌能力，以便于表达产物的纯化和收集。
转化与表达
01
转化是将目的基因导入宿主细胞中的过程，常用的方法有电穿孔法、显微注射法、脂质体法等。
02
基因表达载体构建流程
选择克隆位点
确定目的基因的长度和结构
01
根据基因序列，选择合适的克隆位点，确保目的基因的完整性
和功能性。
考虑载体的大小和性质
02
根据实验需求，选择适合的载体，确保载体能够容纳目的基因
并具有所需的特性。
确定克隆位点的位置

实验十五、、表达载体的构建

优化了实验条件
在实验过程中，我们对实验条件进行了优化，提高了实验的效率和成功率，为今后的实验提供了有益的参考。
研究展望
拓展应用领域
未来可以将该表达载体应用于更多的基因治疗和基因功能研究领域，为相关领域的发展提供有力支持。
改进表达载体
针对本次实验中存在的不足，可以对表达载体进行进一步的优化和改进，提高其转染效率和稳定性，以适应更多不同类型细胞的需求。
控机制，为基因治疗和基因功能研究提供更加坚实的基础。
03
拓展应用范围
在未来的研究中，可以尝试将该表达载体应用于动物模型和临床试验中，
以验证其在不同生物体内的应用效果和安全性。
THANKS
感谢您的观看
表达载体通常由质粒或病毒DNA改造而来，它们能够将外源基因带入宿主细胞，并在其中进行复制和表达。
通过构建不同的表达载体，科学家们可以实现基因的异源表达、高表达和定向进化等目的，为生物制药、农业和工业生产等领域提供有力支持。
02
表达载体的基础知
识
表达载体的定义
表达载体是用于在宿主细胞中复制和表达外源基因的运载体，它能够将目的基因导入细胞并使其稳定遗传。
实验十五：表达载体的构建
目录
CONTENTS
• 引言 • 表达载体的基础知识 • 实验材料与方法 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01
引言
实验目的
了解表达载体在基因工程中的应用。
学会设计并构建基因表达载体。
掌握表达载体构建的基本原理。
01
03 02
实验背景
表达载体构建是基因工程中的关键技术之一，它涉及到将目的基因插入到载体DNA 中，以便在宿主细胞中进行表达。
表达载体是基因工程中的重要工具，它能够将外源基因在宿主细胞中进行有效表达，产生所需的蛋白质或代谢产物。

课件2：3.2.1 目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建

因文
单链互补DNA
库（
DNA聚合酶催化
如
双链cDNA片段
cDNA
与载体连接
文
导入受体菌中储存
库
）
体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接导入受体菌群体基因组某种生物某个时期的mRNA
反转录
cDNA
与运载体连接导入受体菌群体部分基因（cDNA）PCR技术
DNA复制
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
解旋方式 DNA在高温下变性解旋
不场所同点酶
结果
体外复制耐高温的DNA聚合酶
大量的DNA片段
解旋酶催化
细胞内（主要在细胞核内）解旋酶、DNA聚合酶形成整个DNA分子
第
二
基关于因公表司达载体的构建
步
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使DNA聚合酶能够从引物3′端开始连接脱氧核苷酸
3 扩增方式：以指数方式扩增，即__2_n_（n为扩增循环的次数）
4 扩增过程：
4 扩增过程：
PCR扩增的计算：
（1）若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 2n 个。（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 N0∙2n个。
〘思考〙用DNA连接酶处理后会出现几种产物？
如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？
质粒
目的基因
将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的
连接方式有：
目的基因自连
自连
目的基因
质粒自连目的基因与质粒连接
质粒

构建基因表达载体的步骤

构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。

构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。

下面将介绍构建基因表达载体的步骤。

第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。

一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。

对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。

第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。

启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。

因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。

第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。

一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。

此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。

第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。

具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。

此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。

第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。

此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。

第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。

转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。

根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。

第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。

检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。

根据自己的实验需要选择合适的检测方法。

总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。