蛋白质工程培训课件
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• 先将该序列导入目标基因中想要导入该氨基酸的位 置，同时用‘化学酰胺化’的方法得到该氨基酸的 氨酰tRNA，使携带识别CGGG的反密码子的tRNA 与非天然氨基酸结合。
Ser
tRNA UCG
AGC ·AGC ·ACC
mRNA
硝基苯丙氨酸 (化学酰胺化法）
GCCC AGC ·CGGG ·ACC
在体外无细胞翻译体 mRNA 系中进行蛋白质合成
蛋白质改造技术
• 定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定 位点引入突变的方法。操作过程如下：
1. 人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引 物，如：Val→Arg）
2. 制备目标基因的单链DNA模板
3. 使突变引物与DNA模板退火
4. 使用DNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入 突变
和DNA的亲和性降低，不能与操纵基因O结
合，对Plac的阻遏被解除，lac Z等基因的转
录得以进行。
• IPTG：异乳糖的类似物，可作为lac启动子 的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子 一直被诱导。
乳糖, Lactose
IPTG
转录终止子
• 从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产 会额外地耗费能量。
• 这种技术在实验室中也常 被用于目的蛋白的亲和层 析纯化（例如：与GST、 His标签、GFP等蛋白融 合）。
mRNA 融合蛋白
基因B
ORF
基因融合
ORF
转录
翻译
IPTG
宿主E. coli BL21(DE3)染色体
plac T7 RNA聚合酶
pT7 SD GST 目的蛋白 T7终止子
T7 RNA聚合酶
5. 转化至E. coli中，通过DNA测序确认突变是否成功。
定点突变法 site-directed mutagenesis
质粒
制作ssDNA
人工合成突变引物
DNA聚合酶 合成互补链
转化E. coli，挑选克隆 提取质粒DNA，测序
PCR定点突变法
第一轮PCR
第一轮PCR
聚合酶合成
混合两个PCR产物， 变性，退火
混合这些片段，热变性， 退火（shuffle）
表型筛选
DNA聚合酶，连接酶
嵌合体文库
蛋白质改造技术
• 非天然氨基酸导入：将20种氨基酸之外的氨基酸 （如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予 蛋白质全新的功能。
• 首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸， 通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生 ‘四联体密码子’，如CGGG。
• 这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有 某种功能的新蛋白的技术被称为‘蛋白质工程’。
• 蛋白质工程的终极目标：
① 根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能; ② 使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地
创造具有期望结构和功能蛋白质。
蛋白质工程
• 从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信 号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的 改造对象。
适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。
宿主的蛋白降解系统
• 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本 身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋 白酶缺陷的突变株。
• 如E. coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与
pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失 lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其引入了蛋白 酶OmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。
ampr
lacZ’
• 在以E. coli为宿主的生产中，常使 用可以根据培养温度调整拷贝数的 runaway质粒（如pCP3），42 ℃时 拷贝数最高可达几千个。
复制起点ori
启动子的强度
• 启动子的强度是指一个启动子能 够多大程度地结合RNA聚合酶并 引发转录过程。
原核基因启动子
RNA 聚合酶
-35 -10
蛋白质改造技术
• 将上述氨酰tRNA与目标基因的mRNA分子共同添加 到无细胞翻译体系中，就可以获得wk.baidu.com要的蛋白质。
• 使用多种四联体密码子，可将2种以上的非天然氨 基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。
• 这种技术存在的问题主要有：
– 因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低 – 氨酰基tRNA的制备过程复杂 – 导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等
ADH1，TDH3
GAL1，PHO5
毕赤酵母P. pastoris
GAP
AOX
诱导性表达
• 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着 mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细 胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。
• 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对 宿主细胞有毒性的话就更是如此。
• 影响产率的宿主因素主要有二：①mRNA的稳定性； ②宿主的蛋白质降解系统。
载体拷贝数
• 通过调控基因拷贝数来提高外源基 因表达产量被称作‘基因的剂量效 应’，是一个对生产过程产生较大 影响的因素。
• 在多数情况下可以理解为质粒拷贝 数的多少，与ori有关。在克隆实验 中常使用拷贝数~100的多拷贝质粒。
savinase的基因进行定点或随机突变，构建在芽孢杆 菌中的基因表达文库。
• 筛选：将菌体溶液移入96孔板，进行低温条件下的 酶促反应。获得的突变型酶在15℃时的洗涤效果有 显著提高（Kannase®，Novozymes，1997）。
• 淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B. licheniformis 的α-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。
• 另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GST， 谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合的方法进行融合 表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。
融合蛋白表达
• 蛋白质的在结构与功能上 都具有模块化的特点，其 结构域往往在结构和功能 上都有相当的独立性。
基因A
ORF
ORF
• 这就使通过DNA重组技术 产生融合蛋白质成为可能。
• 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时 才进行强力表达的诱导性启动子。
• E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源 的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。
E. coli 的乳糖操纵子lac operon
P lac I
调节基因
启动子
Plac O
操纵 基因
lac Z
lac Y
• 在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋 白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的 改造。蛋白质改造的技术主要有：
① 随机突变法 ② 定点突变法 ③ DNA shuffling ④ 非天然氨基酸导入 ⑤ 基因融合
蛋白质改造技术
• 随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技 术，包括：
本课内容
蛋白质的产率问题 蛋白质工程概要 蛋白质工程的应用实例
蛋白质的产率问题
• 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包 括载体相关因素和宿主相关的因素。
• 与载体有关的因素主要有：
① 表达载体拷贝数的调控 ② 启动子的强弱与转录调控 ③ 转录终止子的效应 ④ 密码子的使用频率 ⑤ 信号肽的特征与分泌调控
• 原核基因的启动子主要包括-35和-
10区，真核基因启动子则主要是
TATA盒与一些上游转录活化序列 UAS。这些序列被称作顺式作用
真核基因启动子
元件（cis序列）。
RNA聚合酶
• 一般认为启动子的强度与cis序列 的最佳配置相关，在人工构建强 启动子时主要是尝试把不同基因 的启动子的cis序列进行重组。
PCR进一步扩增 连接到克隆载体中，转化E. coli，挑选克隆，提取质粒，测序
蛋白质改造技术
• DNA shuffling：由Stemmer等人所建立，作为一种 基因重排的方法，主要步骤：
– 针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因 – 用DNase I将这些DNA随机切断，获得长度在20~50bp
• 在工业水平的生产中，密码子的 选择会明显地影响蛋白质的纯度 和产量。基因中如果高频率出现 对应于少量tRNA的密码子，蛋白 产量会明显降低。
丙氨酸的同义密码子 · GCA · GCG GCC GCU
tRNA
• 因此一条重要的基因设计原则就 是要选择最适密码子：对应于最 多tRNA分子的密码子。
信号肽与分泌生产
的片段 – 将这些片段混合，进行无引物PCR – 加入DNA连接酶，使DNA小片段重新连接，可能获得
有价值的新组合 – 通过合适的表型筛选系统进行选择
• 这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可 以实现酶的稳定性及催化活性的改良。
DNA shuffling
Reshuffle
一组相关的基因
DNase I 随机切割
• 如果把该Met替换为其他氨基酸，可以提高酶分子 的抗氧化性能。
• 例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其 Met222替换为Ala后，经100mM H2O2处理15min后残 余活力由野生型的30%提高到70%。（诺维信 Novozymes的产品Esperase®。）
洗涤剂用酶
• 低温蛋白酶的开发：对B. clausii 来源的蛋白酶
UAS TATA
启动子
• 根据表达的方式可以把启动子分为两类：
– 构成性表达启动子：持续表达 – 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。
宿主
大肠杆菌E. coli
枯草芽孢杆菌
酿酒酵母S. cerevisiae
启动子
构成性表达
诱导表达
lac, tac, ara pBAD, λPL, T7
蛋白酶、淀粉酶基因 的启动子
乳糖操纵子
• 乳糖操纵子包含启动子Plac、操纵 基因O和3个结构基因
① lacZ：β-半乳糖苷酶
② lacY：β-半乳糖苷透性酶
③ lacA：β-半乳糖苷转乙酰酶
• 操纵子上游的lac I 编码阻遏蛋白。
lac A
P lac I
Plac O
lac Z
lac Y
转录
lac A
阻遏蛋白
异乳糖
• 异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，
N MLLQAFLLAGFAAKISA S
• 信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的 充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信 号肽进行蛋白分泌表达的载体。
• 细菌中B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵 母S. cerevisiae、P. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较
• 外源蛋白质在宿主菌中表达 时可能会遇到细胞毒性问题， 另一些蛋白则可能因过剩表 达而形成不溶性的包涵体。
• 采用细胞外分泌的方法生产 是避免上述情况发生的有效 手段。
• 分泌至细胞外的目的蛋白不 乳酸克鲁维酵母 仅可以正确折叠，而且表达 量较高，并有利于分离与精 制。
信号肽
• 信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由15~30aa组成， 末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵 母蔗糖酶信号肽：
– 采用羟胺等化学试剂处理或UV照射细胞进行人工诱变， 然后选择表现型；
– 利用DNA修复酶缺陷株； – 利用DNA聚合酶反应的底物特异性下降现象； – 全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。
• 易错PCR（Error-prone PCR）：PCR中使用的Taq DNA聚合酶本来就是一种错误率较高的聚合酶，如 果在体系中存在Mn2+或Mg2+浓度异常，以及A、G、 C、T中有一种的浓度仅为通常的1/10，反应就更容 易出错。
启动子 SD
目的基因
终止子
• 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该 基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会 使质粒的稳定性下降。
• 因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添 加终止子序列。如E. coli中的rRNA基因rrnB的终止 子、T7噬菌体的终止子等。
密码子使用频率
• 不同物种对各种密码子的使用频 率不同，原因之一是细胞中各种 tRNA分子所占的比例不同。
洗涤剂用酶
• 洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺 的成分，常添加的酶包括蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求 量在不断增加。
• 在各种酶制剂联合使用以提高洗 涤效果的同时，科研人员也致力 于通过蛋白质工程手段改善每种 酶的功能。
• 蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重 要、使用量最大的酶制剂。
洗涤剂用酶
• 在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起 酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被 氧化所引起。
• 以融合蛋白形式进行表达的
额外的好处是可以对目标蛋
ampr
表达载体
白进行亲和层析纯化，能大 大简化蛋白的纯化过程。
ori
融合蛋白的亲和层析法纯化
GST
树脂颗粒
GST
结合
谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽，GSH 目标蛋白
GST
GST
洗脱
GST
GST
蛋白酶
蛋白质工程
• 随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识 更加深刻，到1980年前后科学家们已经可以根据不 同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。
Ser
tRNA UCG
AGC ·AGC ·ACC
mRNA
硝基苯丙氨酸 (化学酰胺化法）
GCCC AGC ·CGGG ·ACC
在体外无细胞翻译体 mRNA 系中进行蛋白质合成
蛋白质改造技术
• 定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定 位点引入突变的方法。操作过程如下：
1. 人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引 物，如：Val→Arg）
2. 制备目标基因的单链DNA模板
3. 使突变引物与DNA模板退火
4. 使用DNA聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入 突变
和DNA的亲和性降低，不能与操纵基因O结
合，对Plac的阻遏被解除，lac Z等基因的转
录得以进行。
• IPTG：异乳糖的类似物，可作为lac启动子 的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子 一直被诱导。
乳糖, Lactose
IPTG
转录终止子
• 从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产 会额外地耗费能量。
• 这种技术在实验室中也常 被用于目的蛋白的亲和层 析纯化（例如：与GST、 His标签、GFP等蛋白融 合）。
mRNA 融合蛋白
基因B
ORF
基因融合
ORF
转录
翻译
IPTG
宿主E. coli BL21(DE3)染色体
plac T7 RNA聚合酶
pT7 SD GST 目的蛋白 T7终止子
T7 RNA聚合酶
5. 转化至E. coli中，通过DNA测序确认突变是否成功。
定点突变法 site-directed mutagenesis
质粒
制作ssDNA
人工合成突变引物
DNA聚合酶 合成互补链
转化E. coli，挑选克隆 提取质粒DNA，测序
PCR定点突变法
第一轮PCR
第一轮PCR
聚合酶合成
混合两个PCR产物， 变性，退火
混合这些片段，热变性， 退火（shuffle）
表型筛选
DNA聚合酶，连接酶
嵌合体文库
蛋白质改造技术
• 非天然氨基酸导入：将20种氨基酸之外的氨基酸 （如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予 蛋白质全新的功能。
• 首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸， 通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生 ‘四联体密码子’，如CGGG。
• 这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有 某种功能的新蛋白的技术被称为‘蛋白质工程’。
• 蛋白质工程的终极目标：
① 根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能; ② 使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地
创造具有期望结构和功能蛋白质。
蛋白质工程
• 从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信 号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的 改造对象。
适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。
宿主的蛋白降解系统
• 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本 身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋 白酶缺陷的突变株。
• 如E. coli BL21（DE3）是基因表达实验中最常与
pET系列质粒配合使用的宿主菌，B株系天然缺失 lon蛋白酶（K12有）。研究人员又向其引入了蛋白 酶OmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。
ampr
lacZ’
• 在以E. coli为宿主的生产中，常使 用可以根据培养温度调整拷贝数的 runaway质粒（如pCP3），42 ℃时 拷贝数最高可达几千个。
复制起点ori
启动子的强度
• 启动子的强度是指一个启动子能 够多大程度地结合RNA聚合酶并 引发转录过程。
原核基因启动子
RNA 聚合酶
-35 -10
蛋白质改造技术
• 将上述氨酰tRNA与目标基因的mRNA分子共同添加 到无细胞翻译体系中，就可以获得wk.baidu.com要的蛋白质。
• 使用多种四联体密码子，可将2种以上的非天然氨 基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。
• 这种技术存在的问题主要有：
– 因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低 – 氨酰基tRNA的制备过程复杂 – 导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等
ADH1，TDH3
GAL1，PHO5
毕赤酵母P. pastoris
GAP
AOX
诱导性表达
• 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着 mRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细 胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。
• 这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对 宿主细胞有毒性的话就更是如此。
• 影响产率的宿主因素主要有二：①mRNA的稳定性； ②宿主的蛋白质降解系统。
载体拷贝数
• 通过调控基因拷贝数来提高外源基 因表达产量被称作‘基因的剂量效 应’，是一个对生产过程产生较大 影响的因素。
• 在多数情况下可以理解为质粒拷贝 数的多少，与ori有关。在克隆实验 中常使用拷贝数~100的多拷贝质粒。
savinase的基因进行定点或随机突变，构建在芽孢杆 菌中的基因表达文库。
• 筛选：将菌体溶液移入96孔板，进行低温条件下的 酶促反应。获得的突变型酶在15℃时的洗涤效果有 显著提高（Kannase®，Novozymes，1997）。
• 淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B. licheniformis 的α-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。
• 另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如GST， 谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合的方法进行融合 表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。
融合蛋白表达
• 蛋白质的在结构与功能上 都具有模块化的特点，其 结构域往往在结构和功能 上都有相当的独立性。
基因A
ORF
ORF
• 这就使通过DNA重组技术 产生融合蛋白质成为可能。
• 因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时 才进行强力表达的诱导性启动子。
• E. coli的诱导表达系统几乎全部是利用E. coli 来源 的各种操纵子中的启动子，如lac启动子。
E. coli 的乳糖操纵子lac operon
P lac I
调节基因
启动子
Plac O
操纵 基因
lac Z
lac Y
• 在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋 白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的 改造。蛋白质改造的技术主要有：
① 随机突变法 ② 定点突变法 ③ DNA shuffling ④ 非天然氨基酸导入 ⑤ 基因融合
蛋白质改造技术
• 随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技 术，包括：
本课内容
蛋白质的产率问题 蛋白质工程概要 蛋白质工程的应用实例
蛋白质的产率问题
• 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包 括载体相关因素和宿主相关的因素。
• 与载体有关的因素主要有：
① 表达载体拷贝数的调控 ② 启动子的强弱与转录调控 ③ 转录终止子的效应 ④ 密码子的使用频率 ⑤ 信号肽的特征与分泌调控
• 原核基因的启动子主要包括-35和-
10区，真核基因启动子则主要是
TATA盒与一些上游转录活化序列 UAS。这些序列被称作顺式作用
真核基因启动子
元件（cis序列）。
RNA聚合酶
• 一般认为启动子的强度与cis序列 的最佳配置相关，在人工构建强 启动子时主要是尝试把不同基因 的启动子的cis序列进行重组。
PCR进一步扩增 连接到克隆载体中，转化E. coli，挑选克隆，提取质粒，测序
蛋白质改造技术
• DNA shuffling：由Stemmer等人所建立，作为一种 基因重排的方法，主要步骤：
– 针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因 – 用DNase I将这些DNA随机切断，获得长度在20~50bp
• 在工业水平的生产中，密码子的 选择会明显地影响蛋白质的纯度 和产量。基因中如果高频率出现 对应于少量tRNA的密码子，蛋白 产量会明显降低。
丙氨酸的同义密码子 · GCA · GCG GCC GCU
tRNA
• 因此一条重要的基因设计原则就 是要选择最适密码子：对应于最 多tRNA分子的密码子。
信号肽与分泌生产
的片段 – 将这些片段混合，进行无引物PCR – 加入DNA连接酶，使DNA小片段重新连接，可能获得
有价值的新组合 – 通过合适的表型筛选系统进行选择
• 这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可 以实现酶的稳定性及催化活性的改良。
DNA shuffling
Reshuffle
一组相关的基因
DNase I 随机切割
• 如果把该Met替换为其他氨基酸，可以提高酶分子 的抗氧化性能。
• 例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其 Met222替换为Ala后，经100mM H2O2处理15min后残 余活力由野生型的30%提高到70%。（诺维信 Novozymes的产品Esperase®。）
洗涤剂用酶
• 低温蛋白酶的开发：对B. clausii 来源的蛋白酶
UAS TATA
启动子
• 根据表达的方式可以把启动子分为两类：
– 构成性表达启动子：持续表达 – 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。
宿主
大肠杆菌E. coli
枯草芽孢杆菌
酿酒酵母S. cerevisiae
启动子
构成性表达
诱导表达
lac, tac, ara pBAD, λPL, T7
蛋白酶、淀粉酶基因 的启动子
乳糖操纵子
• 乳糖操纵子包含启动子Plac、操纵 基因O和3个结构基因
① lacZ：β-半乳糖苷酶
② lacY：β-半乳糖苷透性酶
③ lacA：β-半乳糖苷转乙酰酶
• 操纵子上游的lac I 编码阻遏蛋白。
lac A
P lac I
Plac O
lac Z
lac Y
转录
lac A
阻遏蛋白
异乳糖
• 异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，
N MLLQAFLLAGFAAKISA S
• 信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的 充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信 号肽进行蛋白分泌表达的载体。
• 细菌中B. subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵 母S. cerevisiae、P. pastoris和曲霉属的霉菌则是比较
• 外源蛋白质在宿主菌中表达 时可能会遇到细胞毒性问题， 另一些蛋白则可能因过剩表 达而形成不溶性的包涵体。
• 采用细胞外分泌的方法生产 是避免上述情况发生的有效 手段。
• 分泌至细胞外的目的蛋白不 乳酸克鲁维酵母 仅可以正确折叠，而且表达 量较高，并有利于分离与精 制。
信号肽
• 信号肽位于分泌蛋白质的N-末端，由15~30aa组成， 末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵 母蔗糖酶信号肽：
– 采用羟胺等化学试剂处理或UV照射细胞进行人工诱变， 然后选择表现型；
– 利用DNA修复酶缺陷株； – 利用DNA聚合酶反应的底物特异性下降现象； – 全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。
• 易错PCR（Error-prone PCR）：PCR中使用的Taq DNA聚合酶本来就是一种错误率较高的聚合酶，如 果在体系中存在Mn2+或Mg2+浓度异常，以及A、G、 C、T中有一种的浓度仅为通常的1/10，反应就更容 易出错。
启动子 SD
目的基因
终止子
• 当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该 基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会 使质粒的稳定性下降。
• 因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添 加终止子序列。如E. coli中的rRNA基因rrnB的终止 子、T7噬菌体的终止子等。
密码子使用频率
• 不同物种对各种密码子的使用频 率不同，原因之一是细胞中各种 tRNA分子所占的比例不同。
洗涤剂用酶
• 洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺 的成分，常添加的酶包括蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求 量在不断增加。
• 在各种酶制剂联合使用以提高洗 涤效果的同时，科研人员也致力 于通过蛋白质工程手段改善每种 酶的功能。
• 蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重 要、使用量最大的酶制剂。
洗涤剂用酶
• 在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起 酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的Met被 氧化所引起。
• 以融合蛋白形式进行表达的
额外的好处是可以对目标蛋
ampr
表达载体
白进行亲和层析纯化，能大 大简化蛋白的纯化过程。
ori
融合蛋白的亲和层析法纯化
GST
树脂颗粒
GST
结合
谷胱甘肽硫转移酶 谷胱甘肽，GSH 目标蛋白
GST
GST
洗脱
GST
GST
蛋白酶
蛋白质工程
• 随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识 更加深刻，到1980年前后科学家们已经可以根据不 同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。