酶标记抗体
酶标记抗体
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一)酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物
呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
(二)HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2.标记步骤：
(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH 7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3.结果判定：
(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节(三)工作浓度的选择)。
(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg／ml)IgG量(mg／ml) 酶量
克分子比值＝────────÷───────＝─── × 4
40,000 160,000IgG量
(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。
4.试剂及器材：
(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO449ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
(9)HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HR P经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
2.标记步骤:
(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入1 0mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
3.结果判定：
除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
4.试剂及器材:
(1)0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸馏水至2,000ml。
(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
Na２CO３0.32克
NaHCO３0.586克
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4)NaBH４溶液(4mg／ml):
临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。
(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
(三)工作浓度的选择
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４0.05 ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。
(四)注意事项
1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。
3.室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4.浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶1 0，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；
3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；
荧光素标记抗体方法
荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
了解蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA—2A)与谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)在1型糖尿病(DM)中的检出率及
龙源期刊网 了解蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA—2A）与谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）在1型糖尿病（DM）中的检出率及其诊断价值 作者：薛勇 来源：《饮食与健康·下旬刊》2015年第10期 【摘要】目的：分析探讨蛋白酪氨酸磷酶抗体与谷氨酸脱羧酶抗体在1型糖尿病中的检出率及其诊断价值。方法：选择我院收治的1型糖尿病患者120例作为研究对象，收治时间在2013年3月至2014年3月期间，使用数字抽签法对这120例患者进行分组，分别为A组、B 组和C组，每组各40例，A组采取蛋白酪氨酸磷酸酶抗体检测，B组采取谷氨酸脱羧酶抗体检测，C组采取白酪氨酸磷酶抗体与谷氨酸脱羧酶抗体联合检测，并在检测结束后，对比三组的检出率。结果：A组的检出率为87.50%，B组的检出率为80.00%，C组的检出率为 100.00%，C组患者的检出率明显高于A、B两组，P 【关键词】白酪氨酸磷酸酶抗体;谷氨酸脱羧酶抗体;1型糖尿病 谷氨酸脱羧酶（GAD）是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ氨基丁酸（GABA）的限速酶，在胰岛β细胞中存在GAD，并也合成、分泌GABA。本文就蛋白酪氨酸磷酸酶抗体与谷氨酸脱羧酶抗体在1型糖尿病中的检出率及其诊断价值进行了研究分析，将我院确诊的120例1型糖尿病患者作为研究对象，并分别给予蛋白酪氨酸磷酸酶抗体检测、谷氨酸脱羧酶抗体检测及酸磷酸酶抗体检测联合谷氨酸脱羧酶抗体检测，现报告整理完毕，具体陈述如下。 1 研究资料和方法 1.1 研究资料 选择我院收治的1型糖尿病患者120例作为研究对象，收治时间在2013年3月至2014年3月期间，使用数字抽签法对这120例患者进行分组，分别为A组、B组和C组，每组各40例。
免疫标记技术讲解
课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏拉巴卓嘎 张燕培汪婷婷
免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定（RIA） 放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 （二）免疫放射测定（IRMA）
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex
G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效
标记抗体技术
标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，
蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！ 1988年Tonks等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化了第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteinTyrosinePhosphatase-1B，PTP-1B)。 PTP1B是一种胞内PTP，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达;其与蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosineKinases，PTK)共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。 PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸(phosphotyrosyl，pTyr)残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP-1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病。 PTP-1BDNA的启动子上有一个转录因子Y盒结合蛋白-1的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，
PTP-1B的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1PTP-1B的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： (1)与胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS)等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II型糖尿病的发生具有密切的联系。 (2)在瘦素信号传导过程中，通过降低转录激活子-3(STAT-3)和Janus激酶-2(JAK-2)的磷酸化水平，在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 (3)PTP-1B通过与生长因子等底物相互作用，参与细胞生长周期的调节，与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外，研究还发现PTP-1B在催乳素信号传
碱性磷酸酶标记方法
碱性磷酸酶标记方法(戊二醛两部法) 将100uL碱性磷酸酯酶加入到300uL10mM PBS（pH7.2），再加入40uL 25%的戊二醛，混匀，4摄氏度活化20小时； 透析至10mM PBS（pH7.2），24小时，换液4次； 将目的蛋白用10mM PBS（pH7.2）配成4mg/mL； 将125uL目的蛋白加入活化过的碱性磷酸酶中（终浓度为5000U AP/mg蛋白），混匀，4摄氏度反应24小时。 参考文献：A蛋白碱性磷酸醋酶的标记及酶联测试 Enzyme Linked Immunosorbent Assay Using Alkaline Phosphatase Conjugated with Streptococcal Protein G 使用200mgAP/mg 蛋白 2.5mg AP（50IU/mg），加入200uL含1.25%戊二醛的100mM 的PB（pH6.8），混匀，室温反应过夜； 4摄氏度条件下，电磁搅动，透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次； 1.5mg目的蛋白溶于100uL 1M的CB（pH9.5）； 将活化的AP加入配好的蛋白质液体中，混匀，4摄氏度条件下反应24小时； 加入10uL 200mM的赖氨酸溶液，混匀，22摄氏度条件下反应2小时； 4摄氏度条件下透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次； 离心，取上清，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05% NaN3稀释10倍，-20摄氏度保存。 底物缓冲液：100mM TB9.0+100mM NaCl+1mM MgCl2 参考文献：碱性磷酸酶标记链霉亲和素 2．戊二醛交联标记法： 此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。 一步法将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。此法操作简便，广泛用于；HRP、AP与抗体(抗原)的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。 二步法先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合，除去未与酶结合的多余戊二醛后，再加入抗体(抗原)，形成酶—戊二醛—抗体(抗原)结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。 戊二醛标记法： 酶结合量(mg／ml)=OD403X0.4 IgG含量(mg／m1)= （OD280 －OD403 X 0.42）X 0.94X0.62 过碘酸钠标记法 IgG含量(mg／m1)＝(OD280－OD403 X 0.3)X0.62。 计算克分子比或摩尔比(E／P) HRP／IgG＝HRP(mg／m1)／HRP分子量÷IgG(mg／m1)／IgG分子量 =HRP(mg／m1)／40 000÷IgG (mg／m1)／160 000
蛋白质酪氨酸磷酸化_免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较_陈沙力
蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Wes tern 印迹两种方法的比较 * 预防医学院放射生物实验室 陈沙力 刘树铮 提 要 为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法,采用免疫 沉淀法及Western 印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明,照射后17500、22000、28000、32000、40000、43000及53000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Western 印迹结果表明,照射后28000、32000蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中,免疫沉淀法优于Western 印迹法。 关键词 蛋白质 磷酸化 免疫沉淀 免疫印迹中图号 R331 蛋白质酪氨酸磷酸化是多种刺激因素诱导激活基因表达的细胞信息传递通路中的基础步骤,也是电离辐射激活淋巴细胞PKC 信息传递 通路及转录因子N F -kB 最基本的步骤〔1〕。预先的研究表明,低剂量电离辐射可诱导小鼠胸腺细胞数种蛋白分子发生变化〔2〕,其中包括辐射刺激引起蛋白分子的甲基化、糖基化及磷酸化等化学修饰变化。研究蛋白质磷酸化在细胞信息传递中的作用具有重要的意义。本研究采用免疫沉淀及Western 印迹两种方法对辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白分子磷酸化进行了比较研究,现将结果报告如下。 1 材料和方法1.1 动物及照射条件 健康雄性昆明小鼠,体重18～22g 。采用Philips 深部X 射线机照射动物,电压200kV ,电流10m A,滤板0.5mm Cu,1.0mm Al,靶皮距离212cm 。单次全身照射,剂量率为12.5m Gy /min ,剂量为75m Gy 。 1.2 小鼠胸腺细胞分离及金黄色葡萄球菌Cow an I 株(SAC )的活化、纯化、鉴定、增殖、回收及处理 * 国家自然科学基金资助课题(39270207)参见文献〔3,4〕。 1.3 免疫沉淀 1.3.1 H 332PO 4代谢标记胸腺细胞及细胞裂解 用无磷酸盐RPM I 1640培养液(Sig-ma )调细胞浓度至107个/ml ,加入H 332 PO 4(中科院原子能研究院)4.625×109 Bq /ml,37℃平缓摇动培养3h ,冷生理盐水洗涤2次并溶解于细胞裂解液(50mmol /L Tris,p H 7.5,150 mm ol /L Na Cl ,1 %N P -40,0.1mol /L NaF ,10mm ol /L Na 3VO 4,5mm ol /L EDT A,1mmol /L PM SF ,2U Aprotinin )中,冰浴30min ,间或振荡,反复通过22号针头,15000r /min 离心20min ,上清移至另一离心管中。 1.3.2 细胞裂解物的预清除 将S AC 置离心管中,7000r /min 离心15min,将沉淀悬于含0.05%N P -40的细胞裂解液中至原体积,加等体积的无关杂交瘤细胞培养上清,冰浴30min ,用细胞裂解液洗涤3次,再以1/2原体积裂解液悬浮,终浓度为20%。将等体积S AC 加到裂解上清中,冰浴2h,4℃12000r /min 离心15min ,小心取出上清保存备用。 1.3.3 抗原抗体复合物的形成 将细胞裂解上清(抗原)分为两等份,置于微量离心管中(3×106 细胞),各加入N ET-明胶缓冲液(50 — 678—第23卷 第6期1997年 白 求 恩 医 科 大 学 学 报J .N.BET HU N E U N IV.M ED.SCI. V ol.23 N o.6 1997
蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选
第46卷 第6期吉林大学学报(理学版) Vol .46 No .6 2008年11月JOURNAL OF J I L I N UN I V ERSI TY (SC I E NCE E D I TI O N ) Nov 2008 蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21的中药抑制剂筛选 李婉南1 ,李 莹1 ,庄 妍1 ,李 贺1 ,陈颖丽2 ,赵志壮 1,3 ,付学奇 1 (1.吉林大学生命科学学院,长春130012;2.吉林省中医药科学院,长春130021; 3.美国俄克拉荷马大学健康科学中心,俄克拉荷马城73104,美国) 摘要:用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP 21催化结构域(ΔSHP 21)的质粒转化大肠杆菌,得到 ΔSHP 21的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP 21为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP 21具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其I C 50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.关键词:包含SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶1(SHP 21);中药;抑制剂;筛选中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:167125489(2008)0621211206 Screen i n g Traditi onal Chi n ese M edi ci n es for I nhi bitors of Prote i n Tyrosi n e Phosphat ase SHP 21 L IW an 2nan 1 ,L I Ying 1 ,ZHUANG Yan 1 ,L I He 1 ,CHEN Ying 2li 2 ,ZHAO Zhi 2zhuang 1,3 ,F U Xue 2qi 1 (1.College of L ife Sciences,J ilin U niversity,Changchun 130012,China; 2.A cade m y of Traditional Chinese M edicine and Herbs of J ilin P rovince,Changchun 130021,China; 3.Health Sciences Center ,O klaho m a U niversity,O klaho m a C ity 73104,USA ) Ab s trac t:W ith pT7as a vect or,ΔSHP 21,a recombinant p r otein containing the catalytic domain of p r otein tyr osine phos phatase SHP 21,was highly exp ressed in E .coli cells .The enzy me was further purified t o near homogeneity .W ith the purified recombinant enzy me as a target,aqueous extracts of 157traditi onal Chinese herb medicines were analyzed f or their abilities t o inhibit SHP 21.T wo most potent inhibit ors,na mely,cornel and dandeli on,were identified,and their I C 50values and inhibit ory types were further analyzed .This study thus established a good syste m t o screen inhibit ors of SHP 21and de monstrated the potential of traditi onal Chinese medicines in treat m ent of i m munol ogical diseases and diabetes . Key wo rd s:SH22containing tyr osine phos phatase 1(SHP 21);traditi onal Chinese herb;inhibit or;screening 收稿日期:2008201215. 作者简介:李婉南(1975～),女,汉族,博士,讲师,从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究,E 2mail:wyshshk@.联系人:付学奇(1960～),男,汉族,博士,教授,博士生导师,从事细胞信号传导与药物筛选的研究,E 2mail:fxq@jlu .edu .cn . 基金项目:吉林省科技发展计划项目基金(批准号:20060563;200705394;20080434). 蛋白质酪氨酸磷酸酶(Pr otein Tyr osine Phos phatase,PTPs )与蛋白质酪氨酸激酶(Pr otein Tyr osine Kinases,PTKs )协同作用,控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程,调节细胞生长发育,并在细胞信号传导过程中发挥重要作用 [1] ,许多生理和病理现象都与此相关 [2] .研究表明,一些疾病如某些癌症、糖尿 病、白血病、免疫缺陷病、努南氏综合症等正是由于PTPs 的基因突变或异常表达导致的[3,4] ,因此 PTPs 已经成为继PTKs 之后又一个热门的研究领域.SHP 21(SH22Containing Tyr osine Phos phatase 1),又称为HCP,SHPTP1或PTP1C,是含有SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
抗体
摘要 和哺乳动物的免疫球蛋白比较，就现实而言鸡的免疫球蛋白更有优势。这个研究中，两个质粒被构建用来来自一个鸡的杂交体重组鸡免疫球蛋白的表达。首先是轻链的表达，和在羧基末端用组氨酸标记的重链的表达。在重组体鸡免疫球蛋白基因转染到中华仓鼠卵巢细胞之后，就可以选择出一个可分泌特定抗体指定的HF33的转染体。HF33细胞能以每天每106个细胞产生 10~15mg的带有组氨酸标记的免疫球蛋白。在Western免疫印迹分析中，重组的免疫球蛋白由于一条H链的条带和两条L链的条带而被检测到。这个重组免疫球蛋白在一个利用？？步骤中被成功的纯化。这些结果显示，目前的重组鸡卵黄抗体对进一步的应用是有作用的。 2005，国际生物组织，由Elsevier Ltd 出版。 关键词：重组抗体；鸡；免疫球蛋白Y，CHO 1.引言 鸡卵黄抗体在各种免疫反应中更有于哺乳动物的免疫球蛋白，因为它不和蛋白A，蛋白G以及类风湿因子反应。进一步讲，它不激活哺乳动物的免疫系统，这个免疫系统可以在酶联免疫吸附试验中对减少血清标本干扰酶的方面更突出。免疫球蛋白Y抗体已被证明在诊断、异种移植和抗生素替代疗法等应用中更有优势。我们最近利用细胞融合技术和噬菌体表面表达技术生产出大量的可以识别阮病毒的鸡单克隆抗体，我们还生产出chickenehuman嵌合抗体。尽管单克隆抗体的使用导致了广泛的研究领域的巨大进展，杂交鸡抗体生产水平相对较低。这样的生产水平低，适合实验室使用，但严重地限制了鸡单克隆抗体的潜在的工业应用。保守的哺乳动物分子已知少通常用于immuni - zation用于哺乳动物的免疫原性。另一方面，鸡在对于这些蛋白的特异性抗体的发展是有益的，因为它位于不同于哺乳动物进化树的分枝，有更高的抗体生产潜力。例如，在不使用朊蛋白基因敲除的小鼠时，很难产生对哺乳动物朊蛋白单克隆抗体分子，因为在哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列同源性超过84％。一步纯化鸡卵黄抗体是不容易的，因为鸡卵黄蛋白抗体并不和蛋白A或蛋白G结合，和哺乳动物免疫球蛋白比较，它在酸性或碱性条件下更敏感。在简化纯化和增加免疫球蛋白产量努力中，我们尝试用组氨酸标记来构建两个质粒以表达重组鸡卵黄抗体。用镍亲和层析柱可一步纯化的重组免疫球蛋白，产生于培养的哺乳动物细胞。在这里，我们显示了重组鸡卵黄抗体的作用。 2.材料和方法 2.1.细胞和介质 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞于37摄氏度5%的二氧化氮下保存在含有10％胎牛血清的F12 介质中。鸡杂交瘤细胞，HUC2 - 13 [11]，它可以产生特定朊蛋白抗体，在38.5摄氏度5%的二氧化碳下保存于在Iscove的修订贝科的含10％胎牛血清介质中。 2.2.cDNA的合成 根据制造商的指示，使用Isogen- LS型（日本大学，日本）协议，总RNA是从HUC2 - 13杂交瘤细胞中提取的。cDNA的第一条链是用12-18个寡聚T的引物来合成的。 2.3.轻链基因的克隆 编码鸡卵黄球蛋白抗体轻链的DNA片段可用KOD DNA聚合酶通过PCR扩增，使用 HUC2-VLF3(5#-A TA TA TAAGCTTGCCA TGGCCTGGGCTCCTCTCCT-3#)和 HUC2-VLR1(5#-TCTCTAGA TTAGCACTCGGACCTCTTCAG-3#)作为引物，以合成大小的cDNA 作为模板。这些引物包含有HindIII and XbaI的限制性酶切位点，可以退火到头部的氨基末端区域和位于IgY轻链基因的C1的羧基末端区域。扩增的PCR片段可以被HindIII and XbaI 处理，然后插入到pBluescript II SK相同的位点。这些克隆片段的序列就可以根据已知的HUC2-VLF3和种系的序列确定出。这些轻链基因片段再次用HindIII and XbaI处理，然后连接到位于表达载体的人居细胞病毒下游的相同位点上。这些表达蛋白既没有组氨酸标记，也没有myc基因表位，因为PCR 片段包含有一个终止密码子。 2.4.重链基因的克隆 编码重组IgY重链的DNA片段可以用Taq DNA聚合酶的PCR产生，在GC buffer中使用 HUC2-HF4(5#-TTGGTACCACCA TGAGCCCACTCGTCTCC-3#)and
蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶 蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）是细胞增殖和信号传导的调节过程中，调节蛋白酪氨酸残基磷酸化水平的酶家族。PTP 和蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）及其各自相应的底物协同作用，形成一个复杂的信号传导网络，通过调控蛋白氨基酸残基的磷酸化水平，调节生物体内细胞的生长、分化、代谢过程，参与细胞周期调控、细胞迁移、基因转录和免疫应答等过程。目前的研究发现人类共有112 种PTPs，依据它们的结构分为酪氨酸特异性、双特异性和低分子量磷酸酶，其中蛋白酪氨酸磷酸酶-1B （Protein Tyrosine Phos－phatase-1B，PTP-1B）于1988 年由Tonks 等首次在人的胎盘细胞中分离和纯化得到，属于酪氨酸特异性磷酸酶，依据受体结构可分为受体样PTP-1B 和胞内PTP-1B。PTP-1B 专一水解芳香族磷酸，由435 个氨基酸残基组成，分子量约50ku。其结构中有一个氨基末端催化区和两个富含脯氨酸的模序。PTP-1B 在肌肉、心、肝、睾丸、肾、脾、脑和脂肪等组织中广泛表达，主要集中在细胞浆的内质网的表面。PTP-1B 的N 端为包含半胱氨酸和精氨酸残基的催化中心，朝向胞浆方向；C 端通过35 个特异性氨基酸与内质网相结合，羧基末端水解断裂后从内质网释放出有活性的PTP1B；N 端和C 端之间为两段富含脯氨酸的区域，在PTP1B 与其他蛋白之间的相互作用上发挥重要作用。 PTP-1B DNA 的启动子上有一个转录因子Y 盒结合蛋白-1 的结合位点，它的过度表达可使PTP-1B 的表达水平增加。使用反义寡核苷酸技术减少其表达后，PTP-1B 的表达随之降低，呈正相关趋势。 PTP-1B 在体内没有自身的特异性受体，而是在细胞信号传导过程中，与PTP 家族中的其他成员以及蛋白酪氨酸激酶协同作用，调控蛋白底物中酪氨酸的磷酸化水平，进而对细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等功能进行调节。 1 PTP-1B 的生理功能 目前研究发现PTP-1B主要表现出以下几个方面的生理功能： （1）与胰岛素受体（insulin receptor ，IR）、胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）等信号蛋白作用，使这些蛋白调节区的酪氨酸残基去磷酸化，进而阻断胰岛素信号级联反应的下传，在胰岛素信号中起着负调控作用。与II 型糖尿病的发生具有密切的联系。 （2）在瘦素信号传导过程中，通过降低转录激活子-3（STAT-3）和Janus 激酶-2（JAK-2）的磷酸化水平，在瘦素信号中起负调控作用。与肥胖的发生具有密切的联系。 （3）PTP-1B 通过与生长因子等底物相互作用，参与细胞生长周期的调节，与肿瘤的发生具有一定的联系。 除此之外，研究还发现PTP-1B 在催乳素信号传导、血小板凝集等方面具有一定的影响。 2 PTP-1B 与糖尿病之间的关系 糖尿病是一类慢性代谢性疾病，随着生活水平的提高，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势，成为继心脑血管疾病及癌症之后，威胁人类健康的第三大类疾病。目前已有约 3 亿糖尿病患者，到2030 年，预计患者人数将突破5 亿。根据糖尿病的发病机制，糖尿病可分为I 型糖尿病和II 型糖尿病，其中II 型糖尿病患者超过糖尿病患者总数的80%，主要表现为胰岛素抵抗或胰岛素受体不敏感，分泌胰岛素的胰腺B 细胞数量减少，功能障碍，从而导致糖代谢障碍，血糖水平升高。对PTP-1B 生理功能的研究已经证实，其与胰岛素及瘦素信号传导呈负调节关系，因此PTP-1B 与II 型糖尿病的发病原因关系密切，是开发II 型糖尿病治疗药物的重要靶点之一。 2.1 PTP-1B 胰岛素抵抗：代谢过程中，胰岛素可与脂肪、骨骼肌、肝细胞等细胞的细胞膜上的胰岛素受体胞外亚基结合，进而使受体胞内亚基酪氨酸激酶活化，导致自身及其底物
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
抗酪氨酸磷酸酶抗体IgG测定试剂盒(直接化学发光法)产品技术要求北京乐普医疗科技
抗酪氨酸磷酸酶抗体IgG测定试剂盒（直接化学发光法） 适用范围：用于体外定量测定人血清样本中抗酪氨酸磷酸酶抗体（Anti-IA2）IgG 的含量。 1.1 包装规格 25测试/盒、2×25测试/盒、50测试/盒、2×50测试/盒、100测试/盒、200测试/盒。 1.2 主要组成成分 试剂盒主要组分见表1。 表1 试剂盒组成及主要成分
批特异性：各批校准品浓度、质控品的质控范围具有特异性，详见瓶签。
以上校准品（选配1）、校准品（选配2）须选择一项获取校准信息。 2.1 物理性状 2.1.1外观 本试剂盒中的组分齐全、完整，液体试剂澄清，无异物、沉淀物、絮状物和无渗漏；磁分离试剂摇匀后，应为均匀悬浊液，无明显凝集；各组分标签字迹清晰、无破损。校准品、质控品应为淡黄色至无色液体。 2.1.2 装量 液体装量应不少于标示值。 2.2 检出限 检出限应不大于2 IU/mL。 2.3线性 在[2，100]IU/mL范围内，线性相关系数(r)应不低于0.9900。 2.4 准确度 用抗酪氨酸磷酸酶抗体国际标准品(编号：NIBSC 97/550)作为样本进行检测，测定结果与靶值的相对偏差应在±15.0%范围内。 2.5 重复性 检测高、低两个浓度的样本，每个样本各重复检测10次，变异系数（CV）应不大于10.0%。 2.6批间差 用3个批号试剂盒分别检测高、低两个浓度的样本，则3个批号试剂盒之间的变异系数（CV）应不大于15.0%。 2.7 特异性
检测如表2中相应浓度的交叉反应物，抗酪氨酸磷酸酶抗体测定浓度应小于 2 IU/mL。 表2 交叉反应物浓度 2.8 校准品、质控品重复性 2.8.1 校准品变异系数（CV）应不高于10%。 2.8.2 质控品变异系数（CV）应不高于10%。 2.9 质控品赋值有效性 质控品测定结果应在本试剂盒规定的范围内。 2.10 溯源性 应根据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》提供所用校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容，本产品校准品溯源至抗酪氨酸磷酸酶抗体国际标准品（编号：NIBSC 97/550）。 2.11 稳定性 2.11.1 效期稳定性 将试剂盒在2℃～8℃的环境中放置12个月后，取到期后的试剂盒分别检测2.2、2.3、2.4、2.5、2.7、2.8、2.9项，结果应符合各项目的要求。 2.11.2 校准品、质控品开瓶稳定性