引物设计原则(必看)

mi 引物设计原则

1、引物得长度一般为15-30 bp,常用得就是18-27 bp,但不应大于38,由于过长会导致其延长温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进展反响。

2、引物序列在模板内应当没有相像性较高,尤其就是3’端相像性较高得序列,否则简洁导致错配。引物3’端消灭 3 个以上得连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。

3、引物3’端得末位碱基对Taq 酶得DNA 合成效率有较大得影响。不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率,末位碱基为 A 得错配效率明显高于其她 3 个碱基,因此应当避开在引物得3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹构造也可能导致PCR 反响失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。

4、引物序列得GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反响。上下游引物得GC 含量不能相差太大。

5、引物所对应模板位置序列得Tm 值在72℃左右可使复性条件最正确。Tm 值得计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo 软件中使用得就是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6、ΔG值就是指DNA 双链形成所需得自由能,该值反映了双链构造内部碱基对得相对稳定性。应中选用3’端ΔG值较低(确定值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高得引物。引物得3’端得ΔG值过高,简洁在错配位点形成双链构造并引发DNA 聚合反响。

7、引物二聚体及发夹构造得能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反响不能正常进展。

8、对引物得修饰一般就是在5’端增加酶切位点,应依据下一步试验中要插入PCR 产物得载体得相应序列而确定。

引物序列应当都就是写成5-3 方向得,

Tm 之间得差异最好掌握在1 度之内,

另外我觉得扩增长度大一些比较好,500bp 左右。

要设计引物首先要找到DNA 序列得保守区。同时应推测将要扩增得片段单链就是否形成二级构造。如这个区域单链能形成二级构造,就要避开它。如这一段不

能形成二级构造,那就可以在这一区域设计引物。

① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级构造。

③ 引物长度一般在15~30 碱基之间。④ G+C 含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4 个碱基得互补。⑦ 引物之间不能有连续4 个碱基得互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不行修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子得第3 位。

1、引物得特异性引物与非特异扩增序列得同源性不要超过70%或有连续8 个互补碱基同源。

2、避开产物得二级构造区某些引物无效得主要缘由就是引物重复区DNA二级构造得影响,选择扩增片段时最好避开二级构造区域。用有关计算机软件可以推测估量mRNA 得稳定二级构造,有助于选择模板。试验说明,待扩区域自由能(△G°) 小于58、6lkJ/mol 时,扩增往往不能成功。假设不能避开这一区域时,用7-deaza-2′- 脱氧GTP 取代dGTP 对扩增得成功就是有帮助得。

3、长度寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。引物得有效长

度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln 值不能大于38,由于>38 时,最适延长温度会超过Taq DNA 聚合酶得最适温度(74℃),不能保证产物得特异性。

4、G+C 含量G+C 含量一般为40%~60%。其Tm 值就是寡核苷酸得解链温度, 即在肯定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链得温度,有效启动温度,一般高于Tm 值5~10℃。假设按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估量引物得Tm 值,则有效引物

得Tm 为55~80℃,其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最正确。

5、碱根底随机分布引物中四种碱基得分布最好就是随机得,不要有聚嘌呤或聚嘧啶得存在。尤其3′端不应超过3 个连续得G 或C,因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。

6、引物自身引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状构造牙引物本身复性。这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合。假设用人工推断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7、引物之间两引物之间不应不互补性,尤应避开3′端得互补重叠以防引物二聚体得形成。一对引物间不应多于4 个连续碱基得同源性或互补性。

8、引物得3′端引物得延长就是从3′端开头得,不能进展任何修饰。3′端也不能有形成任何二级构造可能,除在特别得PCR(AS-PCR)反响中,引物3′端不能发生错

配。在标准PCR 反响体系中,用2U Taq DNA 聚合酶与800μmol/L dNTP(四种dNTP 各200μmol/L)以质粒(103 拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min 得循环参数扩增HIV-1gag基因区得条件下,引物3′端错配对扩增产物得影响就是有肯

定规律得。A∶A 错配使产量下降至1/20,A∶G 与C∶C 错七下降至1/100。引物A:模板G 与引物G:模板A 错配对PCR 影响就是等同得。9、引物得5′端引物

得5′端限定着PCR 产物得长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增得特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA 序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列与引入

一启动子序列等。10、密码子得简并如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密

码子得第3 位,因密码子得第3 位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。Hairpin 发卡构造

假设自由能值大于0 则该构造不稳定从而不会干扰反响假设自由能值小于0 则

该构造可以干扰反响

二聚体可以在序列一样得两条引物或正反向。引物之间形成假设配对区域在3

末端问题会更为严峻3 末端配对很简洁引起引物二聚

体扩增使

Pair Rating 匹配度评分匹配度低得引物对常常不太有效就是由于在同样退火温

度下Tm 低得引物打算扩增得特异性而Tm 高得引物更易于形成非特异性结合而造成错误得起始

【1】引物得长度以15－30bp 为宜,否则会影响扩增得特异性。

【2】】碱基尽可能随机分布,避开一样得碱基成串排列,引物得G+C 含量在40％

－60％之间,假设G+C 含量太低,可在5”端加上一些G 或C,假设G＋C 含量太高,可在

5”端加上一些A 或T。

【3】应避开每条引物内部形成二级构造及两条引物得3”端互补形成引物二聚体, 避开在引物得3”端有3 个G 或3 个C 成串排列,3”端得末位碱基最好选T、C、G, 而不选A,也有建议在引物得两端用1－2 个嘌呤碱基。

【4】尽可能使用两条引物得Tm 值一样(最好相差不要超过5℃),退火温度依据