PCR-实验原理

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实验七 PCR扩增技术

【实验试剂】
• • • • • • • • DNA模板; Taq酶，扩增缓冲液，ddH2O; 琼脂糖N; DNA分子量标准; 50TAE电泳缓冲液(储存液); 6*loading buffer; 溴化乙锭溶液(EB)：0.5 mg/ml；管里按以下比例配置50 l反应体系： • 模板DNA0.5 l • 上游引物1 l • 下游引物1 l • 10扩增缓冲液5 l • dNTP4 l • Taq酶0.5 l • ddH2O38 l
【注意事项】
• • PCR反应灵敏度很高，为了防止污染，使用的 0.2 ml的PCR薄壁管和吸头都应该是无污染的。加试剂前，应短暂离心10 s，然后再打开试剂的管盖，以防止污染试剂。配置PCR反应体系时，Taq酶应该最后加入。使用工具酶的操作必须在冰浴的条件下进行，使用后应立即将工具酶放回冰箱。
• 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 • 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：将PCR反应的试管与反应板紧贴。

当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在的PCR管中不能均匀传热。

不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR 反应中可能缺少游离的Mg2+。

检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

检查模板和引物的用量。

增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。

提高退火温度，但不要超过68℃。

重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：建议使用薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

大多数反应中，（~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

建议使用L MgCl2∶350mmol/L dNTP或L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。

然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。

因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。

DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。

请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。

PCR原理及过程

PCR技术原理、实验步骤和应用来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

PCR技术原理、实验步骤和应用

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。

实验十PCR扩增DNA

实验三PCR扩增DNA【实验目的】1．掌握PCR扩增DNA的技术及原理2．学习PCR扩增仪的使用【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外DNA扩增技术，1985年由Mullis等人创立。

该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点，目前已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段，另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。

PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。

PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。

反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。

PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。

这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。

PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。

常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95℃，复性温度为37℃～55℃，延伸合成温度为72℃，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），反应循环数为30。

【实验材料】1.实验器材PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，经高压灭菌后的Eppendorf管，电泳仪。

2.实验试剂（1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙签挑取单菌落悬浮到50µl的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95℃温浴10分钟, 10000rpm离心5分钟,取2µl上清液用于总体积50µl的PCR反应。

PCR实验：扩增某种基因序列

PCR实验：扩增某种基因序列实验名称：PCR实验——扩增某种基因序列实验原理：PCR技术利用DNA聚合酶（Taq polymerase）在特定条件下，在模板DNA的引导下，逐渐扩增目的DNA片段，使其从极少的数量增加到可以检测的程度。

PCR反应可以扩增目标DNA，也可以进行基因定量和基因分型等应用。

实验步骤：1.根据要扩增的基因序列设计引物，引物序列应与目标基因的两端互补。

一般引物长度为18-24个碱基。

2.准备PCR反应体系，按照以下比例加入试管中：模板DNA：10 ng/μl；引物：0.2 μmol/L；Taq polymerase：1.25 U/50 μl；dNTPs：0.2 mmol/L；PCR缓冲液：1×；MgCl2：1.5 mmol/L；水：加至50 μl3.加入模板DNA，引物，dNTPs，PCR缓冲液，MgCl2和水，混匀。

4.放入热循环仪，进行PCR扩增。

PCR反应条件如下：预变性：94℃，5 min 反应循环：94℃，30 s 50-60℃，30 s （引物退火）72℃，30 s-2 min（延长PCR产物）循环次数：20-40次终止延伸：72℃，10 min 保存：4℃或-20℃5.取出PCR反应管，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

将PCR产物和DNA分子量标记（marker）一起进行琼脂糖凝胶电泳，观察PCR产物大小和带型。

根据产物大小和标记带大小，可以判断PCR反应是否成功，并计算出目标基因的大小。

6.如果需要测序，可以将PCR产物纯化后送测序。

注意事项：1.实验室应该保持清洁，避免污染DNA样品。

2.实验前应该准备好试剂和器材，避免出现时间延误。

3.引物的设计应该准确，长度应该合适，否则可能会影响PCR扩增的结果。

4.PCR反应条件应该严格控制，避免过度扩增或反应时间不足。

5.电泳实验时，应该注意安全，避免电流反转、漏电等事故发生。

6.电泳后，试管和电泳仪都要彻底清洗干净，避免污染实验器材。

PCR技术原理实验步骤和应用

PCR技术原理实验步骤和应用PCR(聚合酶链式反应)是一种体外复制DNA的技术。

它是通过复制DNA片段的方式，将少量的DNA扩增成数百万份，以供后续实验使用。

PCR技术的原理、实验步骤和应用如下所述。

一、PCR技术原理：1.变性：在这一步骤中，DNA样本被加热至高温（95-98°C），使双链DNA变为单链DNA。

这一步将断裂氢键，使双链分离。

2.退火：在这一步骤中，PCR反应混液降温至适宜的温度（55-72°C），引入一对特异性引物。

引物是短的DNA片段，它们被设计成与所要扩增的DNA片段的两个互补序列相匹配。

3.延伸：在这一步骤中，混合物再次升温至酶的最佳工作温度（72°C），以便DNA聚合酶可以结合到引物的3'末端，并以引物作为模板合成其互补链。

这个步骤会在每个引物上生成新的DNA链，并将引物的3'末端作为延伸的起始位点。

通过重复这个循环，PCR可以迅速和大量地复制DNA片段。

每周期（cycle）都会形成一倍的DNA数目。

根据PCR循环数的增加，DNA的数量呈指数性增加。

这种复制DNA的方式使得科学家能够扩增特定的DNA片段。

二、PCR技术实验步骤：PCR实验的主要步骤包括：2.准备PCR反应混合液：PCR反应混合液包括模板DNA、引物、DNA 聚合酶、缓冲液、MgCl2、dNTPs等。

这些成分的比例需要根据具体实验的要求进行调整，以确保最佳的反应条件。

3.设置PCR反应程序：根据所需的PCR循环数和反应条件，设置PCR 反应程序。

这涉及到变性、退火和延伸步骤的温度和时间等参数。

4.进行PCR扩增：将PCR反应混合液加载到热循环仪中，进行PCR扩增反应。

热循环仪会自动进行循环升温和降温操作，以完成PCR循环的过程。

5.分析PCR产物：通过凝胶电泳、实时荧光PCR或测序等方法，分析PCR反应产物的大小、纯度和数量等。

6.保存PCR产物：PCR产物可以储存以备后续实验使用，如测序、克隆、表达等。

pcr反应实验报告

pcr反应实验报告篇一：聚合酶链式反应PCR实验报告实验二聚合酶链式反应（PCR）一、实验原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。

它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。

从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。

二、器材与试剂1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪2.试剂：引物，模板，T aq DNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液，DNA染料三、实验步骤PCR反应体系的建立取离心管，依次加入试剂混匀1．H2O 12μl2．模板1μl3．引物T7 1μl4．引物sp61μl5．2*PCRmix15μlPCR仪的热循环反应把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成1. 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2. 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3. 引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在T aqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复该循环30次，每次需要2-3分钟。

电泳检测结果扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。

四、讨论1. Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

PCR-SSCP实验原理和操作步骤

PCR-SSCP实验原理和操作步骤(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism)【实验目的】1．了解PCR-SSCP技术的原理。

2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。

【实验原理】PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。

它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。

PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。

PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。

其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。

因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。

目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。

单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。

因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。

PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。

【实验用品】1．PCR扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。

2．6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49：1）、1´TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。

pcr实验的基本原理

pcr实验的基本原理
PCR，全称为聚合酶链式反应，是一种在生物体外复制特定DNA的实验技术。

其基本原理是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度
至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物、DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。

然而，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA
聚合酶，这不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。

医学实验pcr检验实验报告

医学实验pcr检验实验报告标题：PCR检验实验报告引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增DNA片段，并能够在非常小的样本中检测RNA或DNA的存在。

本报告旨在介绍PCR 检验实验的原理、步骤和结果分析。

一、实验原理：PCR是通过不断重复三个步骤来扩增DNA片段的方法。

这三个步骤是变性、退火和延伸。

首先将待扩增的DNA样本变性，使其双链DNA分离为两个单链DNA。

然后，通过引物（primer）与DNA单链的互补序列结合，使引物与DNA序列配对。

最后，使用DNA聚合酶在引物的指导下合成新的DNA链。

通过不断重复这三个步骤，可以在很短的时间内扩增出大量的特定DNA片段。

二、实验步骤：1. DNA提取：从待检测的样本中提取DNA，常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、热沉淀法等。

2. 反应体系配置：根据实验需求，在试管中配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液等。

3. PCR反应：使用热循环仪进行PCR反应，设置好反应的温度和时间，常见的PCR程序一般包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。

4. 凝胶电泳：将PCR反应体系中的产物进行凝胶电泳分析，以确定扩增的DNA 片段大小和纯度。

三、实验结果分析：1. 扩增曲线分析：观察PCR反应的扩增曲线，根据曲线形状和峰值大小判断PCR反应的效果。

2. 凝胶电泳结果分析：通过凝胶电泳分析PCR产物，可以确定扩增的DNA片段的大小和数量。

3. 阳性对照和阴性对照：设置阳性对照和阴性对照可以判断PCR反应体系的可靠性和准确性。

结论：PCR是一种常用的分子生物学技术，可以迅速高效地扩增DNA片段。

通过实验原理的介绍和实验步骤的详细说明，我们可以掌握PCR实验的基本操作方法。

实验结果的分析和结论部分，可以根据实际实验情况进行详细的阐述，包括扩增曲线、凝胶电泳结果等。

实验报告的撰写应该科学准确、简明扼要，以便他人能够理解和重复实验。

实验六目的基因的PCR扩增

PCR引物设计
AKP CDS
554......2038
引物1 5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’
BamH1
CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…
…………………………………………………………………………. ……
……………………………………………………………………………….
二、实验原理
三、实验仪器与试剂
1 、仪器： PCR 热循环仪、台式离心机、微量移液器、吸头、电泳设备等。
2 、试剂：10x PCR buffer、dNTPs（25mM）、Taq
酶（5u/μl）、引物1和2( 10 pmol/ul) 、模板DNA、 ddH2O、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、等。
七、引物设计原则
⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与模板DNA一定要配对，另外 3′末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。
八、注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。 1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
引物2
HindⅢ 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

pcr扩增的原理和步骤以及常见问题

P C R实验原理及步骤PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

实验方法原理①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR反应体系10×扩增缓冲液10 ul4种dNTP混合物各200 umol/L引物各10～100 pmol模板DNA 0.1～2 ugTaq DNA聚合酶 2.5 uMg2+ 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 100 ul模板制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。

也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。

法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

PCR反应条件控制1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。

2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。

PCR原理及注意事项

PCR原理及注意事项PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在分子生物学领域中广泛使用的技术，用于扩增目标DNA片段或基因。

PCR技术通过不断重复一系列的温度循环，结合特定的引物和DNA聚合酶来实现DNA的扩增。

以下是PCR原理和注意事项的详细介绍。

PCR是一种体外的DNA扩增技术，可以从极少量的DNA样本中扩增出大量的DNA片段，从而方便进行进一步研究。

PCR反应通常涉及三个步骤：变性、退火和延伸。

1. 变性（Denaturation）：将DNA样本加热至94-98°C，以断开双链DNA，使其形成两条单链。

2. 退火（Annealing）：将反应温度降至50-65°C，使引物与目标DNA序列特异性结合。

引物是短DNA片段，可以绑定到目标DNA序列的两端。

3. 延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（例如Taq聚合酶）在引物的引导下，在目标DNA上合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。

通过不断重复这个PCR循环，每个循环将目标DNA段扩增一倍，扩增的DNA量呈指数增长，最终得到大量目标DNA。

PCR注意事项：1.基本操作规范：为了防止DNA污染和混合，实施PCR反应时，需要使用无菌试剂和工作区域，并避免接触空气中的DNA。

2.设计引物：合适的引物是PCR成功的关键。

引物应具有良好的特异性，并且序列不应内部重叠或与其他非目标DNA序列互补。

引物的长度通常在18到30个碱基对之间。

3.防止污染：特别注意防止污染的问题，尤其是在引物制备和样本准备过程中。

使用无菌技术并采取防污染措施，例如使用不同的实验室器皿和耗材，避免交叉污染。

4.合适的PCR缓冲液和酶：选择适合实验需求的PCR缓冲液和酶。

不同的PCR缓冲液和酶在反应条件和扩增效率上可能有所不同。

确保合适的成分浓度和酶的稳定性。

5.DNA模板的纯度：为了提高PCR反应的效率和特异性，DNA模板的纯度至关重要。

PCR技术原理及实验操作

DNA 长度标准曲线
4. 电泳缓冲液
Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(
凝胶制备时一定要使用电泳缓冲液
5. 样品制备
DNA 样品
每条带>100ng
上样缓冲液
50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青
作用：上色；沉降
点样
PCR的反应体系
标准的PCR反应体系
10X 扩增缓冲液： 5μl
模板DNA:
0.1~2μg
引物：
各0.2~1μmol/L
4种dNTP: 各200μmol/L
Mg2+
Taq DNAU
ddH2O 总体积：
补齐 50μl
可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化
按照实验方案进行即可
分离鉴定纯度测定分子量
凝胶电泳的种类
琼脂糖凝胶电泳(✓) 聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
分离核酸原理操作要点应用范围
（一）分离核酸原理
电荷效应分子筛效应分子构象
1. 电荷效应
核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 ~8.3 , 负电荷，向正极移动
时间由扩增片段的长度决定
1min扩增1KB
循环次数：主要取决于模板DNA的浓度次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加
第二节凝胶电泳
(gel electrophoresis)
电泳概念基本原理
μ＝
Q 6πrη
μ: 迁移率
Q : 电荷量
r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度
电泳的用途

PCR基因扩增原理

PCR 基因扩增实验原理﹑仪器试剂和操作步骤实验原理：PCR(Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。

其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。

这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。

1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。

2.退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。

引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。

现将几种主要影响因素介绍如下。

一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。

如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。

实验目的掌握PCR原理熟悉PCR的基本操作

2）引物设计上的基本原则：
a: 一般为20~30 bp；
b: G+C含量：应在45%~55%之间；
c: 碱基分布的随机性；
d: 引物自身：不能含有自身互补序列；
e: 引物之间：两个引物之间不形成引物二聚体；
f: 特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于 10%，或少于连续8个互补碱基；
g: 引物的3’端：3’端不应发生错配；
反应体系 10×buffer 4×dNTPs（10μM each）模板正向引物反向引物
Taq 聚合酶
标准加入量（μl）实际加入量（μl）
2.0
6
0.4
4
1.0
1
0.8
3
0.8
3
0.3
3
ddH2O
14.7
0
2．PCR扩增反应按下列程序，在DNA扩增仪上进行反应。
94℃ 3 min (预变性)；94℃ 40 s, 52℃ 40 s,72℃ 40s, 35个循环，72℃ 10 min(再延伸)；4℃保存。
缺点：反应温度为37℃
2）Taq DNA 聚合酶：最初是从美国黄石国家公园的一个温泉中发现的一种嗜热菌—— 水生栖热菌（Thermus aquatics）YT菌株中分离而得。此酶的最适作用温度为72℃。
（四）循环参数
1．变性温度和时间原则上变性步骤应高温，短时，既要保证变性充
分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。 2．退火温度：
实验五聚合酶链式反应PCR
实验目的 1. 掌握PCR原理； 2. 熟悉PCR的基本操作。
（二）基本原理
1．PCR的特征：能大量扩增特定序列，引物结合位置将决定扩
增的DNA序列。 2．PCR包括3个热循环过程：

pcr步骤原理

pcr步骤原理
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外扩增DNA序列的技术，它采用了DNA的复制原理，通过DNA聚合酶的催化作用，将目标DNA序列扩增至数百万个复制物，从而使得该序列可以被检测和分析。

PCR的步骤包括：变性、退火和延伸。

变性是PCR的第一步，其目的是将DNA双链解开，获取单链DNA模板。

这一步的关键在于将混合物中的DNA加热到94-98°C，使DNA的氢键断裂，从而导致两条DNA链分离。

退火是PCR的第二步，它涉及到引物的结合和DNA的扩增。

在这一步中，混合物中的温度被降低至50-65°C，引物可以与目标DNA序列的互补部分结合，形成引物-模板复合物。

引物的设计至关重要，因为它们需要与目标序列的特定区域互补，以确保PCR成功扩增目标序列。

延伸是PCR的最后一步，也是最重要的一步。

在这一步中，DNA聚合酶通过加入新的碱基，将引物与DNA模板扩增为两条新的双链DNA。

延伸的温度通常在72°C左右，因为此时DNA聚合酶的活性最高。

该步骤的重复进行多次，可以使扩增的DNA数量成指数倍增加。

通过精确控制每个步骤的时间和温度，PCR技术可以在几小时内扩增出特定的DNA片段。

这使得PCR成为了现代分子生物学中最重要的实验技术之一。