PCR-实验原理

PCR反应的基本成分
模板DNA（待扩增DNA） 引物 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 适宜的缓冲溶液
适宜的缓冲溶液
成分：50mmol/L KCl、10mmol/L TRIS-Cl
、1.5mmol/L MgCl2、100μ g/ml明胶、 0.25μ mol/L的引物、200μ mol/LdNTP、 25U的Taq酶和DNA样品 作用：提供适合聚合酶行使功能的化学环 境
PCR的反应动力学
n Y=(1+X)
Y——DNA片段扩增后的拷贝数 X——平均每次的扩增率 n——循环次数
体外PCR 扩增和体内DNA 复制
PCR单链多态性分析
单链构像多态性(SSCP)：是指单链DNA 在 溶液中形成立体构象，等长的DNA 片段因 其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同， 形成的构像不同，在非变性PAGE时表现为 电泳速度的差别。 PCR-SSCP:在完成靶DNA的PCR扩增之后进 行的单链DNA多态性分析的一种新方法。 检测方法：中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳
小结
基本成分 模板DNA（待扩增DNA） 引物 4种脱氧核苷酸 作用 含有需要扩增的DNA片断 决定了需要扩增的起始和 终止位置 用于构造新的互补链。
DNA聚合酶
适宜的缓冲溶液
复制需要扩增的区域。
提供适合聚合酶行使功
能的化学环境
PCR的反应条件
反应条件：温度、时间和循环次数 温度：双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至 40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快 速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用 下，使引物链沿模板延伸。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循 环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环 次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异 性产物的量亦随之增多
聚合酶链反应（PCR）
实验原理
PCR技术的基本原理
利用DNA聚合酶，依赖DNA模板的特性，
模仿体内的复制过程，在附加的一对引物 之间引发的聚合酶链反应。
PCR反应的基本成分
模板DNA（待扩增DNA） 引物 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 适宜的缓冲溶液
PCR引物
引物是人工合成的短DNA片断。它们与所 要扩增的DNA片断的起始和终止区来自百度文库完全 互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板 的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两 个位置，开始合成新的DNA链。 作用：引物决定了需要扩增的起始和终止 位置。
PCR反应的基本成分
模板DNA（待扩增DNA） 引物 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 适宜的缓冲溶液
脱氧单核苷酸（dNTP）
作用：用于构造新的互补链
PCR反应的基本成分
模板DNA（待扩增DNA） 引物 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 适宜的缓冲溶液
DNA聚合酶—Taq DNA聚合酶
特性：（1）具有95℃以上的耐热性 （2） Mg2+依赖性酶 作用：催化转录