青花菜BZR1、BES1转录因子的克隆与功能分析

青花菜BZR1、BES1转录因子的克隆与功能分析青花菜(Brassica oleracea var.italica)是发达国家进口量最大的蔬菜之一,含有迄今为止在蔬菜中发现的抗癌活性最强的天然活性物质—萝卜硫素(Sulforaphane)。萝卜硫素的合成前体是芥子油苷(Glucosinolate),是一种含氮和硫的次生代谢物,其广泛存在于十字花科植物中,对植物响应生物或非生物胁迫具有很重要的作用,且其部分降解产物对人体具有很强的保健功能。

因此,其合成调控分子生物学近年来逐渐成为研究热点。油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)作为植物特有的一类类固醇激素,广泛参与植物生长发育和响应环境的过程。

BZR1(brassinazole-resistant 1)和BES1(BRI1-EMS-suppressor)是油菜素内酯信号转导途径中的两个重要转录因子,已在拟南芥中证实油菜素内酯可以通过BZR1和BES1抑制植物体内芥子油苷的生物合成。萝卜硫素和芥子油苷在青花菜中含量最为丰富,BZR1和BES1转录因子是否影响其在青花菜中的合成以及如何影响?目前尚不清楚。

为此,本研究从青花菜中克隆了 BZR1和BES1基因,并进一步分析了其表达模式和功能,主要研究结果如下:(1)根据青花菜同属(芸苔属)物种的BZR1和BES1转录因子核苷酸序列,设计特异性引物,通过RT-PCR技术,从高萝卜硫素青花菜"福青1号"叶片cDNA中扩增得到油菜素内酯信号转导途径中的转录因子BZR1和BES1的同源序列,其长度分别为993bp、1011bp,分别编码330和336个氨基酸,并分别命名为BoBZR1和BoBES1。生物信息学分析发现,克隆的这两个基因的核苷酸序列与NCBI上已登录的其他物种的同类基因相似性较高,含有典型的N末端结构域和C末端转录激活结构域。

初步确定它们为青花菜BoBZR1和BoBES1基因。(2)分别构建了BoBZR 和BoBES1基因的亚细胞定位载体pEGAD-BoBZR1和pEGAD-BoBES1,并转化本氏烟草中进行瞬时表达。

结果表明,BoBZR1和BoBES1蛋白定位在几乎整个细胞中,当外源喷施BR后,融合蛋白全部集中在核内,表明植物细胞接收到BR信号后,转录因子BoBES1和BoBZR1被激活,进入细胞核内部行使功能。(3)qRT-PCR分析表明,BoBZR1和BoBES1基因在根中表达量均最高,在花球中最少,在种子中几乎都检测不到。

当对其叶片进行外源喷施500 μM的甲基茉莉酸甲酯(MeJA)、5 mM的水杨酸(SA)和3 μM的BR后,青花菜中BZR1和BES1基因的表达量分别在处理24 h、8 h、24 h后达到最大值;在处理48 h后,除了 BR处理组的基因表达量稍微降低,其他两种处理均趋于初始状态。(4)构建了以35S启动子驱动BoBZR1和BoBES1基因表达的植物超表达载体pBI-BoBZR1和pBI-BoBES1,并转化到野生型拟南芥Col-0中。

对T3代转基因拟南芥纯合体的表型分析和芥子油苷含量检测发现:两种基因超表达植株均出现植株矮小以及发育迟缓的表型,而BoBES1基因超表达受到的影响更大,叶片变小且出现卷叶。与野生型拟南芥Col-0相比,BoBZR1和BoBES1基因超表达都会降低拟南芥中短链脂肪族芥子油苷(3MSOP、4MSOB、5MSOP、4MTB)和长链脂肪族芥子油苷(8MSOO)的含量,其中BoBES1基因超表达显著降低拟南芥中芥子油苷的含量。

结果说明BoBZR1和BoBES1基因的表达对芥子油苷的合成具有显著的抑制作用。(5)构建了BoBZR 和BoBES1基因的干扰表达载体,并与上述超表达载体一起分别转化到青花菜中,已获得T0代抗性苗110株,其中转BZR1和BES1基因干扰

表达载体的植株分别28株和26株,转超表达载体的植株均28株。