第五章基因克隆技术
基因克隆技术
基因克隆技术从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作也称重组DNA技术，主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进行持续稳定的繁殖和表达。
第一节重组DNA技术回顾第二节DNA的基本操作技术第三节RNA的基本操作技术第四节基因克隆技术第五节基因芯片技术第六节蛋白质组学及其研究技术重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）又称为基因克隆（Gene Cloning）或分子克隆（Molecular Cloning）技术。
是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。
重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。
二、重组DNA技术的基本步骤①目的DNA的获得与载体的制备；②目的DNA与载体的连接；③重组DNA导入受体细胞；④重组DNA的筛选和鉴定；⑤目的DNA的表达及表达产物的检测与分离纯化。
三、重组DNA技术的四大要素目的DNA 载体（Vector）工具酶宿主细胞（一）目的基因（外源基因）的获取获得需要的目的基因常用的方法：1、分离的基因DNA片段或基因；2、mRNA逆转录合成的cDNA；3、化学合成人工目的基因；4、PCR体外扩增的DNA片段。
（二）载体载体载体(Vector)：是指能运载外源性DNA进入宿主细胞，并能进行自我复制的DNA。
1、载体分类----按功能分类：克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被大量扩增而设计的载体。
表达载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而设计的载体。
基因克隆和表达技术及其应用研究
基因克隆和表达技术及其应用研究在现代生物技术领域，基因克隆和表达技术被广泛应用于生物医药、农业生产、环境保护等多个领域，是一项重要的研究方向。
本文将介绍基因克隆和表达技术的原理、工具和应用，旨在深入探讨该技术在现代生物科技领域中的应用价值。
一、基因克隆的原理与工具基因克隆是指将目标DNA片段放入载体中，通过复制和传递，获得大量相同的DNA分子的过程。
基因克隆需要用到一系列工具和分子生物学技术。
其基本的步骤包括：DNA提取、限制酶切割、连接和转化等。
DNA提取是指从细胞中获取目标DNA，一般从细胞核中提取DNA样品。
限制酶切割是一种利用特定的限制酶将DNA切割成不同长度的碎片的技术。
连接是指将目标DNA片段与载体DNA进行配对，在适当的连接条件下会形成一个大的DNA分子，也称作重组DNA。
最后的转化是将重组DNA重新引入一个宿主细胞，使其进行繁殖。
这些步骤组成了一个典型的基因克隆工作流程。
在基因克隆中，一些关键工具也是必不可少的。
例如，限制酶和DNA连接酶是进行酶切和连接的酶类；载体是将目标DNA载入的载体分子。
当然，在实验设计过程中，也需要考虑到多种子序列的选择，以获得最优的结果。
二、基因表达技术基因表达技术是指将克隆好的基因转录和翻译为蛋白质的过程。
基因表达技术所涉及的核心部分主要为转染和转录。
转染是指将载体转化到目标细胞中的过程。
转染可以分为多次批量的直接转染和、转染载体的两种方式。
对于细胞质和细胞核分离的情况，病毒载体或质粒载体也可以被用来介导转录。
质粒载体在转录的时候需要被移入到细胞的核中，由此促进了 DNA 受体和 RNA聚合酶之间的相互作用。
另一种重要的基因表达技术是转录，也称作转录调节。
转录调节可以分为两类：正调节和负调节。
正调节是指通过上调特定基因的表达、促进特定转录的过程；负调节是指通过下调特定基因的表达、抑制特定转录的过程。
转录调节受到多种因素的影响，例如转录因子和超融合酶等分子的运作。
分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)精选全文完整版
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)
一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae 自主 复制能力的 DNA分子（ vector），如 病毒、噬菌体 和质粒等小分 子量复制子都 可以作为基因 导入的载体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记 实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using
5.1 重组DNA技术回顾 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆技术 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术
5.1 重组DNA技术回顾
三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体 是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
• 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
基因克隆技术名词解释
基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。
以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。
2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。
3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。
这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。
4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。
5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。
基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。
6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。
表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。
7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。
常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。
8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。
基因克隆技术的原理与方法
基因克隆技术的原理与方法在人类历史上，基因一直是科学家们探究的热点之一。
随着科技的不断发展，基因克隆技术逐渐被应用于生物医学和生命科学领域，成为这个领域的重要组成部分。
那么，基因克隆技术的原理和具体方法是什么呢？基因克隆技术的原理基因克隆技术是指通过分子生物学技术，将特定的DNA序列复制并扩增，最终得到大量相同的DNA片段的过程。
在这个过程中，使用的主要技术是PCR和DNA重组技术。
PCR（聚合酶链式反应）是一种将小段DNA片段扩增为大量DNA的技术。
它是一种非常高效的DNA复制方法，经过多次扩增可以得到数百万、数千万甚至数十亿倍的DNA。
DNA重组技术是一种将两个不同种类DNA片段组合成一个新的DNA分子的方法。
这个过程通常包括三个步骤：1）通过限制性内切酶切割DNA，得到特定的DNA片段；2）将这些DNA片段与载体DNA序列进行融合；3）通过转化或转染等方法将重组后的DNA引入宿主细胞中，让它开始复制。
利用PCR和DNA重组技术，科学家们可以快速扩增任何一种特定的DNA序列，或者将不同DNA序列进行组合重组，从而高效地制造出人工合成的DNA序列。
同时，这些技术还可实现基因靶向分析、疾病诊断、基因治疗等多种应用。
基因克隆技术的方法通过PCR和DNA重组技术，科学家们可以使用多种不同的方法实现基因克隆。
下面我们就来介绍一些常用的基因克隆方法。
1. 基本的基因克隆方法这种克隆方法包括PCR扩增和限制性内切酶切割，并且可以使用装载体如质粒或病毒来转化宿主细胞。
这种克隆方法常用于基因分析、疾病诊断中。
2. 聚合酶链式反应（PCR）法PCR法是一种基于DNA聚合酶在适当条件下的多次循环扩增DNA片段的技术。
具体步骤如下：将DNA分子用特定的引物扩增引导器识别特定的DNA，然后将扩增反应放到恒温器中进行放大，每循环一次会将扩增的DNA片段分裂成两条链，出现两个新的单链DNA前体，从而实现了DNA聚合。
3. 环状扩增法环状扩增法适用于小片段DNA的克隆，其具体步骤是：用引物识别特定的DNA，然后使用聚合酶以及低成本的环形引物扩增DNA片段。
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
基因克隆技术的应用与发展
基因克隆技术的应用与发展随着科技的发展，基因克隆技术成为了刻不容缓的焦点。
基因克隆技术是指利用现代生物技术手段，将一个生物体某个基因的完整信息转移到另一个生物体或细胞上，造成目的基因的复制和表达。
此技术的应用范围十分广泛，涉及到了人类生命科学，农业科学，环境保护和医学治疗等诸多领域。
在医学领域，基因克隆技术有着很大的应用前景。
现代医学已经开始采用基因治疗技术，这项技术可以让患者直接注射基因治疗药物，改变患者身体内部基因的表达和功能，从而阻止疾病的侵害。
在肿瘤治疗方面，基因克隆技术也能够有所帮助，通过克隆人体的自然免疫细胞和肿瘤抗原来对抗肿瘤。
农业治理方面，基因克隆技术也十分的重要。
该项技术可以开发出耐旱、抗虫、抗病等各种高效优质的新型植物或者动物种类。
还可以使动物获得更快的生长速度和更高的养殖利益。
另外，基因克隆技术还能帮助基因工程作物和药物的生产，从而实现民生的需要。
环境保护方面，基因克隆技术对环境造成的污染也有着很好的处理方法。
通过基因克隆技术使用生物工程方法提高大气和水体中污染物的降解、转化及利用，从而减少环境造成的破坏。
举个例子，外来物种入侵是目前全球环境问题中的严重问题之一，那么基因克隆技术可以克隆出与当地生态系统相适应的微生物，然后将其引入到入侵生物的取代其生态地位，保护当地环境。
但是，基因克隆技术还面临着许多的争议，例如人类可持续发展等概念因为基因克隆技术而受到了质疑。
一方面，基因工程带来的生物多样性不断减少，生物灭绝趋势逐渐加重。
另一方面，基因工程产生的模拟生物体可能具有潜在的安全风险，也会对导致生态系统的失衡。
因此，基于拥抱科技创新的基础之上，我们应该发展出一系列严谨的监管或者道德上的约束机制。
例如，我们可以开展包括临床试验，分子计算，微生物技术和植物繁殖等调研，以检测和评估复杂引发基因靶向治疗，如癌症治疗在内的疾病治疗。
我们还可以制定必要的法律法规来确保基因工程安全和合法，从而为公众提供更具体的保护。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
基因克隆的原理与技术
基因克隆的原理与技术在现代生命科学领域中，基因克隆是一个非常重要和广泛应用的技术。
基因克隆可以为人们研究生物体的基因组、分子生物学、药物研制、治疗等方面提供可靠的技术支持，同时也为人们更深层次地认识生命的本质提供了洞见。
本文将介绍基因克隆的原理和技术。
1. 基因克隆的原理基因克隆的原理是利用DNA重组技术，将目标基因插入到载体DNA中，再利用细胞转化技术将其导入到宿主细胞中，使其得以复制扩增，达到大规模表达目标基因的目的。
首先，需要准备一段目标基因的DNA序列，这由分子生物学技术提供。
然后，需要构建一个DNA载体，如质粒，它是一个小的环状DNA分子，可以复制自己并携带外源基因。
目前常用的载体包括pUC和pET等。
这些载体还可以携带各种标记，如荧光标记或抗生素抗性基因等。
将目标基因插入质粒中，需要利用特定的酶切和连接反应。
通常，酶切是使用一种名为限制性内切酶的酶切割DNA分子特定的位置，以产生产生单一或多个特定长度的DNA断裂点。
连接反应可以将目标基因和含有适当酶切位点的质粒连接在一起，形成重组质粒。
这些重组质粒可以通过传统的分子生物学方法，如PCR和电泳，进行筛选和鉴定。
2. 基因克隆的技术构建重组质粒之后，需要将其导入到细胞中。
有多种方法可以实现细胞转化，包括热冲击法、电转导法和化学法。
这些方法基本上都涉及到增加细胞膜的通透性，使DNA能够进入细胞质。
在宿主细胞中，携带外源基因的重组质粒可以通过自我复制产生的子代细胞中，随着细胞的繁殖，这些子代细胞也将继续复制重组质粒，从而实现目标基因的大规模表达。
同时，也可以通过选择抗生素筛选等方法来筛选能够稳定表达目标基因的细胞株。
基因克隆技术不仅可以实现外源基因的表达，还可以进行多种蛋白质修饰和改变其结构特性，从而产生更加优越的药物。
此外，基因克隆技术还可以进一步应用于基因疗法等领域中，实现个性化治疗和药物研发。
3. 基因克隆的前景和挑战基因克隆技术的应用已经在多个领域得到了成功。
基因克隆技术
第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。
基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。
有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。
基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
微生物的基因克隆技术及其应用
微生物的基因克隆技术及其应用微生物是一类微小而复杂的生物体，它们是天然环境中不可或缺的组成部分。
微生物具有与其他生物体不同的基因、代谢和适应性的特性，这也使得微生物广泛应用于多个领域中，从基础科学到产业生产等都有其重要的地位。
基因克隆技术是一种通过精确分离和复制目标DNA片段来生产大量同一分子的技术手段，而微生物的基因克隆技术则是在微生物层面上通过定向操作获得目标蛋白质或基因的技术手段。
本文将对微生物的基因克隆技术及其应用进行深入的探讨。
一、微生物基因克隆技术的原理微生物基因克隆技术是基于DNA与DNA复制的原理而建立的一种技术手段。
其基本步骤包括DNA片段的制备、连接和检测等。
首先，需要对目标DNA片段进行提取和处理，得到纯化的DNA。
其次，应选用合适的质粒等载体将目标DNA连接进去，回转感受态细菌将其转化为新的细菌体。
最后，通过特定的选材和检测手段获得那些具有目标蛋白质或基因表达的细菌体。
二、微生物基因克隆技术的应用通过微生物基因克隆技术，可以制备出大量带有目标蛋白或基因片段的细菌体，进而利用其在多个不同领域中进行应用。
本节将从基础科学研究、基因治疗以及生产应用三个方面对微生物基因克隆技术的应用进行探讨。
（一）、基础科学研究微生物基因克隆技术在基础科学研究中被广泛利用，特别是在遗传学、分子生物学以及基因工程等领域。
其原因是微生物生长繁殖速度快，且细胞壁相对透明。
因此，科研人员可以通过基因克隆技术构建与目标蛋白质或基因紧密相关的实验模型。
例如，研究人员可以借助微生物基因克隆技术，将大量细胞膜蛋白的DNA克隆至工程细胞株，以分析蛋白质结构以及其功能酶等。
（二）、基因治疗微生物基因克隆技术在基因治疗领域也有着不可替代的地位。
基因治疗是一种创新性的治疗方法，该方法通过将健康的基因导入到患者缺失或错误的细胞中，以纠正因病变引起的异常状态。
微生物基因克隆技术可应用于基因治疗中的基因传递，即通过质粒等载体的导入将带有健康基因的DNA片段导入至宿主细胞内。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
基因工程中的基因克隆技术详解
基因工程中的基因克隆技术详解基因工程是现代生物技术领域中的一个重要领域，其核心是基因的克隆技术。
基因克隆技术是指将某一物种的基因从其DNA分子中剪切出来，然后通过重组DNA技术将其插入到宿主细胞的染色体中，使宿主细胞能够表达并产生与原生物种相同的特定基因产物。
基因克隆技术的应用广泛，不仅在医学领域中有着重要的意义，还在农业、工业等领域有着广泛的应用。
基因克隆技术分为几个基本步骤：选择目标基因、制备DNA片段、构建载体、转化宿主细胞、筛选目标基因和验证。
首先是选择目标基因，这需要根据具体需求和研究目的来确定。
制备DNA片段通常可以通过PCR（聚合酶链反应）或DNA酶切来实现。
PCR是一种体外复制技术，它通过DNA聚合酶酶和特定引物在高温下反复扩增目标DNA片段。
DNA酶切是利用特定的酶切酶切割DNA，得到所需片段。
构建载体是将目标基因插入到载体DNA中的过程。
载体DNA通常是质粒（如pUC19、pET28a等）或病毒（如腺相关病毒、腺病毒等）。
转化宿主细胞是将构建好的载体DNA转入某种特定宿主细胞中的过程。
目前常用的转化方法有热冲击法、电穿孔法和基因枪法等。
筛选目标基因是在宿主细胞中鉴定并筛选出目标基因的过程。
通常是通过抗生素抗性基因或荧光标记基因的选择来实现。
最后，通过验证目标基因是否成功克隆，可以采用PCR、Southern blotting（南方杂交）或DNA测序等方法进行验证。
基因克隆技术的应用非常广泛。
在医学领域中，基因克隆技术被广泛应用于基因治疗、疾病诊断和药物研发等。
通过基因克隆技术，可以将正常基因导入患者体内，治疗一些遗传性疾病。
而在农业领域中，基因克隆技术可以用于改良作物、提高农作物的产量和抗性，以应对全球粮食安全的挑战。
此外，基因克隆技术还可以用于工业发酵中的酶的生产和合成新的生物小分子。
然而，基因克隆技术也存在一些争议和挑战。
首先，基因克隆可能引发道德和伦理问题，例如对于人类胚胎克隆的争议。
转基因、基因克隆与基因敲除技术
内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配
杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
黑色雌性大鼠
B 、 制 备 基 因 敲 除 动 物 （ 小 鼠 ）
来自褐色大鼠
1、Neor （neomycin-resistance gene)基因：阳性 筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。
1号发生位点同源重组，在G418培养基中生长；
2号为随机插入重组，带入tk基因，可在G418培养基中生长，但 在gangcyclovir培养基中被杀死；
3号未发生任何重组，为正常细胞，在G418培养基中被杀死。
抵抗G418的基因 1 2 tk基因 3
B、制备基因敲除动物（小鼠）
1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡 中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质） 2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。 3、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干细 胞来自褐色小鼠，正常胚胎来自黑色小鼠。 4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色 的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲 除。 5、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。
G418（也称遗传霉素）是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉 素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻 断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、 植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常 用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方 后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产 物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有 Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ,已在基 因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应 用。
第五章第一节图位克隆基本原理
BSA Development of NILs (near isogenic lines) Use of YACs or BACs
larger
inserts
NILs:
BSA:
Tanksley et al. 1995. Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants. Trends in Genetics 11(2):63-68
Map-based gene cloning -chromosome landing
High-volume marker technologies
Allows
thousands of potentially polymorphic DNA segments to be generated RAPDs, AFLP
Map-based gene cloning -Chromosome walking
Create a contig of BACs which are anchored between the closest markers flanking the locus of interest If you are lucky somebody else has already walked by and created a contig which can be used
Then saturate the region with other markers
BC1 P1
M1
×
P2
F1
BC1-1
BC1-2
BC1-98
基因克隆技术的进展与应用
基因克隆技术的进展与应用人类向来都对自身的血缘和科技发展有着浓厚的兴趣，而基因克隆技术则是两者相结合的巅峰。
该技术在科学领域创造出了许多突破性的进展，同时也给人类社会带来了无限可能性。
一、基因克隆技术的发展历程在1970年代初期，基因克隆技术还处于萌芽阶段，科学家们通过不断的实验和研究，才逐渐掌握了该技术的核心原理——将DNA序列从一个细胞中复制到另一个细胞中。
在1980年代，该技术逐渐走向了成熟并得以广泛运用。
通过将人类细胞的DNA序列复制到其他生物细胞中，科学家们成功地创造出了第一个人工克隆生物“多利羊”。
二、基因克隆技术的应用领域基因克隆技术的应用涉及面非常广泛。
在医学领域，基因克隆技术被广泛应用于药物研发和新药节点检测方面。
通过对特定基因进行克隆和表达，科学家们可以研发出更加精准和有效的药物，为人类疾病的治疗提供了更加可靠的方法。
在生物学领域，基因克隆技术则主要被用于植物改良和人工培育。
通过将优良的植物基因序列转移至其他植物体内，科学家们可以创造出更加高产、耐旱、耐热甚至耐虫害的植物品种。
三、基因克隆技术的前景展望随着科学技术的不断发展，基因克隆技术也将不断地完善和进化。
未来，该技术有望在医学、生物、环保等领域发挥更为重要的作用。
在医学领域，基因克隆技术可以为癌症、心脏病等疾病提供更加精准、个性化、有效的治疗手段，为人类身体健康和生命延续提供了更加有效的保障；在生物领域，通过不断改良和完善该技术，科学家们可以创造出更为强健和适应环境的生命，进而为生态环境的保护和恢复发挥更加积极的作用。
总之，基因克隆技术是一项既有挑战性又有开创性的科技领域。
在未来，该技术将继续在众多学科领域进行深度探索和应用，为人类社会的发展带来更多的活力和创新源泉。
基因克隆技术及其在基因工程中的应用
基因克隆技术及其在基因工程中的应用基因克隆技术是一项重要的生物学研究方法，它可以将生物体的DNA分子复制出来、扩增并在不同的载体中进行传递、存储和表达。
基因克隆技术在生物工程和基因治疗等领域中有着广泛的应用，本文将重点介绍这项技术的原理、过程和具体应用。
I. 基因克隆技术的原理和过程基因克隆技术主要包括DNA分子的分离、切割、连接、转移和检测等基本过程。
下面将分别介绍这些过程。
1. DNA分子的分离DNA分子的分离是基因克隆技术的第一步。
通常，我们需要从生物体的细胞或组织中，通过化学或物理手段将粗提或纯化出DNA样品。
2. DNA分子的切割切割DNA分子是基因克隆技术的关键步骤，其目的是将DNA分子切成特定的片段，并生成具有黏性末端的DNA分子，以便后续的连接。
DNA切割一般使用限制性内切酶，这些酶能够将DNA分子特定的序列切割成各种长度的片段。
切割后，黏性末端可以通过酶切修复、平端化和生化修饰等方式进行修复和处理。
3. DNA分子的连接DNA分子的连接是指将DNA片段和载体DNA块连接在一起，形成重组DNA 分子。
载体DNA块通常来源于大肠杆菌、酵母等，常用的载体包括质粒、噬菌体等。
将DNA片段和载体DNA块进行连接，需要使用DNA连接酶，通过黏性末端的互补配对，将DNA片段连接到载体DNA块上。
4. DNA分子的转移DNA分子的转移是将重组DNA分子导入到目标宿主细胞中的过程。
这通常使用电转化、热冲击或微注射等方法进行。
DNA分子进入宿主细胞后，通过复制过程，可以扩增DNA分子。
5. DNA分子的检测DNA分子的检测是对重组DNA分子进行鉴定和确认的过程。
目前常见的DNA检测方法包括PCR、DNA测序和Southern blot等技术。
通过对重组DNA分子进行检测，可以确定其是否达到预期效果。
II. 基因克隆技术在基因工程领域的应用基因克隆技术在基因工程领域中有着广泛的应用，下面将分别介绍基因工程中常用的几种基因克隆技术及其应用。
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用
基因克隆技术及其在蛋白表达中的应用基因克隆技术是一种将外源DNA片段转化到DNA质粒中的技术，其产物为克隆DNA分子。
这种技术可以应用于如生物医学、农业等领域中的研究和应用。
其中，蛋白表达是基因克隆技术的一个重要应用方向。
1. 基因克隆技术的原理和方法基因克隆技术的原理大致分为三个步骤：DNA分子的制备、限制性内切酶切割、DNA片段连接到载体DNA上。
DNA分子的制备涉及DNA提取、PCR扩增、酶切等技术，目的是获得含有目标DNA片段的DNA。
限制性内切酶切割是将DNA分子切割成特定的片段，目的是获得目标DNA片段。
DNA片段连接到载体DNA上是通过连接酶将DNA片段与载体DNA连接成DNA重组物质。
同样的，基因克隆技术的方法分为三种：限制性内切酶法、PCR扩增法和基因文库法。
2. 蛋白表达及其意义蛋白表达是指基因的DNA序列转化为相应的蛋白质。
蛋白质在生命体内十分重要，它们构成了生物体的各种器官和组织的结构，并且承担着许多生物学过程的重要作用，如酶的催化作用、免疫系统的维持、基因的调控等。
因此，蛋白表达在生物医学、农业等许多领域中具有无限的应用前景，包括生物药物生产、食品安全、草地生态建设等。
3. 基因克隆技术在蛋白表达中的应用基因克隆技术在蛋白表达中的应用主要分为两种：原核表达和真核表达。
原核表达是将外源DNA片段转化到大肠杆菌等细菌中，使其在细菌内部表达并获得蛋白质。
这种方法无需使用复杂的细胞系统，适用于简单的蛋白质表达。
真核表达是将外源DNA片段转化到哺乳动物或其他真核生物的细胞中，使其在细胞中表达并获得蛋白质。
这种方法对于复杂的蛋白质表达和修饰更为有效。
4. 基因克隆技术在生产生物药中的应用基因克隆技术在生产生物药方面的应用十分广泛。
这种方法的基本思想是：将人类基因移植到可表达该基因的外源宿主细胞中，并使该宿主细胞制造有效的蛋白质。
基因克隆技术可以生产生物药，如干扰素、人免疫球蛋白、重组胰岛素等，这些生物药可以更准确地控制疾病的进程，减轻患者的痛苦，并提高治愈率。
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第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。
基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。
有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。
基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。
常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。
由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。
1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在宿主细胞的拷贝数高；在复制子外适当位置有由多个单一内切酶位点组成的多克隆区，极有利于外源DNA片段的插入；具有抗药性及插入失活标记，可以从平板中直接筛选阳性重组子。
但由于质粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。
因此，插入片段过大，会导致重组子扩增速度减慢甚至插入片段丢失。
2、噬菌体载体目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体、Cosmid及M13噬菌体等。
λ噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其基因组为线状双链DNA分子。
在λ噬菌体DNA(λDNA)的中间1/3处，是可被替换而不影响噬菌体生长的“非生活区”，此区的DNA可通过遗传工程技术由外来DNA片段所替代。
λDNA作为载体的优点是：在体外可包装成病毒颗粒高效地感染大肠杆菌；载体容量大，可将23~25kb的外源DNA片段引入其内；筛选和保存较为方便。
M13也是大肠杆菌噬菌体，其基因组为单链线性DNA分子。
感染大肠杆菌后，此单链DNA 转变为复制型双链DNA。
克隆复制后，仍以单链形式包装成新的噬菌体释放到介质中。
M13DNA 分子中有一长507个核苷酸的小“非生活区”可以被外来DNA片段取代。
M13载体的主要优点是重组的M13DNA仍为单链结构，所以能方便地用于Sanger双脱氧法测定所克隆DNA片段的序列，或用于合成RNA探针的模板。
M13载体的主要问题是容量太小，当插入片段大于1000个核苷酸时就很不稳定，容易在增殖的过程中丢失。
Cosmid载体从结构上看成是一种人工构建的杂种载体，由噬菌体DNA和质粒DNA的某些功能片段拼接而成，其转染细胞及病毒颗粒包装与λDNA相似，但在细胞内的复制则与质粒相同。
与λDNA相比，Cosmid的主要优点是载体容量很大，插入DNA片段的长度可高达45kb。
三、构建重组体DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。
这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。
连接方式有粘端连接和平端连接等多种形式。
（1）粘端连接：用相同的限制性内切酶酶切目的基因和载体DNA分子，使之产生相同的粘性末端，在适当的温度下，两种DNA分子的粘性末端互补配对，再用DNA连接酶共价连接，成为完整的重组体。
由于粘端连接具有很高的重组效率，在实验中为首选方法。
许多情况下，目的基因上找不到适当的与载体上相同的限制性酶切位点。
此时可通过在目的基因两端连上人工接头(含适当限制性酶切位点的合成DNA小片段)，再经酶切后即可得到所需的粘性末端。
（2）平端连接：在目的基因和载体分子上找不到匹配的限制性酶切点时，可采用平端连接法。
少数酶酶切后能直接产生平末端，多数情况下先酶切产生粘性末端，再通过补平反应后成为带平末端的分子。
虽然平端连接有更广的适应性，但重组效率远不如粘端连接，阳性重组子筛选的难度也更大。
四、将重组DNA引入宿主细胞现用原核宿主细胞以大肠杆菌(E·coli)为主。
在基因工程中，由于重组DNA是体外制备的，将其转入宿主细胞后，可能会受到宿主细胞限制酶的切割。
因此宿主菌必须是无限制基因(或作用)的突变株(r—株)，如常用的E·coli株HB101，DH1等。
一般将噬菌体DNA引入宿主细胞称为转染(transfection)，将质粒DNA引入宿主细胞称为转化(transformation)。
在导入重组DNA前，宿主菌用冷CaCl2溶液处理，使其细胞膜透性增加而成为感受态细胞，以利于重组DNA分子的进入。
五、筛选与鉴定重组体克隆两者相辅相成，互相验证。
阳性重组体的筛选可利用载体上的遗传标志，包括抗药性(采用无抗药性的受体菌)、氨基酸合成酸系(用缺该酶系的异养型受体菌)和颜色反应(如α互补效应)等。
另一种筛选方法是菌落杂交，将平皿上的转化菌落转印到硝酸纤维膜上，经碱处理使DNA变性，然后用目的基因的标记探针与之杂交，漂洗去多余的探针后进行放射性自显影，根据显影片上的斑点可判断含有目的基因的菌落。
重组DNA的鉴定有多种方法，如限制性酶切图谱、DNA测序，Southern印迹杂交等，可根据情况酌情使用。
实验十三质粒DNA的小量快速提取原理在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
上清液中的质粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。
试剂1、LB培养基蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待完全溶解后，用1N NaOH调pH 至7.0，补加重蒸水至总体积1000ml，151bf/in2高压蒸气灭菌20分钟。
2、氨苄青霉素：100mg/ml3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris—HCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)4、溶液Ⅱ(临用时配)：0.2mol/L NaOH，1％SDS5、溶液Ⅲ：0.5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；H2O28.5ml6、酚－氯仿：将酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris－HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖0.01mol/L Tris－HCl (pH7.6)液层，4℃保存。
7、氯仿－异戊醇：将氯仿和异戊醇按24：1的比例混合。
8、TE缓冲液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT9、RNase 1mg/ml：称10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，此液为10mg/ml RNase浓度，应用时稀释至1mg/ml。
10、70％乙醇、无水乙醇操作1、将含有pBS-SK质粒的大肠杆菌XL1-blue 10μl接种到10ml含氨苄青霉素(100μg /ml)的LB培养液中，37℃振摇过液。
2、取1.5ml菌液转入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，吸净上清。
3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓颠倒Eppendorf管5次，以混合内容物，禁止剧烈振荡。
置冰浴中放置5分钟。
5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5分钟。
6、用微量台式高速离心机12000rpm 离心5分钟，将上清转入另一Eppendorf管中。
7、加等体积酚－氯仿，剧烈振荡1分钟后，12000rpm离心5分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。
8、加等体积氯仿－异戊醇，剧烈振荡10秒钟后，短暂离心12000rpm1分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。
9、室温下加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温下静置5分钟。
10、12000rpm离心5分钟，去上清液，加1ml 70％乙醇，短暂振摇，然后再离心(12000rpm 分钟)。
11、除去所有上清液，待待残余乙醇挥发干净后，加30μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37℃保温15分钟，取出后即可用于酶切分析或置-20℃保存备用。
实验十四人外周血白细胞DNA制备一、原理从全血制备白细胞DNA，可用非离子去污剂Triton X-100直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，在反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。