核酶的发现与基本内容
核酶的发现、结构、功能
Although the self-cleavage occurs at different sites in the ASBV molecule for the plus and minusry structures with high sequence homology can be drawn at each site
这篇论文中的结构有23个保守核苷酸碱基和3个螺 旋区
核酶锤头结构
13个保守核苷酸碱基和3个螺旋区
谢谢大家！
Abstract
The RNA moieties of ribonuclease P purified from both E. coli (M1 RNA) and B. subtilis (P-RNA) can cleave tRNA precursor molecules in buffers containing either 60 mM Mg2+ or 10 mM Mg2+ plus 1 mM spermidine. The RNA acts as a true catalyst under these conditions whereas the protein moieties of the enzymes alone show no catalytic activity.
核糖核苷酸P
Cell. 1983 Dec;35(3 Pt 2):849-57. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Guerrier-Takada C, Gardiner K, Marsh T, Pace N, Altman S.
核酶
核酶的发现
6
rRNA前体是靠自己完成剪接过程
413bp 15个
414bp
7
2.1T.Cech的研究工作
1982年 ，Thomas R. Cech的研究组在《CELL》 上发表了题为《自我剪接RNA：嗜热四膜虫核糖体 RNA插入序列的自我切除和自我环化》。 结论：RNA分子具有自身断裂的催化作用。 E 异议：酶是作用于其它物质的，而它作用于本身?
这两个发现，宣告了分子生物学一个新的RNA时代的到来。
11
3.1核酶意义
1.它突破了“酶是蛋白质”的传统概念。
现代的酶定义：酶由生物体内活细胞产生的、具有催化功
能的生物大分子。
＆
12
3.2核酶意义
2.核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起
源这一问题有了新的认识，对生物前化学有重要贡献。
5
2.1T.Cech的研究工作
研究对象：原生动物四膜虫的核蛋白体核糖核酸基因 其含有一种RNA，有一个由413个核苷酸组成的内含子亦称 插入序列（intervening sequence，IVS）。
努力目标：找出从前体去除IVS并且使前体成为成熟体的那个酶。
研究结果：在含有嘌呤核苷和镁离子的溶液中，无论加上哪一
实验设计
酶的认识
核酸性酶
启示
关于诺奖
背景介绍
2
1.1酶的定义
20世纪30年代
一类具有催化能力的特殊蛋白。
所有的酶都是蛋白质。
3
1.2核酶的发现
1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提 到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以 注意。
第七讲核酶
核酶的发现被认为是近十多年生化领域内最令人鼓舞的发
现之一。为此Cech和Altman共同获得了1989年度诺贝尔化 学奖。
The Mi RNA in ribonuclease P is catalytic The intron in the pre-rRNA of Tetrahemena is self-spliced
剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性 核酶是一种金属依赖酶 结构与功能的关系
Ⅰ类内含子的剪接机制
I型内含子核酶所催化的典型反应是包括两步磷酸酯键转移反应的
RNA剪接反应．在这个反应中需要镁离子、外源鸟苷或其磷酸化衍 生物(GMP、GDP、GTP)．
首先，一个外源鸟苷的3羟基攻击5 ’剪接位点的磷原子，并与内
氨基酸就可以形成1个蛋白质酶的三维结构，
而且其活性中心具有很强的刚性。
而由4种核苷酸组成的核酶则不具有蛋白质酶
的这些特性。科学研究表明：核酶需要较大的
结构才能提供较稳定的活性中心，从而有效地
提高反应速度；而小的核酶结构只勉强可以满
足催化反应的需要。最小的天然核酶---锺头
核酶的基本结构也不少于30个核苷酸。
锤头核酶 发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP Ⅰ类内含子 剪接型核酶 II类内含子
根据催化反应
二、剪接型核酶
剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方
式除去内含子（Intron).
剪接型核酶分类
1、I类内含子
2、II类内含子
1.I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
(二）核酶与蛋白质酶的比较
1. 核酶与蛋白质酶在结构上的比较 蛋白质是由20多种不同的氨基酸组成的多肽 聚合物，而核酶是由4种核苷酸组成的聚合 物，因此蛋白质的一级结构要比核酶复杂的 多。
核酶
4、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型 肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作 用的研究
5、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用 发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并在Ⅰ期临床实验中受到 良好效果。
蓝（N.
Lan）等对镰形细胞贫血突变的β珠蛋白
mRNA（βS RNA）进行了修复 。
4 核酶技术在化妆品方面应用
随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病 的研究。 采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上 完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康， 已经成为高科技化妆品研究的一个热点
化学本质是RNA； 底物：RNA、肽键、ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性），依据碱基配对； 催化效率低 是一种金属依赖酶
三、核酶（ribozyme）的分类
锤头核酶 发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应 剪接型核酶
RNaseP I内含子
II内含子
2.剪切型核酶
2 白血病是造血系统的恶性肿 瘤,目前尚缺少有效的治疗方法 。核酶的发现，尤其是锤头状 核酶，为白血病的基因治疗带 来了新的希望。
核酶的应用
3 抗肿瘤治疗
核酶是天然的具有催化能力的RNA分 子，能特异性地催化RNA剪接。 针 对某些病原或肿瘤的基因设计特异性 核酶，并将其导入细胞以阻断或降低 这些基因在细胞内的表达，最终可达 到抑制病原增殖、肿瘤扩散的目的。
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应；
核酶的发现与应用
姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
第八章_核酶pdf(DOC)
第八章核酶从人类认识到酶的存在开始到20世纪80年代初，人们一直认为酶的化学本质是蛋白质，这一概念根深蒂固，近似乎成为定论。
然而美国科罗拉多大学博尔分校的Thomas Cech和耶鲁大学的Sidney Altman各自独立发现具有生物催化功能的RNA却从根本上改变了人们的这一认识观念。
1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。
具体事件:1981年Thomas Cech等在研究rRNA前体加工成熟时就发现四膜虫的26rRNA 前体中含有插入序列（IVS），在rRNA前体成熟过程中，IVS通过剪接反应被除去，并证实这一剪接反应不需要任何蛋白质的参与，是四膜虫的基因内区自行拼接的。
1981年,耶鲁大学的Sidney Altman等在从事RNaseP的研究中也发现了这一现象，RNaseP是细菌和高等生物细胞里都有的一种tRNA加工酶，它能在特定的位点上切开tRNA前体。
1983年，就在Thomas Cech等发现RNA能自行拼接后的两年后，Sidney Altman等就证明：在较高的Mg2+浓度下，RNaseP中的RNA（M1RNA）就单独具有催化tRNA前体成熟的功能，而其蛋白质组分却不具备此种催化功能。
根据当时催化剂不仅能加快反应速率，而且在反应前后催化剂本身不发生改变的准确定义，在Thomas Cech等发现四膜虫26SrRNA前体IVS的自身拼接后，科学家们还排斥它作为生物催化剂的资格，认为那是一种自体催化反应，拼接后的成熟rRNA与前体不同，尚不能被看成是严格意义上的催化剂。
Sidney Altman等的发现就从实验上消除了这一异议，原因是RNaseP所催化的反应是一种异体分子间的反应，而该反应正是在RNA的催化下完成的。
此后，1984年R. Lewin在Science 发表的题为“First True RNA Catalyst Found”的报道标志着RNA催化剂的正式诞生。
核酶的发现与应用
核酶的发现与应用一、核酶的发现1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。
20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。
1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度镁离子存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。
1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
二、核酶的应用（一）应用于生命起源的研究体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA 剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。
（二）在医学领域中的应用1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。
2、免疫源性低，很少引起免疫反应。
3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
4、用于RNA的修复，核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。
核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。
经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。
5、核酶抗肝炎病毒的研究：目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。
DNAzyme核酶简介
我是核酸，也是酶——DNAzyme核酶简介1982年，美国科学家T. Cech在研究中发现了核酶（ribozyme），自身剪接内含子的RNA具有催化功能[1]。
这揭示了酶不仅有蛋白一种组成形式，也有可能是核酸。
无独有偶，Gerald Joyce在1994年发现了脱氧核酶（DNAzyme），可以催化单个核糖核苷酸磷酸酯的Pb2+依赖性切割[2]。
迄今为止已经发现了数十种DNAzyme。
DNAzyme一般是通过SELEX体外筛选技术获得。
下面以RNA切割活性的DNAzyme为例，简单介绍体外筛选的过程。
如图1所示，用于筛选的DNA文库包含一段60个随机碱基的部分（图中绿色部分），两侧是能与PCR产物结合的序列（黑色部分），PCR产物结合序列的上游包含RNA位点，作为DNAzyme的底物。
在文库DNA的5’端修饰有生物素，与链酶亲和素结合从而固定在固相表面。
金属离子存在时，小部分文库DNA序列可以折叠形成带有酶活性的结构，切割RNA位点，这部分文库得以从固相表面释放下来。
切割下来的产物通过两轮PCR进行富集，第一轮PCR扩增全长序列，第二类PCR通过引物再次引入RNA位点和生物素标签。
通过5~10轮的重复直到文库达到饱和。
接下来对文库测序以鉴定出那些活性最高的序列[3]。
图1：RNA切割活性的DNAzyme体外筛选获得的方法核酶的种类根据催化功能的不同，可以将DNAzyme分为5大类：RNA切割活性的DNAzyme、DNA切割活性的DNAzyme，具有连接酶功能的DNAzyme，过氧化物酶活力的DNAzyme，修饰胸腺嘧啶二聚体的DNAzyme[4]。
下面分别介绍这五类DNAzyme。
1. RNA切割活性的DNAzyme这类DNAzyme是发现最早，也是研究的最深入的一类DNAzyme。
比较早被研究的是8-17和10-23两种DNAzyme，它是在1997年由SELEX（指数富集的配基系统进化技术）发现的，命名来源于体外筛选的过程，8-17是筛选过程的第8轮的第17个克隆获得，而10-23是筛选过程的第10轮的第23个克隆获得[5]。
核酶的发现与基本内容
核酶的发现与基本内容什么是核酶核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA 序列。
核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 和S.Altman因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
(内含子：断裂基因的非编码区，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。
前体：修饰加工前，刚刚转录出来的RNA)核酶的特点核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有的还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。
更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其他的mRNA分子。
5第五章核酶
(2).多功能R-酶 1986年，切克等人发现四膜虫26SRNA前体通过自我剪接作用， 切下的间隔序列(IVS)经过自身环化作用，最后得到一个在其 5′-末端失去19个核苷酸的线状RNA分子，称为L-19IVS。它是 一种R-酶，能够催化其它RNA分子进行下列多种类型的反应： 剪切反应: 2CpCpCpCp=CpCpCpCpCp+CpCpCp 末端剪切反应: CpCpCpCp=CpCpCp+Cp 限制性内切作用: -CpCpCpCpNp-=-pCpCpCpC+Np-转磷酸作用: CpCpCpCp+UpCpU=CpCpCpC+UpCpUp 去磷酸作用: CpCpCpCpCp= CpCpCpCpC+Pi 2.作用于DNA的R-酶 3.作用于多糖的R-酶 4.作用于氨基酸脂的R-酶
G-p-A以2Байду номын сангаас5'-二 磷酸酯键链接 形成套环结构
CpU 外显子 U Nn N 3' A A G G U A G U A AA U C C
5'
外显子 U 3'OH U 外显子 U U 外显子
套环状IVS
C 3'
5'
3'
成熟的RNA
三、分子间催化R-酶
分子间催化R-酶是催化其他分子进行反应的核酸类酶。根据所作用的底 物分子的不同，可以分为若干亚类。
5' CH2
G O
新5'-羟基
O 3' OH
Me2+
H A位点
O
O－ Me2+ B位点
Me2+=Mn2+,Mg2+ 以Mn2+替代Mg2+活性提高
核酶
+GpN
L-19IVS
自我剪接反应释放出来的IVS还可以通过转磷酸酯反应而 自身环化。IVS经过两次环化和开环，最后得到共失去19 个核苷酸的线状IVS。L-19IVS本身缺少环化点，不再能 催化分子内反应，但它能催化其他RNA分子发生化学反 应，具有5种酶的活力。
建议的L19 RNA催化机理
锤头二级结构编号
17位（ X ）的核苷酸残
基多数是C,不能是U,G. 7位核苷酸残基的置换 不会对酶活性产生很大 影响
17位核苷酸
7位核苷酸
发夹（hairpin ）结构
发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点 病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹 核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分 别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。 发夹核酶结构模型 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构 作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。
体外： 体内：
2.1 剪切机制
Mg 2+
2.2 结构与功能的关系 活性是必需的。
M1RNA 5‘端完整结构对维持催化
RNaseP可剪切前
剪切位点
体5‘端41nt, 5’端成熟。
不同tRNA的 5’ 端没有 顺序共同性，剪切的准
确性与剪切部位周围的
核苷酸顺序无关，表明 在RNaseP的组分内没 有引导序列， RNaseP 所识别的是底物的高级 结构。
T.Cech的重要发现开始于1981年。 研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意 义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中 剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有 蛋白质酶来完成。
1989诺贝尔化学奖-核酶的发现
核酶的作用
核酶的具体作用： 1. 核苷酸转移作用。 • 2. 水解反应，即磷酸二酯 酶作用。 • 3. 磷酸转移反应，类似磷 酸转移酶作用。 • 4. 脱磷酸作用，即酸性磷 酸酶作用。 • 5. RNA内切反应，即RNA限 制性内切酶作用。
核酶发现的影响
RNA 遗传信息 催化功能
RNA很有可能早于DNA和蛋白质，是生物进 化史中首先出现的生物大分子，这是一种生命起 源的新概念。
谢谢~
奋斗！不息
Hello~，我是不息，拥有美好梦想的女大学生一枚~~ 喜欢纪录片美剧纯音乐经典老歌 课余喜欢钻研学习office,PS,AI,DW等软件，对用户体验交互设计颇感兴趣 目前正自学日语，工业心理学知识 欢迎志同道合的小伙伴与我一同前行，奋斗！不息 Fighting~ QQ：1498240843 新浪微博：不息不羁
重大发现！核酶
1981年，切赫和同事在研究四膜 虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子 时发现：26S rRNA前体分子在没有任何 蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前 体分子中的内含子，这种现象称为自我 剪接，这是人类第一次发现RNA具有催化 化学反应的活性，具有这种催化活性的 RNA称为核酶。 1983年，奥尔特曼在研究tRNA分 子在细胞处理时，核糖核酸酶- P中除了 蛋白质和RNA，RNA是活性酶的重要组成 部分，证明了核酶确实有催化功能。
新浪博客：生生不息
核酶发现的影响
艾滋病 特异性切割 靶RNA 肿瘤 白血病 肝炎 移植排斥反应
核酶
核酶的应用
随着对核酶的深入研究，已经认识到核酶在遗传病， 肿瘤和病毒性疾病上的潜力。 艾滋病毒HIV的转录信息来源于RNA而非DNA，核酶能 够在特定位点切断RNA，使得它失去活性 白血病是造血系统的恶性肿瘤，核酶的发现，尤其是 锤头状核酶，为白血病的基因治疗带来了新的希望。近些年， 在国外的一些国家已经在小白鼠体内得到较好的效果。
核酶 (2)
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应；
4、变形剂对活性的影响 5、温度对活性的影响：在65℃范围内随温度升高而增 加，37 ℃时均有适宜的活性。
核酶的应用
一 抗病治疗
二 RNA的治疗 三 核酶在医学上的应用 四 化妆品方面的应用 五 其他
一 抗病治疗
1 对于艾滋病毒HIV的转录信息 来源于RNA而非DNA，核酶能够 在特定位点切断RNA，使得它失 去活性。
蓝（N.
Lan）等对镰形细胞贫血突变的β珠蛋白
mRNA（βS RNA）进行了修复 。
4 核酶技术在化妆品方面应用
随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病 的研究。 采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上 完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康， 已经成为高科技化妆品研究的一个热点
2‘
p 5‘
HO-A
Ⅱ 类 内 含 子 的 剪 接 机 制
p
3‘
套环的形成
Mg 2+
3’
OH
p-A
p
第一次转 酯基反应 中利用一 个位于内 含子中的 腺苷酸残 基作为亲 核体
外显子连接 p
P-A
HO 3’
影响核酶活性的因素
1、pH值对活性的影响：pH7.0-7.5时核酶活性最高； 2、二价金属阳离子对活性的影响：如Mg 2+ Mn 2+；
价金属离子参与。
单金属离子催化
双金属离子催化
锤头结构的 五种类型
R示酶，S示底物，箭头示剪切位点
1.剪接型核酶
（1）定义
指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴随着形成新的 磷酸二酯键，即磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应。
核酶
一、核酶的概念
二、核酶的种类
三、影响核酶活性的因素
四、核酶的应用
五、核酶面临的问题
I
剪接机制L-19IVS
U pA G pU
5'
3'
5'外显子
3'外显子
内含子
pG-OH
pGpA
G pU
3'
U 5'
OH
第一次转酯反应
第二次转酯反应
U 5'
pU
3'
pGpA
GOH 5'3'
+GpN
引导序列
保守序列
G结合位点
剪接部位
Ⅱ型
剪接机制
互相配对。
：高度保守，
5 ’3’
金属离子的作用
1
2
3
二价金属离子参
1989
发夹核酶催化机制
环。
5‘3‘
环剪切部位
剪切部位
剪切位点。
1
2 3 4 5
五、核酶面临的问题
1、核酶催化切割反应的可逆性问题
2、提高催化效率
3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞
4、使核酶在细胞内有调控地高效表达
5、增强核酶在细胞内的稳定性
6、对宿主的损伤问题有待进一步考察。
第五章核酶与抗体酶2010
进攻内含子与3’外显子之间的磷酸基团，从而释放出内含
子并将两个外显子连接起来。
2‘
p 5‘
HO-A
Ⅱ 类 内 含 子 的 剪 接 机 制
p
3‘
套环的形成
Mg 2+
3’
OH
p-A
p
外显子连接 p
P-A
HO 3’
核糖核酸酶P(ribonuclease P，RNase P)
核糖核酸酶P是一个核酸内切酶，它专门切除前体tRNA 5’端的附加序列。
在生物体内，只有与蛋白质结合才能更为有效地发挥
催化作用，但起催化作用的还是RNA，蛋白质的作用
是帮助稳定具有催化活性的RNA的特殊构型。
Ⅱ类内含子有一 个保守的二级结 构：
结构域Ⅰ：两个 保守内含子结构 序 列 EBS1,EBS2 与两个外显子结 构 序 列 IBS1,IBS2 互 相 配对。
intr on
1983年美国 S.Altman 等研究RNaseP（由20% 蛋白质 和80% 的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E. coli
tRNA 前体加工。
Thomas Cech
Sidney Altman
Cech和Altman各自独立地发现了RNA的
催 化 活 性 ， 并 命 名 这 一 类 酶 为 ribozyme
当发夹核酶与底 物结合时，其二 级结构包括5个 环和4个螺旋。
核酶和底物组成
螺旋1、2及对称 的环1、5。
剪切反应发生在 底物识别序列 GUC的5‘端。
•发夹核酶分别为 2 个 结构域。结构域I由螺 旋1、2和环1、5组成， 结构域II由螺旋3、4 和环2、3、4组成。 •腺 苷 酸 残 基 A15 连 接 两个结构域 ， 使它们 相互靠近相互作用 ， 形成催化反应所必需 的三级结构。 •环 3被认为与催化作 用无关。
核酶的发现和应用
核酶的发现和应用一、核酶的发现从人类认识到酶的存在开始直至20世纪80年代初，人们一直以为酶的化学本质是蛋白质。
然而美国科罗斯拉多大学博尔分校的Thomas Cech和耶鲁大学的Sidney Altman 均发现具有生物催化功能的RNA，这说明某些RNA 具有催化活性。
1981年Thomas Cech等在研究rRNA前提加工成熟时就发现四膜虫的26SrRNA前体中插入含有插入序列（IVS），在rRNA前体成熟过程中，IVS通过剪切反应被除去，并证实这一剪切反应不需要任何蛋白质的参与，是四膜虫的基因内区自行拼接的。
与此同时，Sidney Altman等在从事RNase P 的研究中也发现了这一现象，RNase P是细菌和高等生物细胞里都有的一种tRNA加工酶，它能在特定的位点上切开tRNA前体。
早在1978年Sidney Altman等就从纯化的RNase P中分离出了一中蛋白质和一种RNA（MRNA），1RNA单独存在时均不具备RNase P活性，而只早期的实验结果是蛋白质和M1有当两者混合后才可恢复RNase P活性。
1983年，就在Thomas Cech等发现RNA能自行拼接后的两年后，Sidney Altman等就证明：在较高的Mg2+浓度下，RNase P中的RNA（MRNA）具有催化tRNA前体成熟的功能，而其蛋白质组分1却不具备此催化功能。
但根据当时催化剂不仅能加快反应速度，而且在反应前后催化剂本身不发生改变的准确定义，在Thomas Cech等发现四膜虫26SrRNA前体IVS的自身拼接后，科学家们还排斥它作为生物催化剂的资格，认为那是一种自体催化反应，拼接后的成熟rRNA与前体不同，商不能被看成是严格意义上的催化剂。
Sidney Altman等的发现就从实验上消除了这一异议，原因是RNase P所催化的反应收拾一种异体分子间的反应，而该反应正是在RNA的催化下完成的。
此后，1984年《Science》发表的题为《First True RNA Catalyst》的报道标志着RNA催化剂的正式诞生。
核酶
1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性 在体外的多种酶活性 核酶是一种金属依赖酶 结构与功能的关系 引导序列: 中的6个嘌呤核苷酸序列 引导序列:IVS中的 个嘌呤核苷酸序列 中的 5'CUCUCU3' ' 3'GGGAGG5' G结合位点 结合位点:IVS 中的 P7茎区 茎区 结合位点 空间结构
30
3' HO-G
GMP,GDP,GTP
Ⅰ
p 5
P-G 3' OH
p Mg
2+
类 内 含 子 的 剪 接 机 制
Mn
2+
p
p
P-G
3 HO
Intervening sequence,IVS)
2'
p 5'
HO-A
Ⅱ 类 内 含 子 的 剪 接 机 制
p Mg 2+
3 '
3' OH
p-A p
p P-A
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶,是核 糖核蛋白体复合物,能剪切所有tRNA前体的 5'端,除去多余的序列,形成3'-OH 和 5'磷酸末端. RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成. 体外: M1RNA具催化作用 蛋白质作为辅助因子 体内: M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的. 2,1剪切机制 Mg 2+ 2,2结构与功能的关系 M1RNA 5'端完 整结构对维持催化活性是必需的.
单金属离子催化
双金属离子催化
锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图
三个双螺旋区 13个核苷酸残基保 守序列 剪切反应在右上方 GUX序列的3'端 自动发生
第七章 核 酶
第七章核酶（Ribozyme)第一节核酶（ribozyme)一剪接型核酶二剪切型核酶第二节脱氧核酶（deoxyribozyme)第三节核酶的应用一抗HIV感染二抗肝炎病毒感染三肿瘤治疗Thomas R.Cech核酶的发现：T.Cech的工作T.Cech的重要发现开始于1982年研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子（intron），如何从RNA分子中剪切下来的。
根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。
T.Cech的工作研究对象：原生动物四膜虫（Tetrahymena Thermophila）：含有一种RNA，其组成中除了核糖体RNA外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequenc，IVS）。
研究发现：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。
催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。
Cech的实验结论：∙IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。
∙相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程。
在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末端连接起来。
即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA。
∙RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应。
Sidney AltmanS.Altman的研究工作：研究目的：t-RNA分子的剪接过程研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶P（ribonuclease P，RNase P ）中的RNA能够切割tRNA前体的5’端。
S.Altman的实验结论：•过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。
•而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。
第十二章 核酶
2、核酶的抗肿瘤作用
针对多药耐药性基因设计核酶
多药耐药性( mult idrug resistnce, MDR) 是指
肿瘤细胞对一种化疗药物表现出耐药性，同时对其
他许多结构不同、作用靶点亦不相同的化疗药物也
表现出交叉耐药的现象，是通过化疗药物治疗肿瘤
急需突破的一大难题。
Hiroyuki(1993)设计一个特异性切割MDR1 mRNA 序列的锤 头状核酶，在体外对 MDR1 mRNA进行切割，显示锤头状核 酶能切割MDR1 mRNA 且使MDR恢复显性。 Wang等(2003) 设计并合成一个抗MDR1的锤头状核酶，由 一个含有RNA 聚合酶П启动子的逆转录病毒载体将其输送到 人肝癌细胞系HepG2 中，结果显示转染了锤头状核酶的细胞 对阿霉素敏感，并有MDR1表达量的降低。这说明无论用逆转 录病毒载体还是用脂质体转染抗 MDR1 的核酶都有可能有选 择的适用于MDR 的治疗。 Gao等(2007) 在体外使重组核酶仅在乳腺癌细胞中表达，而 在非乳腺癌细胞中不表达；化学敏感性评估结果显示在经转 染的细胞中，对阿霉素的抗药性降低了15倍, 对长春花碱的 抗药性降低32倍。
根据核酶的结构和催化反应：
RNA和蛋白质复合物：核糖核酸酶P。 小分子的RNA：能够进行分子内自我切割反应，且不需蛋 白质参与。这些RNA分子可以分为两个部分，一部分是底 物，另一部分是酶。将具有酶活性的序列克隆后可制成人 工核酶去作用于独立的底物。 Ⅰ、Ⅱ型内含子：将自身从前体mRNA中剪接出去的作用 共同点：都涉及磷酸二酯键的切割或连接。它们作用的底物 是RNA，可以是RNA分子本身，也可以是别的RNA分子。
在的二期临床试验中，Mit suyasu等(2009) 用逆转录病毒载体 将抗HIV核酶导入到造血干细胞中，然后将造血干细胞注入到感 染 HIV 的患者体内，结果38名患者携带了该种疗法所使用的完 整拷贝。研究结果发现, CCR5是HIV-1 R5 毒株的重要细胞复 合受体之一，该受体在 HIV-1感染初期起重要的作用，但是它 的缺失对宿主是无关的，因此CCR5 可作为核酶切割的理想靶点。
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核酶的发现与基本内容
什么是核酶
核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA 序列。
核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
核酶的发现
1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 和S.Altman因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
(内含子：断裂基因的非编码区，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。
前体：修饰加工前，刚刚转录出来的RNA)
核酶的特点
核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有的还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。
更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其他的mRNA分子。
（反义RNA：与mRNA互补的RNA分子。
由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，抑制了该mRNA的翻译。
）
核酶的作用
水解作用，即磷酸二酯酶作用
磷酸转移作用，类似磷酸转移酶作用（催化磷酸基团由供体转移到接纳体）。
脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用（在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸）。
RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。
核酸内切酶可以催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。
有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷酸基团留在3′位置上，称为5′-内切酶;而有些仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。
能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，简称限制酶)。
当外源DNA 侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修。
饰，不被水解，从而得到保护。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。
Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。
因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。