酶九章-核酶 PPT课件
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核酶
4、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型 肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作 用的研究
5、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用 发夹核酶抑制HIV-Ⅰ基因表达，并在Ⅰ期临床实验中受到 良好效果。
蓝（N.
Lan）等对镰形细胞贫血突变的β珠蛋白
mRNA（βS RNA）进行了修复 。
4 核酶技术在化妆品方面应用
随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病 的研究。 采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上 完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康， 已经成为高科技化妆品研究的一个热点
化学本质是RNA； 底物：RNA、肽键、ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性），依据碱基配对； 催化效率低 是一种金属依赖酶
三、核酶（ribozyme）的分类
锤头核酶 发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应 剪接型核酶
RNaseP I内含子
II内含子
2.剪切型核酶
2 白血病是造血系统的恶性肿 瘤,目前尚缺少有效的治疗方法 。核酶的发现，尤其是锤头状 核酶，为白血病的基因治疗带 来了新的希望。
核酶的应用
3 抗肿瘤治疗
核酶是天然的具有催化能力的RNA分 子，能特异性地催化RNA剪接。 针 对某些病原或肿瘤的基因设计特异性 核酶，并将其导入细胞以阻断或降低 这些基因在细胞内的表达，最终可达 到抑制病原增殖、肿瘤扩散的目的。
3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应；
酶九章-核酶 PPT课件
基因治疗的主要策略可以分为: (1) 向体内导入外源基因取代体内 的有缺陷的基因发挥作用； (2) 对致病基因进行抑制。
其中:第二种方法是用反义核 酸或核酶通过干涉致病基因的转 录或翻译而清除其表达产物。
对医疗应用来说最主要的还 是那些具有切割特定RNA顺序，从 而可以在体内抑制某些有害基因 的核酶
在体外，组Ⅱ内含子的剪接 是经过两个转酯化反应来实现的， 无蛋白质参与。
组Ⅰ和组Ⅱ内含子的主要差 别是第一步反应的化学机制。
在组Ⅰ内含子中，外部的鸟 苷的3’-羟基作为进攻基团，而在 组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟 基起作用(图 7-4b)。
这个反应的结果形成一个带突环 的内含子-3’外显子分子，其中第 一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯 键与内含子的A相连。在第二步反 应中，5’外显子的3’-羟基进攻内 含子-3’外显子连接点，结果是两 个外显子相连，并释放出带有突 环的内含子。
第九章
核 酶 工 程
1981年Cech等发现四膜虫的核 糖体前体RNA可以在没有蛋白 质存在的情况下自身催化切除 内含子，完成加工过程。
该具有催化活性的RNA的 发现改变了传统上“酶是蛋白 质” 的观念，从此对具有催化 活性的RNA，即核酶(ribozyme) 的结构、催化机制以及应用的 研究日益深入。
剪接型 核酸酶
1、剪切型核酶 ——催化自身或者异体RNA的切 割，相当于核酸内切酶。
——主要包括锤头型核酶，发夹 型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶， 以及有蛋白质参与协助完成催化 的RNaseP
核酸酶的结构
锤头状模型
核酸酶 的结构
发夹模型
自身剪切的核酸 酶的二级结构
2、剪接型核酶 ——实现mRNA前体自我拼接， 具有核酸内切酶和连接酶两种活 性。 ——主要包括组I内含子和组II内 含子
第9章 核糖体和核酶
25
26
RNA在生命起源 RNA在生命起源 中的地位及其演 化过程
27
生命是自我复制的体系
三种生物大分子，只有 三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体 既具有信息载体 功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA 功能又具有酶的催化功能。因此，推测 可能是生命起源中最早的生物大分子。 可能是生命起源中最早的生物大分子。 核酶(ribozyme)：具有催化作用的RNA。 ：具有催化作用的 核酶 。 由RNA催化产生了蛋白质 催化产生了蛋白质
9
核糖体的化学组成
10
核糖体的装配
原核生物核糖体的装配 ◆小亚基的rRNA和蛋白质的装配关系: 小亚基的rRNA和蛋白质的装配关系: 小亚基的rRNA和蛋白质的装配关系 组成核糖体的蛋白质和rRNA 在大小 组成核糖体的蛋白质和 rRNA在大小 rRNA 亚基中均有一定的空间排布。 亚基中均有一定的空间排布。
5
核 糖 体 的 大 小 亚 基
6
Mg2+ 浓度对大小亚基的聚合和解离的 影响: 影响:
70S 核糖体在Mg 的浓度小于1mm/L的溶液中 ◆70S 核糖体在 Mg2+ 的浓度小于 1mm/L 的溶液中 易解离; 易解离; 浓度大于10 10mm/L, ◆当Mg2+ 浓度大于10mm/L, 两个核糖体通常形 100S的二聚体。 成100S的二聚体。
21
r蛋白质的主要功能
折叠成有功能的三维结构是十分重要的； 对rRNA 折叠成有功能的三维结构是十分重要的； 在蛋白质合成中, 某些 蛋白可能对核糖体的构象 在蛋白质合成中 某些r蛋白可能对核糖体的构象 微调”作用； 起“微调”作用； 在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中, 核 在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中 糖体蛋白与rRNA共同行使功能。 共同行使功能。 糖体蛋白与 共同行使功能4核糖体的类型
---酶----生物化学ppt课件
四氢叶酸。
H
N NH
H2N
H
N
N
CH2 NH H
OH H
COOH
CH2
O
CH2
C NH CH COOH
四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3, -CH2-, -CHO 等的载体，参与多种生物合成过程。
维生素B12和B12辅酶 维生素B12又称为钴胺素。维生素B12分子中与
Co+相连的CN基被5’-脱氧腺苷所取代，形成 维生素B12辅酶。 维生素B12辅酶的主要功能是作为变位酶的辅酶， 催化底物分子内基团(主要为甲基)的变位反应。
立体异构专一性：这类酶不能辨别底物不同的立体异构体，只对其中的某一种 构型起作用，而不催化其他异构体。包括旋光异构专一性和几何异构专一性。
易变敏感性：易受各种因素的影响，在活细胞内受到精密严格的调节控制。
二、酶的化学本质及结构功能特点
1.发展史
(1)酶是蛋白质: 1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观
(2) 转移酶 Transferase
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的 基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH
NH2
O
CH3CCOOH HOOCCH2CH2CHCOOH
O
NH2
3) 水解酶 Hydrolase
2.酶的组成
单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸
（简单蛋白质）
酶等。
酶
酶蛋白
（apoenzyme）
双成份酶
辅酶
（结合蛋白质） 辅因子 （coenzyme)
H
N NH
H2N
H
N
N
CH2 NH H
OH H
COOH
CH2
O
CH2
C NH CH COOH
四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3, -CH2-, -CHO 等的载体，参与多种生物合成过程。
维生素B12和B12辅酶 维生素B12又称为钴胺素。维生素B12分子中与
Co+相连的CN基被5’-脱氧腺苷所取代，形成 维生素B12辅酶。 维生素B12辅酶的主要功能是作为变位酶的辅酶， 催化底物分子内基团(主要为甲基)的变位反应。
立体异构专一性：这类酶不能辨别底物不同的立体异构体，只对其中的某一种 构型起作用，而不催化其他异构体。包括旋光异构专一性和几何异构专一性。
易变敏感性：易受各种因素的影响，在活细胞内受到精密严格的调节控制。
二、酶的化学本质及结构功能特点
1.发展史
(1)酶是蛋白质: 1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结晶确立酶是蛋白质的观
(2) 转移酶 Transferase
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的 基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH
NH2
O
CH3CCOOH HOOCCH2CH2CHCOOH
O
NH2
3) 水解酶 Hydrolase
2.酶的组成
单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸
（简单蛋白质）
酶等。
酶
酶蛋白
（apoenzyme）
双成份酶
辅酶
（结合蛋白质） 辅因子 （coenzyme)
核酶抗体酶ppt课件
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3、核酶作用的特点
化学本质 RNA 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性）碱基 催化效率 低 产物
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4.核酶的分类
锤头核酶
发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
RNaseP
I内含子
剪接型核酶 II内含子
2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。 3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产 物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
二、在其他领域的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
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剪切位点
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RNaseP底物的二级结构
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1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC
2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC
3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU
CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核
糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的 5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
体外： M1RNA具催化作用
蛋白质作为辅助因子
体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。
2、1剪切机制 Mg 2+
2、2结构与功能的关系 M1RNA 5‘端完 整结构对维持催化活性是必需的。
3、核酶作用的特点
化学本质 RNA 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性）碱基 催化效率 低 产物
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4.核酶的分类
锤头核酶
发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
RNaseP
I内含子
剪接型核酶 II内含子
2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。 3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产 物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
二、在其他领域的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
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剪切位点
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RNaseP底物的二级结构
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1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC
2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC
3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU
CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核
糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的 5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
体外： M1RNA具催化作用
蛋白质作为辅助因子
体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。
2、1剪切机制 Mg 2+
2、2结构与功能的关系 M1RNA 5‘端完 整结构对维持催化活性是必需的。
核酶课件(ribozyme)47页PPT
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
核酶课件（ribozyme）
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 陷入污 泥中 ——马 克思 9、学校没有纪律便如磨坊没有水。— —夸美 纽斯
10、一个人应该：活泼而守纪律，天 真而不 幼稚， 勇敢而 鲁莽， 倔强而 有原则 ，热情 而不冲 动，乐 观而不 盲目。 ——马 克思
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
谢谢！
核酶课件（ribozyme）
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 陷入污 泥中 ——马 克思 9、学校没有纪律便如磨坊没有水。— —夸美 纽斯
10、一个人应该：活泼而守纪律，天 真而不 幼稚， 勇敢而 鲁莽， 倔强而 有原则 ，热情 而不冲 动，乐 观而不 盲目。 ——马 克思
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
Chapter9核酶和抗体酶解析
Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接
需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。
Ⅱ型IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相 似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+
2．自我剪切ribozyme的分类
自我剪切ribozyme, 自我剪切的RNA结构有锤头结构和发 夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
4．金属螯和合反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
7. 光诱导反应
a.光聚合反应（二聚作用）
b.光裂解反应
四. 制备方法
i. 诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白 （例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准 的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。
几种能进行自我剪切的RNA结构
3．催化分子间反应的ribozyme的分类
如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分 子间反应。
三．Ribozyme研究进展与展望
对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其 结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得 分子更小的、高效的ribozyme
连接酶活性 金属螯合酶活性 磷酸酯酶活性
生物学意义
第二节结束
点击返回
第三节 抗体酶
一. 概念 是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变 区赋予了酶的属性。
二. 抗体酶概述
酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择结合
需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。
Ⅱ型IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相 似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+
2．自我剪切ribozyme的分类
自我剪切ribozyme, 自我剪切的RNA结构有锤头结构和发 夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。
1．酰基转移反应
2．重排反应
3．氧化还原反应
4．金属螯和合反应
5．磷酸酯水解反应
6．磷酸酯闭环反应
7. 光诱导反应
a.光聚合反应（二聚作用）
b.光裂解反应
四. 制备方法
i. 诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白 （例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准 的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。
几种能进行自我剪切的RNA结构
3．催化分子间反应的ribozyme的分类
如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分 子间反应。
三．Ribozyme研究进展与展望
对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其 结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得 分子更小的、高效的ribozyme
连接酶活性 金属螯合酶活性 磷酸酯酶活性
生物学意义
第二节结束
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第三节 抗体酶
一. 概念 是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变 区赋予了酶的属性。
二. 抗体酶概述
酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择结合
核酶课件
12级生物科学
核酶
Ribozyme
组员：鄢佳英、林伊琳、韩韵蕊、蒋少汶
目录
CONTENTS
1 2
介绍 剪接型核酶 剪切型核酶 总结
introduction splicing ribozymes cleavage ribozymes summary
3
4
1
介绍
introduction
关键词：ribozyme, structure and catalysis
接起来。
2
剪接型核酶
splicing ribozymes
第一类内含子 group Ⅰ intron
RNA分子结合游离的鸟苷或鸟苷酸，并将其3’羟基呈递给5’ 剪接位点，转酯反应连接。 第二步与之前一样。 这里释放的内含子是线形的，而非套索状。 Ⅰ类内含子比Ⅱ类小。
2
剪接型核酶
splicing ribozymes
种类
RNase P 的RNA 亚基 (RNA subunit of RNase P)
锤头型核酶 (hammerhead ribozyme)
发夹型核酶 (hairpin ribozyme)
肝炎δ 病毒核酶 (hepatitis delta virus ribozyme, HDV ribozyme)
3
4 参考
总结
summary
RIBOZYME STRUCTURES AND MECHANISMS 小型核酶的结构和催化机理 基因的分子生物学（第六版） 维基百科、谷粉搜搜、小木虫等
12级生物科学
THE END
Thanks for listening
蛋白质氨基酸侧链与RNA碱基
蛋白质骨架比RNA骨架更刚性
核酶
Ribozyme
组员：鄢佳英、林伊琳、韩韵蕊、蒋少汶
目录
CONTENTS
1 2
介绍 剪接型核酶 剪切型核酶 总结
introduction splicing ribozymes cleavage ribozymes summary
3
4
1
介绍
introduction
关键词：ribozyme, structure and catalysis
接起来。
2
剪接型核酶
splicing ribozymes
第一类内含子 group Ⅰ intron
RNA分子结合游离的鸟苷或鸟苷酸，并将其3’羟基呈递给5’ 剪接位点，转酯反应连接。 第二步与之前一样。 这里释放的内含子是线形的，而非套索状。 Ⅰ类内含子比Ⅱ类小。
2
剪接型核酶
splicing ribozymes
种类
RNase P 的RNA 亚基 (RNA subunit of RNase P)
锤头型核酶 (hammerhead ribozyme)
发夹型核酶 (hairpin ribozyme)
肝炎δ 病毒核酶 (hepatitis delta virus ribozyme, HDV ribozyme)
3
4 参考
总结
summary
RIBOZYME STRUCTURES AND MECHANISMS 小型核酶的结构和催化机理 基因的分子生物学（第六版） 维基百科、谷粉搜搜、小木虫等
12级生物科学
THE END
Thanks for listening
蛋白质氨基酸侧链与RNA碱基
蛋白质骨架比RNA骨架更刚性
酶工程 抗体酶、核酶和极端酶优秀课件
6．磷酸酯闭环反应
7. 光诱导反应
a.光聚合反应（二聚作用）
b.光裂解反应
研究展望
1． 研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功 能间关系的一般规律。 2． 获得一类新型的蛋白酶。 3． 催化天然酶不能催化的反应。
第二节 核 酶（Ribozyme)
一、核酶的概念 二、核酶的种类 三、核酶的应用 四、核酶面临的问题 五、影响核酶活性的因素
1.剪接型核酶
剪接型核酶的作用机制是通过既剪又 接的方式除去内含子（Intron)。
1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结 构相似的间隔序列，具有环状结构。通过 转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及 G-IVS，G-IVS经两次环化生成L-19IVS。 催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参 与。 剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性
缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产 生新酶.
3 引入法
将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结 合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可 利用蛋白质工程和基因工程技术
引入法举例
四、抗体酶的应用
1.戒毒:
用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗 原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水 解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。
ribozyme的发现
80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的 Thomas Cech和美国耶鲁大学的Sidnery Altman各自独立地发现RNA具有生物催化功 能.从而改变了生物催比剂的传统概念。 为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989 年度诺贝尔化学奖。
一、核酶的概念
具有生物催化功能的RNA。
核酶
一、核酶的概念
二、核酶的种类
三、影响核酶活性的因素
四、核酶的应用
五、核酶面临的问题
I
剪接机制L-19IVS
U pA G pU
5'
3'
5'外显子
3'外显子
内含子
pG-OH
pGpA
G pU
3'
U 5'
OH
第一次转酯反应
第二次转酯反应
U 5'
pU
3'
pGpA
GOH 5'3'
+GpN
引导序列
保守序列
G结合位点
剪接部位
Ⅱ型
剪接机制
互相配对。
：高度保守，
5 ’3’
金属离子的作用
1
2
3
二价金属离子参
1989
发夹核酶催化机制
环。
5‘3‘
环剪切部位
剪切部位
剪切位点。
1
2 3 4 5
五、核酶面临的问题
1、核酶催化切割反应的可逆性问题
2、提高催化效率
3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞
4、使核酶在细胞内有调控地高效表达
5、增强核酶在细胞内的稳定性
6、对宿主的损伤问题有待进一步考察。
核酶PPT课件
（三）核酶是一种金属依赖酶。
金属离子的作用：
特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程 促进RNA的总体折叠 二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，
参与过渡中间复合物的形成
C C C U C U
O
o P OA +o
HOG
3’
C C C U C U O
o P OA o
OG
过渡态
IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。
相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以 按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末 端连接起来。即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA。
RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即 催化其他分子的反应。
（三）脱氧核酶催化特征
• 裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 • 双链稳定性越高，酶活性越高 • 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。 • 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 • 组氨酸，精氨酸促进催化活性 • 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）
过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。
而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中 的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年， 核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
(Thomas Robert Cech) (SidneyAltman)
• 核酶催化切割反应的可逆性问题 • 提高催化效率 • 寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 • 使核酶在细胞内有调控地高效表达 • 增强核酶在细胞内的稳定性 • 对宿主的损伤问题有待进一步考察
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第九章
核 酶 工 程
1981年Cech等发现四膜虫的核 糖体前体RNA可以在没有蛋白 质存在的情况下自身催化切除 内含子，完成加工过程。
该具有催化活性的RNA的 发现改变了传统上“酶是蛋白 质” 的观念，从此对具有催化 活性的RNA，即核酶(ribozyme) 的结构、催化机制以及应用的 研究日益深入。
核酸酶
剪切型或 分子间催化剪切型 核酸酶
自身催化剪切型或 分子内催化剪切型 核酸酶
核酸酶
似乎最有应用前景，因为人们 对它的剪切机制和分子结构要 求已经有所了解，可以针对病 毒核酸、不良基因或恶性基因 进行人工设计、合成相应的各 种RNA或DNA片段作为核酸酶基 因，定向地剪切病毒核酸或不 良基因以及它们的转录中间产 物，抑制它们的表达，进行疾
三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)
蛋白质-RNA复合酶主要催化 tRNA前体成熟过程。
——例如S. Altman和N. Pace两个 研究组合作发现的大肠杆菌 tRNA5’成熟酶。
蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和 M1RNA两个组分构成．
——蛋白质的分子量为20kDa， ——M1RNA含有377个核苷酸。 M1RNA单独具有全酶活性， 蛋白质只是维护M1RNA的构 象。
实验证明来自不同原核细胞 RNaseP中的M1RNA具有相似的三维 结构。
——与前面几种剪切型核酶不同的是， RNaseP催化得到的产物的3’端是羟基， 5’端是磷酸。
四
组I内含子和组II内含子
组I内含子(group I intron)和组II 内含子(group II intron)
——这类核酶比较复杂，通常包 括200个以上核苷酸，主要催化 mRNA前体的拼接反应。
核酸分子在总体的催化潜 力上和蛋白质相差甚远，但由 于可以遗传和变异而被自然界 保留下来催化一些特殊的反应。
核酶由于具有许多优点而受 到重视，例如用于治疗的核酶注 射入体内不会产生免疫原性，对 具有切割活力的核酶可以更加自 由的设计其切割RNA的位点。
分子进化工程的诞生，使核 酶的研究迅速发展，人工进化出 自然界中不存在的多种功能的核 酶（包括单链DNA酶），这些研 究成果在理论和实际应用中都有 着巨大的意义。
William B. Lott等提出了锤头 型核酶催化反应的两种可能的化 学机制： ——“单金属氢氧化物离子模型” ——“双金属离子模型”)。
锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制
(a) 单金属氢氧化物离子模型，(b)双金属离子模型，(c)HDV 核酶中胞嘧啶 充当一般碱进行催化的反应机理
像蛋白质酶一样，内含子形 成高级结构的折叠结果使关键残 基形成活性部位，在辅助因子的 参与下实现自身剪接。
组I内含子能够自身剪接的是 与它们保守的二级和三级结构有 关。
除了剪接之外，组Ⅰ内含子 还可催化各种分子间反应，包括 剪切RNA和DNA、RNA聚合、核 苷酰转移、模板RNA连接、氨酰 基酯解等。
剪接型 核酸酶
1、剪切型核酶 ——催化自身或者异体RNA的切 割，相当于核酸内切酶。
——主要包括锤头型核酶，发夹 型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶， 以及有蛋白质参与协助完成催化 的RNaseP
核酸酶的结构
锤头状模型
核酸酶 的结构
发夹模型
自身剪切的核酸 酶的二级结构
2、剪接型核酶 ——实现mRNA前体自我拼接， 具有核酸内切酶和连接酶两种活 性。 ——主要包括组I内含子和组II内 含子
二 发夹型核酶
发夹型核酶的二级结构模型
50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4个 螺旋和5个突环。螺旋3和4在核酶内部形成，螺旋1(6碱基对)和2(4碱基对) 由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序是 (G/C/U)NGUC，其中N代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1和2之 间的底物RNA链上，切割反应发生在N和G之间。
核酶(脱氧核酶)的应用
基因治疗的概念出现在二十几年前， 现在已经在临床上得到了实际应用。基因 治疗最早的临床研究是1990年Blaese 等进 行的对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗， 随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病 的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展 基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等 开展了血友病B基因治疗的临床实验，并 取得比较理想的效果。
a中N,N’代表任意核苷酸；X 可以是A、U或者C,但不能是G；I、II和 III是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。 b 是锤头型核酶的立体结构模型，白色链是核酶，灰色链是底物 RNA 分子，在磷酸骨架上结合有镁离子
Symons等认为，只要具备锤 头状二级结构和13个保守核苷酸， 剪切反应就会在锤头结构的右上 方GUX序列的3’端自动发生。无 论是天然的还是人工合成的锤头 结构都由两部分构成：催化结构 域（R）和底物结合结构域（S）。
一 锤头型核酶
R. Symons等在比较了一些植 物类病毒、抗病毒和卫星病毒 RNA自身剪切规律后提出锤头结 构（hammerhead structure）状二 级结构模型。
它是由13个保守核苷酸残基 和三个螺旋结构域构成的。
——（后来Koizumi等证明只需要 11个特定保守核苷酸）。
锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图
核酸酶
酶的化学本质是蛋白质
传统观念
只有蛋白质才能有催化功能
核酸酶
上世纪80年代初 Cech和Altman各自 独立地发现
RNA
生物催化功能
酶蛋白质 只有蛋白质才能 有催化功能
？
核酸酶的作用底物
RNA DNA
核酸酶
多糖
进一步的研究发现， 一种多功能的生物催 化剂可以作用于
氨基酸酯
一、天然核酶
目前为止，在自然界中发现 的核酶根据其催化的反应可以分 成两大类： 剪切型核酶
在体外，组Ⅱ内含子的剪接 是经过两个转酯化反应来实现的， 无蛋白质参与。
组Ⅰ和组Ⅱ内含子的主要差 别是第一步反应的化学机制。
在组Ⅰ内含子中，外部的鸟 苷的3’-羟基作为进攻基团，而在 组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟 基起作用(图 7-4b)。
这个反应的结果形成一个带突环 的内含子-3’外显子分子，其中第 一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯 键与内含子的A相连。在第二步反 应中，5’外显子的3’-羟基进攻内 含子-3’外显子连接点，结果是两 个外显子相连，并释放出带有突 环的内含子。
核 酶 工 程
1981年Cech等发现四膜虫的核 糖体前体RNA可以在没有蛋白 质存在的情况下自身催化切除 内含子，完成加工过程。
该具有催化活性的RNA的 发现改变了传统上“酶是蛋白 质” 的观念，从此对具有催化 活性的RNA，即核酶(ribozyme) 的结构、催化机制以及应用的 研究日益深入。
核酸酶
剪切型或 分子间催化剪切型 核酸酶
自身催化剪切型或 分子内催化剪切型 核酸酶
核酸酶
似乎最有应用前景，因为人们 对它的剪切机制和分子结构要 求已经有所了解，可以针对病 毒核酸、不良基因或恶性基因 进行人工设计、合成相应的各 种RNA或DNA片段作为核酸酶基 因，定向地剪切病毒核酸或不 良基因以及它们的转录中间产 物，抑制它们的表达，进行疾
三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)
蛋白质-RNA复合酶主要催化 tRNA前体成熟过程。
——例如S. Altman和N. Pace两个 研究组合作发现的大肠杆菌 tRNA5’成熟酶。
蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和 M1RNA两个组分构成．
——蛋白质的分子量为20kDa， ——M1RNA含有377个核苷酸。 M1RNA单独具有全酶活性， 蛋白质只是维护M1RNA的构 象。
实验证明来自不同原核细胞 RNaseP中的M1RNA具有相似的三维 结构。
——与前面几种剪切型核酶不同的是， RNaseP催化得到的产物的3’端是羟基， 5’端是磷酸。
四
组I内含子和组II内含子
组I内含子(group I intron)和组II 内含子(group II intron)
——这类核酶比较复杂，通常包 括200个以上核苷酸，主要催化 mRNA前体的拼接反应。
核酸分子在总体的催化潜 力上和蛋白质相差甚远，但由 于可以遗传和变异而被自然界 保留下来催化一些特殊的反应。
核酶由于具有许多优点而受 到重视，例如用于治疗的核酶注 射入体内不会产生免疫原性，对 具有切割活力的核酶可以更加自 由的设计其切割RNA的位点。
分子进化工程的诞生，使核 酶的研究迅速发展，人工进化出 自然界中不存在的多种功能的核 酶（包括单链DNA酶），这些研 究成果在理论和实际应用中都有 着巨大的意义。
William B. Lott等提出了锤头 型核酶催化反应的两种可能的化 学机制： ——“单金属氢氧化物离子模型” ——“双金属离子模型”)。
锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制
(a) 单金属氢氧化物离子模型，(b)双金属离子模型，(c)HDV 核酶中胞嘧啶 充当一般碱进行催化的反应机理
像蛋白质酶一样，内含子形 成高级结构的折叠结果使关键残 基形成活性部位，在辅助因子的 参与下实现自身剪接。
组I内含子能够自身剪接的是 与它们保守的二级和三级结构有 关。
除了剪接之外，组Ⅰ内含子 还可催化各种分子间反应，包括 剪切RNA和DNA、RNA聚合、核 苷酰转移、模板RNA连接、氨酰 基酯解等。
剪接型 核酸酶
1、剪切型核酶 ——催化自身或者异体RNA的切 割，相当于核酸内切酶。
——主要包括锤头型核酶，发夹 型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶， 以及有蛋白质参与协助完成催化 的RNaseP
核酸酶的结构
锤头状模型
核酸酶 的结构
发夹模型
自身剪切的核酸 酶的二级结构
2、剪接型核酶 ——实现mRNA前体自我拼接， 具有核酸内切酶和连接酶两种活 性。 ——主要包括组I内含子和组II内 含子
二 发夹型核酶
发夹型核酶的二级结构模型
50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4个 螺旋和5个突环。螺旋3和4在核酶内部形成，螺旋1(6碱基对)和2(4碱基对) 由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序是 (G/C/U)NGUC，其中N代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1和2之 间的底物RNA链上，切割反应发生在N和G之间。
核酶(脱氧核酶)的应用
基因治疗的概念出现在二十几年前， 现在已经在临床上得到了实际应用。基因 治疗最早的临床研究是1990年Blaese 等进 行的对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗， 随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病 的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展 基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等 开展了血友病B基因治疗的临床实验，并 取得比较理想的效果。
a中N,N’代表任意核苷酸；X 可以是A、U或者C,但不能是G；I、II和 III是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。 b 是锤头型核酶的立体结构模型，白色链是核酶，灰色链是底物 RNA 分子，在磷酸骨架上结合有镁离子
Symons等认为，只要具备锤 头状二级结构和13个保守核苷酸， 剪切反应就会在锤头结构的右上 方GUX序列的3’端自动发生。无 论是天然的还是人工合成的锤头 结构都由两部分构成：催化结构 域（R）和底物结合结构域（S）。
一 锤头型核酶
R. Symons等在比较了一些植 物类病毒、抗病毒和卫星病毒 RNA自身剪切规律后提出锤头结 构（hammerhead structure）状二 级结构模型。
它是由13个保守核苷酸残基 和三个螺旋结构域构成的。
——（后来Koizumi等证明只需要 11个特定保守核苷酸）。
锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图
核酸酶
酶的化学本质是蛋白质
传统观念
只有蛋白质才能有催化功能
核酸酶
上世纪80年代初 Cech和Altman各自 独立地发现
RNA
生物催化功能
酶蛋白质 只有蛋白质才能 有催化功能
？
核酸酶的作用底物
RNA DNA
核酸酶
多糖
进一步的研究发现， 一种多功能的生物催 化剂可以作用于
氨基酸酯
一、天然核酶
目前为止，在自然界中发现 的核酶根据其催化的反应可以分 成两大类： 剪切型核酶
在体外，组Ⅱ内含子的剪接 是经过两个转酯化反应来实现的， 无蛋白质参与。
组Ⅰ和组Ⅱ内含子的主要差 别是第一步反应的化学机制。
在组Ⅰ内含子中，外部的鸟 苷的3’-羟基作为进攻基团，而在 组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟 基起作用(图 7-4b)。
这个反应的结果形成一个带突环 的内含子-3’外显子分子，其中第 一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯 键与内含子的A相连。在第二步反 应中，5’外显子的3’-羟基进攻内 含子-3’外显子连接点，结果是两 个外显子相连，并释放出带有突 环的内含子。