酶九章-核酶 PPT课件

William B. Lott等提出了锤头 型核酶催化反应的两种可能的化 学机制： ——“单金属氢氧化物离子模型” ——“双金属离子模型”)。
锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制
(a) 单金属氢氧化物离子模型，(b)双金属离子模型，(c)HDV 核酶中胞嘧啶 充当一般碱进行催化的反应机理
在体外，组Ⅱ内含子的剪接 是经过两个转酯化反应来实现的， 无蛋白质参与。
组Ⅰ和组Ⅱ内含子的主要差 别是第一步反应的化学机制。
在组Ⅰ内含子中，外部的鸟 苷的3’-羟基作为进攻基团，而在 组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟 基起作用(图 7-4b)。
这个反应的结果形成一个带突环 的内含子-3’外显子分子，其中第 一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯 键与内含子的A相连。在第二步反 应中，5’外显子的3’-羟基进攻内 含子-3’外显子连接点，结果是两 个外显子相连，并释放出带有突 环的内含子。
二 发夹型核酶
发夹型核酶的二级结构模型
50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4个 螺旋和5个突环。螺旋3和4在核酶内部形成，螺旋1(6碱基对)和2(4碱基对) 由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序是 (G/C/U)NGUC，其中N代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1和2之 间的底物RNA链上，切割反应发生在N和G之间。
第九章
核 酶 工 程
1981年Cech等发现四膜虫的核 糖体前体RNA可以在没有蛋白 质存在的情况下自身催化切除 内含子，完成加工过程。
该具有催化活性的RNA的 发现改变了传统上“酶是蛋白 质” 的观念，从此对具有催化 活性的RNA，即核酶(ribozyme) 的结构、催化机制以及应用的 研究日益深入。
a中N,N’代表任意核苷酸；X 可以是A、U或者C,但不能是G；I、II和 III是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。 b 是锤头型核酶的立体结构模型，白色链是核酶，灰色链是底物 RNA 分子，在磷酸骨架上结合有镁离子
Symons等认为，只要具备锤 头状二级结构和13个保守核苷酸， 剪切反应就会在锤头结构的右上 方GUX序列的3’端自动发生。无 论是天然的还是人工合成的锤头 结构都由两部分构成：催化结构 域（R）和底物结合结构域（S）。
三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)
蛋白质-RNA复合酶主要催化 tRNA前体成熟过程。
——例如S. Altman和N. Pace两个 研究组合作发现的大肠杆菌 tRNA5’成熟酶。
蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和 M1RNA两个组分构成．
——蛋白质的分子量为20kDa， ——M1RNA含有377个核苷酸。 M1RNA单独具有全酶活性， 蛋白质只是维护M1RNA的构 象。
核酸酶
剪接型核酶
核酸酶的分类
剪切型 核酸酶
异体催化剪切型或 分子间催化剪切型 核酸酶
自身催化剪切型或 分子内催化剪切型 核酸酶
核酸酶
似乎最有应用前景，因为人们 对它的剪切机制和分子结构要 求已经有所了解，可以针对病 毒核酸、不良基因或恶性基因 进行人工设计、合成相应的各 种RNA或DNA片段作为核酸酶基 因，定向地剪切病毒核酸或不 良基因以及它们的转录中间产 物，抑制它们的表达，进行疾
像蛋白质酶一样，内含子形 成高级结构的折叠结果使关键残 基形成活性部位，在辅助因子的 参与下实现自身剪接。
组I内含子能够自身剪接的是 与它们保守的二级和三级结构有 关。
除了剪接之外，组Ⅰ内含子 还可催化各种分子间反应，包括 剪切RNA和DNA、RNA聚合、核 苷酰转移、模板RNA连接、氨酰 基酯解等。
核酸酶
酶的化学本质是蛋白质
传统观念
只有蛋白质才能有催化功能
核酸酶
上世纪80年代初 Cech和Altman各自 独立地发现
RNA
生物催化功能
酶蛋白质 只有蛋白质才能 有催化功能
？
核酸酶的作用底物
RNA DNA
核酸酶
多糖
进一步的研究发现， 一种多功能的生物催 化剂可以作用于
氨基酸酯
一、天然核酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
目前为止，在自然界中发现 的核酶根据其催化的反应可以分 成两大类： 剪切型核酶
剪接型 核酸酶
1、剪切型核酶 ——催化自身或者异体RNA的切 割，相当于核酸内切酶。
——主要包括锤头型核酶，发夹 型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶， 以及有蛋白质参与协助完成催化 的RNaseP
核酸酶的结构
锤头状模型
核酸酶 的结构
发夹模型
自身剪切的核酸 酶的二级结构
2、剪接型核酶 ——实现mRNA前体自我拼接， 具有核酸内切酶和连接酶两种活 性。 ——主要包括组I内含子和组II内 含子
核酶(脱氧核酶)的应用
基因治疗的概念出现在二十几年前， 现在已经在临床上得到了实际应用。基因 治疗最早的临床研究是1990年Blaese 等进 行的对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗， 随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病 的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展 基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等 开展了血友病B基因治疗的临床实验，并 取得比较理想的效果。
一 锤头型核酶
R. Symons等在比较了一些植 物类病毒、抗病毒和卫星病毒 RNA自身剪切规律后提出锤头结 构（hammerhead structure）状二 级结构模型。
它是由13个保守核苷酸残基 和三个螺旋结构域构成的。
——（后来Koizumi等证明只需要 11个特定保守核苷酸）。
锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图
实验证明来自不同原核细胞 RNaseP中的M1RNA具有相似的三维 结构。
——与前面几种剪切型核酶不同的是， RNaseP催化得到的产物的3’端是羟基， 5’端是磷酸。
四
组I内含子和组II内含子
组I内含子(group I intron)和组II 内含子(group II intron)
——这类核酶比较复杂，通常包 括200个以上核苷酸，主要催化 mRNA前体的拼接反应。
核酸分子在总体的催化潜 力上和蛋白质相差甚远，但由 于可以遗传和变异而被自然界 保留下来催化一些特殊的反应。
核酶由于具有许多优点而受 到重视，例如用于治疗的核酶注 射入体内不会产生免疫原性，对 具有切割活力的核酶可以更加自 由的设计其切割RNA的位点。
分子进化工程的诞生，使核 酶的研究迅速发展，人工进化出 自然界中不存在的多种功能的核 酶（包括单链DNA酶），这些研 究成果在理论和实际应用中都有 着巨大的意义。