固定化酶技术ppt课件
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酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸残基不发生变化）
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
6
固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
固定化酶技术
1
1 原理 2 特点 3 制备方法 4 应用 5 发展趋势及建议
2
1 原理
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
3
2 特点
固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：
稳定性高； 酶可反复使用； 产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开； 固定化酶的反应条件易于控制 生产可连续化和自动化，节约劳动力； 设备小型化、可节约能源。
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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wenku.baidu.com
3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
4
缺点：
固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大 固定化时，酶活力有损失 长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活 只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大
分子底物不适宜 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅
助因子的反应
5
3 制备方法
基本原则：
必须注意维持酶的催化活性及专一性。
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3.2.3抗体耦联法 大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供
偶联用的官能团可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷 氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔 玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保 持了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体 上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合 实现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免 疫吸附活性也提高了3倍。 3.2.4生物素--亲和素亲合法 生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(<0．0001％)的中性小分子辅酶。亲 和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解 离常数10~5mol／L) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一 性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、 基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。Min等将生物素羧化载体蛋 白、片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白 定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定 性和固定效率均大大提高。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团 共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间 取向的目的。 3.2.2氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子， 通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。通过定点突变在枯草蛋 白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。 经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋 白酶分子，取得了较好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大 提高。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
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1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白
之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
3.1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载
体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶
分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物
不适用。
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(1)网格型
将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
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4 应用
4.1 在食品中的应用 4.2 在环境工程中的应用 4.3 医学和临床分析的应用
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4.1 在食品中的应用
4.1.1 固定化木瓜蛋白酶应用于啤酒澄清 长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得
避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离
子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和 的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
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固定化应该有利于生产自动化、连续化。 载体能抗一定的机械力。
固定化酶技术
1
1 原理 2 特点 3 制备方法 4 应用 5 发展趋势及建议
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1 原理
水溶性酶
水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
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2 特点
固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：
稳定性高； 酶可反复使用； 产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开； 固定化酶的反应条件易于控制 生产可连续化和自动化，节约劳动力； 设备小型化、可节约能源。
固定化酶应有最小的空间位阻。 酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反
复使用。 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、
产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
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3.1 固定化酶的传统制备方法
3.1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻 璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温 和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶 失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有 活泼的表面。
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缺点：
固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大 固定化时，酶活力有损失 长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活 只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大
分子底物不适宜 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅
助因子的反应
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3 制备方法
基本原则：
必须注意维持酶的催化活性及专一性。
12
3.2.3抗体耦联法 大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供
偶联用的官能团可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷 氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔 玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗体酶Fab片段保 持了很好的催化活性。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体 上的氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上的酰肼通过腙键结合 实现抗体分子的定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高的同时免 疫吸附活性也提高了3倍。 3.2.4生物素--亲和素亲合法 生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微(<0．0001％)的中性小分子辅酶。亲 和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点(解 离常数10~5mol／L) 。生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素有高专一 性的、极强的亲和力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、 基因工程和蛋白质分离等领域中独特有力的工具。Min等将生物素羧化载体蛋 白、片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白 定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定 性和固定效率均大大提高。
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3.2固定化酶的新型制备方法
3.2.1共价固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化学基团。选择性地利用酶分子表面远离
活性位点的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团 共价交联来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间 取向的目的。 3.2.2氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子， 通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。通过定点突变在枯草蛋 白酶(subtil2isin)分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)残基。 经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草蛋 白酶分子，取得了较好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大 提高。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球内，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直径一般只有 几微米至几百微米， 所以也称为微囊化 法。
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1.3结合法 酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定
的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫 共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的 脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂， 反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高 的固定化酶。
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1.4交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白
之间的交联，使酶分子和多功能试 剂之间形成共价键，得到三向的交 联网架结构，除了酶分子之间发生 交联外，还存在着一定的分子内交 联。多功能试剂制备固定化酶方法 可分为：(1) 单独与酶作用；( 2) 酶 吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功 能团的载体，再连接酶。交联剂的 种类很多，最常用的是戊二醛，其 他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二 联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。 交联法的优点是酶与载体结合牢固， 稳定性较高；缺点是有的方法固定 化操作较复杂，进行化学修饰时易 造成酶失活。
3.1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载
体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶
分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物
不适用。
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(1)网格型
将酶包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的 固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包 埋法。
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4 应用
4.1 在食品中的应用 4.2 在环境工程中的应用 4.3 医学和临床分析的应用
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4.1 在食品中的应用
4.1.1 固定化木瓜蛋白酶应用于啤酒澄清 长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得