半抗原免疫分析全面
免疫分析法
人改型抗体（reshaped humanized antibody）；
小分子抗体； 双特异性抗体（bispecific antibody）等。
在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效
应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原
或抗体的检测，用于免疫学诊断。
在药物分析中，免疫分析法的 应用主要集中在以下几方面：
(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度 和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以 便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况； (2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量 易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有 交叉的药物血液浓度进行监测； (3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有 效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测； (4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。
热力学分析： 半抗原和载体蛋白结合后热力
学特征会有变化，差异可通过差示扫描量热法 （DCS）等方法测定。
定量测定方法 相对含量测定法： 通过 ELISA 法比较半抗原
与载体蛋白的相对结合量。
绝对含量测定法： 半抗原具有与载体蛋白完
全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波 长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反 应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生 反应。
主要内容
一、概述
二、抗原
三、抗体与免疫反应
四、免疫分析方法及应用
五、免疫扩散法
免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析， 特点是抗体/抗原成为分析试剂。
1、抗体的结构与功能
抗体泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞 产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同 的重链和两条相同的轻链组成 常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白 中的含量约70%
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
7.免疫分析1
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免疫应答的动力学
当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，
特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆
细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发
现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，
而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢
的响应(初次应答)．但若动物以前遇到过这种抗原，则会出
16
五种免疫球蛋白的比较
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抗体的制备
多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的 血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从 血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种 动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并 非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品 都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。
除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、 耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。
32
8.2.2 分离方法的分类
免疫分析中常用的分离方法
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二抗
抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开 始使用的， 二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体， 也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨 大的进步。
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(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关， 对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如， 多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸 或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨 酸，则它会表现出免疫原性．由此可见，带芳香环 氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性 有重要的贡献。
择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、 及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清， 培养上清液或腹水。
高考知识能力提升专题31 免疫调节知识拓展之(一)抗原相关知识
高考知识能力提升专题31 免疫调节知识拓展之（一）抗原1.抗原的性质（1）基本特性①免疫原性指抗原能被B、T细胞表面特异性抗原受体（TCR或BCR）识别及结合，产生适应性免疫应答。
②免疫反应性指抗原与其所诱导产生的免疫应答效应物质（活化的T/B细胞或抗体）特异性结合的能力。
同时具有免疫原性和免疫反应性的物质称为完全抗原，结构复杂的蛋白质大分子通常为完全抗原。
然面，某些小分子物质单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，成为完全抗原，此类小分子物质称为半抗原，又称不完全抗原。
半抗原可与免疫应答效应物质结合，具备免疫反应性。
（2）抗原特异性①定义即抗原刺激机体产生适应性免疫应答及其与应答效应产物发生结合均显示专一性，某一特定抗原只能刺激机体产生针对该抗原的活化T/B细胞或抗体，且仅能与该淋巴细胞或抗体发生特异性结合。
②表位——抗原特异性的决定因素Ⅰ.定义表位是抗原分子中决定免疫应答特异性的特殊化学基团，是抗原与T/B细胞抗原受体（TCR/BCR）或抗体特异性结合的最小结构与功能单位。
Ⅱ.组成表位通常由5~15个氨基酸残基组成，也可由多糖残基或核苷酸组成。
Ⅲ.种类a.线性表位：线性表位由连续的氨基酸序列构成（下图E1、E3），T细胞仅识别由抗原递呈细胞（APC）加工后与主要组织相容性复合体（MHC）结合并提呈到APC表面的线性表位，此类表位称T细胞表位。
由8~10个氨基酸组成的是CD8+T细胞表位，13-17个氨基酸构成CD4+T细胞表位。
b.构象表位：由不连续但空间上相邻的多个氨基酸构成构象表位（下图E2）。
大多数构象表位和少数线性表位无需APC加工和提呈，能直接被B细胞识别，属于B细胞表位，一般由5~15个氨基酸构成。
Ⅳ.数量天然蛋白大分子通常有多个表位，属于多价抗原，能诱导机体产生多种特异性抗体。
一个半抗原相当于一个表位。
半抗原免疫分析(全面)
(1)放射免疫分析
(radioimmunoassay，RIA)
(2)酶免疫分析
(enzyme immunoassay，EIA)
(3)化学发光酶免疫分析
(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)
(4)荧光免疫分析法
(fluorescence immunoassay，FIA)
农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防 腐剂、植物激素等半抗原
在食品安全、植物学、环境检测 等领域，主要是半抗原类物质。
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抗体
antibody,Ab
抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁； 两者既是好朋友，又是一对冤家。
一、基本概念
1. 抗体（Antibody，Ab）
指B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分 化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异 性结合的免疫球蛋白。
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（2）基质干扰的消除
掩蔽剂（缓冲液调整） 样品稀释 样品前处理：净化
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linked immunosorbent immunoassay)
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ELISA简介
（一） ELISA技术的原理
间接法 夹心法 竞争法
夹心法 Sandwich
竞争法
（二） ELISA所用试剂材料
1、固相 2、酶 3、底物 4、缓冲液 5、仪器
1、固定相
聚次亚乙烯
2、最常用的标记酶
(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)
在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在
反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之
后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
免疫分析技术基本原理
免疫分析技术基本原理WORD免疫分析技术基本原理利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。
按其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。
抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的免疫球蛋白。
分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD五个亚型。
不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构一样。
不同亚型出现的先后顺序不同，在血清中的含量不同，在机体中出现的地点不同。
抗原抗体反应的特性1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。
高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性2特异性抗原抗体的结合产生在抗原的决意簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
3最适比例4敏理性化学比色法的敏感度为mg/ml水平。
酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。
免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。
标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。
例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
固相免疫测定的原理基础:抗原或抗体的固相化与抗原或抗体的酶标记。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
双抗体夹心法原理此法适用于检验各种卵白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
WORD双抗原夹心法原理用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
免疫分析方法
步骤：
A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙 烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则 与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附 的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用 光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。
1.2 免疫电泳
免疫电泳是一种将区带电泳和
双向免疫扩散相结合的免疫化
学分析技术。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板 上进行电泳，使其中的各 种成分因电泳迁移率的不 同而被分离成肉眼不可见 的区带。 停止电泳后，在与电泳方 向平行的槽内加入相应抗 血清，使抗原和抗体呈双 向扩散，已分离的各抗原 与相应抗体在琼脂中扩散 而相遇，在二者比例合适 处形成肉眼可见的沉淀弧。
（三）竞争法
酶联免疫吸附法ELISA
ELISA的基本原理和方法
ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
基本原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）
基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反 应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与 吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；
D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色 的改变与所加的待检标本溶液中的抗原 量成正比。
（二）间接法
间接法是检测抗体 最常用的方法，其 原理为利用酶标记 的抗抗体以检测已 与固相结合的受检 抗体，故称为间接 法。
免疫分析法
(2) 有机探针
荧光黄 常用的探针 荧光产率高，有较好的光稳定性和低的温度系 数。其缺点是斯托克斯位移较小。 在碱性的条件下，荧光黄与免疫球蛋白IgG的 自由氨基起反应. 罗丹明类化合物 广泛用来标记抗体 和荧光黄相比，其荧光产率不如荧光黄，可是 其发射波长较长，样品背景干扰较少。此外， 罗丹明类亦常作为能量转移的接受体。
(3) 金属螯合物
某些稀土金属离子会与某些配位体生成会发强荧光的配 合物。
如：Eu(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Nd(Ⅲ)与 β-二酮衍生物 对-氨基甲酰三氟丙酮 聚氨羧酯盐 邻菲罗啉
2．荧光免疫检测法的类型
（1） 均质检测法
均质检测法不需要分离步骤，方法简便快速， 但它常受到来自背景（血清）的干扰，该法系 根据已标记抗原联接于抗体时发生已标记抗原 荧光性质的改变。通常将均质检验法分为：
酶不稳定、光度分析线性范围窄 。
竞争型酶联免疫法测定氯霉素含量示意图
四.发光免疫分析法
荧光免疫分析法 化学发光免疫分析法 以荧光物质或化学发光反应物质作为标记物。 优点： 专一性强 灵敏度高 稳定性好，可避免放射性污染 标记物不同，因而检测方法也不同
A．荧光免疫分析法 Fluonescense Immuuoassay 1．荧光探针 （1） 一般要求 a 检测最常遇到的样品为血清，它有很高的荧光
c. 荧光激发转移
如荧光黄作为给予体，罗丹明作为接受体，荧 光黄的荧光与罗丹明的吸收光谱重叠，后者可 吸收前者的荧光。 例：吗啡的测定
i) 用荧光黄（F）标记抗原 罗丹明（R）标记抗体 Ag+AgF+AbR (Ag-AbR) + (AgF-
AbR) Ag的存在减少了荧光的猝灭程度
免疫分析法
The derivatives of AMPPD are superior than the parent compound to the lighting rates and signal intensities.
（3） 酶标记物GOD和G-6-PDH 利用某些酶作为标记物，然后通过标记的酶催 化生成的产物，再作用于发光物质，以产生生 物发光和化学发光。 葡萄糖 （4）固相法发光免疫分析 它不需要离心处理，操作简便，精确度高， 所用固相支持物主要有聚苯乙烯制的管和球
抗体和抗原（Antigen , Antibody）
免疫学的重要对象是抗原和抗体的反应问题。 抗原是一种外来物质，当其进入动物体内能 引起抗体的产生，并能和抗体反应的物质。 抗体 (antibody . Ab) 与抗原 (antigen . Ag) 的结合具有极高的专一性和亲合性。 不能诱导产生抗体，但能和适当抗体起反应， 即有免疫反应性的简单分子称为半抗原。
二. 放射性免疫分析（RIA）
Berson和Yallow 将免疫反应与分析化学相结合创立了放射性免疫分析法。 荷尔蒙的测定 先将荷尔蒙注入天竺鼠体内 对抗此抗原的抗体（Ab） Ag* + Ab === Ag*-Ab 要测定一病人的血清标本中荷尔蒙的浓度， Ag + Ag*-Ab === Ag-Ab + Ag* ( + Ag*-Ab ) 测定Ag*，可计算标本中所含有的荷尔蒙（Ag）浓度
Relative § ¶ 5 -100 14 84 -17 44 ---
b．吖啶酯类 不需要催化剂 优点： 高量子产率，低背景信号和易于与蛋白质连接，主要用 于标记半抗原和蛋白质。 缺点： 光发射是瞬时的
The molecular structure of the used acridinium ester NHS
免疫分析法
（1）半抗原和载体结合的化学反应
多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基 形成肽键；与蛋白质或多肽的游离羧基缩合 形成肽键。 甾体：通过含游离羧基的甾体衍生物与载体 蛋白相连。 抗生素：ß-内酰胺环在偏碱性条件下可以与 蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合； 氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实 现药物和载体蛋白的连接。
免疫原的制备
免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有 免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐 剂。 水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的 免疫原。 弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以 及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达 到油包水的程度。 不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。
动物免疫
通常的免疫动物为家兔和羊。 免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大 腿肌肉、皮下多点、静脉。 免疫抗原量通常为1~10mg或50~100mg。
试血及效价测定
家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量 0.5ml。 不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按 1:1混合，37℃保温2h后观测血细胞的凝聚情 况，即可测得免疫血清的效价。
免疫分析法
一、抗原
1、药物分子的抗原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物 也是完全抗原。 2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性 可能会发生改变。
一、抗原ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清， 通常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。 常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白 蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋 白（KLH）等。
（2）半抗原和载体的选择原则
半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗 体反应的微环境；合理利用分子类似物之间 的交叉反应。 载体：载体对监测系统的影响；载体效应在 免疫过程中的影响。
抗原的免疫原性和反应原性分析
抗原的免疫原性和反应原性分析抗原是指那些能够诱导机体免疫系统产⽣免疫应答，⼜能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发⽣特异性反应的物质。
抗原具有两个重要的特征：免疫原性与反应原性。
免疫原性即能够刺激机体即使免疫细胞活化、增殖、分化⽽产⽣特异抗体或致敏淋巴细胞的能⼒。
反应原性是指抗原能与由它刺激所产⽣的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能⼒，也叫免疫反应性。
我们把同时具有免疫原性和反应原性的物质称为完全抗原，如病原体、微⽣物、异种蛋⽩等；只具有反应原性的物质称为半抗原，多糖、类脂、青霉素、磺胺等。
半抗原没有免疫原性，不会引起免疫反应。
但在某些特殊情况下，如果半抗原和⼤分⼦蛋⽩质结合以后，就获得了免疫原性⽽变成完全抗原，也就可以刺激免疫系统产⽣抗体和效应细胞。
但有些简单半抗原既⽆免疫原性也没有反应原性，但可以阻⽌抗体与相应抗原或者复合半抗原结合。
就⼀般情况⽽⾔，具有免疫原性的物质均具有反应原性。
有许多天然物质可诱导免疫应答，其中⼤分⼦蛋⽩质和多糖具有强免疫原性，⼩分⼦多肽及核酸也具有免疫原性。
⼤分⼦蛋⽩质（M>10000），可含有⼤量不同的抗原决定簇，是最强的免疫原。
如异种⾎清蛋⽩、酶蛋⽩及细菌毒等。
多糖也是重要的天然抗原，纯化多糖或糖蛋⽩、脂蛋⽩以及糖脂蛋⽩等复合物中的糖分⼦部分都具有免疫原性。
并且在⾃然界，许多微⽣物有富含多糖的荚膜或胞壁，细菌内毒素是脂多糖，以及⼀些⾎型抗原也是多糖。
还有就是虽然核酸分⼦多⽆免疫原性，但如与蛋⽩质结合形成为核蛋⽩则有免疫原性。
此外，多肽类激素如胰岛素虽为⼩分⼦量（6000）但也具有免疫原性。
凡具有免疫原性的物质，其分⼦量都较⼤，⼀般在1万以上，⼩于1万者呈弱免疫原性，低于4000者⼀般不具有免疫原性。
许多⼩的免疫性原性分⼦可激发细胞免疫，⽽不产⽣抗体。
亦有⼤分⼦量物质，如明胶分⼦量可达10万，但因其为直链氨基酸结构，易在体内降解为低分⼦物质，所以呈弱免疫原性。
可见免疫原性除与分⼦量有关外，还与其化学结构相关。
生物分析实验四_免疫分析法
8
三、基础知识
2.抗原一抗体反应的特点
3）.最适比例性
抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有 当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强 的结合反应.
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三、基础知识
3.分类
l 非标记免疫分析技术 l 标记的免疫分析技术
基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免 疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监 测的目的。
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三、基础知识
6）化学发光免疫技术（CLIA ）
光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态， 当回复至基态时发出较长波长的可见光。
生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产 能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多 余的能量以光子形式放出。
化学发光：是指在某些特殊的化学反应中，反应的中 间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激 发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。
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三、基础知识
3.分类
3）放射免疫标记技术（RIA）
基本原理:根据抗原抗体特异性结合的原理，以 放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定 性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。
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三、基础知识
3）放射免疫标记技术（RIA）
优点：灵敏、特异、简便易行、用样量少等，常可 测至皮摩尔，特别适用于激素，多肽等含量微少物 质的超微量分析。 缺点：有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样 品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会 影响结果等。
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三、基础知识
4.抗原及其制备
1）全抗原与半抗原
人工完全抗原:药物(半抗原) 本身不具免疫原性,只 有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽) 共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大 分子载体物质结合后所形成的全抗原.
免疫放射分析法
免疫放射分析法一、原理免疫放射分析法 (Immunoradiometric assay, IRMA) 是用过量的放射核素标记抗体(*Ab) 和限量的抗原或半抗原(Ag) 结合，形成 Ag*Ab，其放射性和所加 Ag 的量呈正相关。
如以不同量的Ag标准品求出与Ag*Ab放射性的量效关系，即可从待测样品在相同条件下测得的Ag*Ab放射性求出待测样品的量。
[Ag] + [*Ab] [Ag*Ab]抗原过量抗体复合物1.从原理的角度讲，IRMA的主要特点包括以下几方面。
2.属于非竞争性抗原抗体结合反应。
3.抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈正相关。
4.因为不存在竞争结合反应，低剂量区没有不确定因素，因此灵敏度较高。
5.分离步骤的主要目的是把 *Ab和Ag*Ab分开。
由于 *Ab和Ag*Ab都含球蛋白，分子量也比较接近，很多在RIA中常用的分离方法都不能用，需要用特异抗体作分离剂。
这在很大程度上造成了IRMA在方法学上的特殊性，即几乎全部是夹心法，也就是一个IRMA系统中需要两个抗体，都是针对同一个抗原的，但是抗原决定簇不同，一个抗体标记后作为探测抗体，一个抗体用作分离剂。
正是这一特点，使IRMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇的肽类或蛋白质。
6.由于Ag越小Ag*Ab放射性越低，所以在IRMA中NSB的高低对低剂量Ag测量的准确性影响大，如何降低NSB对灵敏度很重要。
二、试剂盒基本试剂试剂盒的基本要求和RIA试剂盒相同，由国家批准的生产单位提供，使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当改动，但对改变了的方案应作精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
一般试剂盒都包括三种主要试剂：标记抗体、非标记标准抗原 (标准品)、分离试剂或材料，很多试剂盒还提供缓冲液及质量控制用的样品。
7.标记抗体标记抗体必须亲和力高、特异性高。
通常都由生产厂家精选后用125I标记，可以是多克隆(polyclonal)，也可以是单克隆(monoclonal)抗体。
免疫分析法
在得到分泌单克隆抗体的细胞克隆后，通常以两种方 法大量生产单克隆抗体：
其一是接种动物体内生产法；
其二是细胞培养法。
由于组织培养法所能得到的抗体的最大量仅在0.510ug/mL，故实验室中更常用的方法是在动物体内进行繁 殖。体内接种杂交瘤细胞也有两种方式：
实体瘤法：将对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/mL接 种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml，共2～4点。待肿瘤 达到一定大小后（一般10～20天）采血，从血清中获得单 克隆抗体的含量可达到1～10mg/mL，但采血量有限。
抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答 的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。
四、抗体的制备
免疫分析中，常用到的两类抗体为抗血清 （多克隆抗体）和单克隆抗体。 1、抗血清 抗血清，通常指由抗原直接免疫动物后所制成 的多克隆抗体，它是免疫分析中的重要工具。 抗血清也称免疫血清，要获得一种质量好的抗 血清，主要有免疫原的制备、动物免疫、放血、 抗血清分离及抗血清的分析鉴定等步骤。
2、单克隆抗体
（1）基本概念
抗体主要由B淋巴细胞合成。
每个B淋巴细胞含有合成某一种抗体的遗传基因。动物脾 脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B 淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活 各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形 成该细胞的子孙，即形成多克隆，并合成多种抗体。
甾体激素不能直接和载体蛋白形成有效的共 价键，因此需要先制备甾体的衍生物（含游离的 羧基），然后再与载体蛋白连接，制成全抗原。 （1）甾体衍生物的制备 琥珀酸衍生物 肟衍生物 （2）甾体衍生物和蛋白质的结合反应
甾体衍生物的游离羧基，可以经碳化二亚胺 缩合反应而与载体蛋白中的氨基形成肽键。
免疫分析法
并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。
Ⅴ
应用与展望
Ⅰ
酶免疫技术
酶免疫技术（EIA）是目前临床应用最多的一种
Ⅱ
免疫分析技术。主要原理是用酶标记的抗体（或 抗原）用于免疫学反应，并以相应底物被酶分解
的显色反应对样品中的抗原（或抗体）进行定位
Ⅲ
分析和鉴定；亦可根据酶催化底物显色的深浅， 测定样品中待测抗原或抗体的含量。
免疫分析法
主讲人：xx
概
前言
要
免疫分析法简介 Section header Section header Section header 免疫分析法 应用与展望
致谢
前言
前言
免疫学是研究免疫系统的结构与功 Ⅱ Ⅲ
能，了解其再免疫应答反应中对机体有
益的防卫功能和有害的病理损伤的机制， 研究有效的免疫措施，实现以防病，治 病为目的的一门现代医学学科。自六十
Ⅳ
含量。
Ⅴ
免疫分析检测
Ⅰ
免疫学检测历史演进
放射免疫检测（兴起于20世纪70 年代) Ⅱ 酶联免疫检测（兴起于20世纪80 年代，各临床机构普遍使用）；
分析 检测
Ⅳ
以化学发光为代表的光生物学标记及免 疫检测技术（20世纪90年代开始推广使 用，产品步入成长期）三个阶段。
Ⅴ
免疫分析检测
Ⅰ 技术的分类 放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术 匀相免疫测定 非匀相免疫测定
Ⅰ
4、藻红蛋白（R-RE) 最大吸收波长为565nm,最大发射波长为 578nm,可
Ⅱ
与FITC一起共用488nm激发光，常用于双色免疫荧光染
色。
分析 检测
抗原(4)分析解析
2020/3/23
功能性抗原决定基
位于分子表面的表位易被BCR或抗体结合，称功能性 抗原决定基，其中有个别化学基团起关键作用，称免疫 优势基团。位于分子内部的不能与 BCR或抗体结合的表 位，称隐蔽性抗原决定基，它可因理化因素而暴露在分 子表面成为功能性表位，或因蛋白酶解或修饰（如磷酸
2. 异种抗原(xenogenic antigen) 指来自不同种属的抗原。
3．同种异型抗原（allogenic antigen） 指同一种属不同个 体所具有的特异性抗原。①红细胞血型抗原，包括ABO、 Rh等40余个抗原系统；②人类主要组织相容性抗原，即 人白细胞抗原（HLA）（详见后）。
4．自身抗原(autoantigen) 正常情况下，机体免疫系统对 自身正常组织或细胞处于耐受状态。在某些病理情况下 自身抗原成分可诱导机体产生自身免疫应答。
共同特点：多由蛋白质组成，分子量大，表面决定基种
类多，但每一种决定基的数量不多且分布不均匀。
免疫应答特点：①既引起体液免疫，也引起细胞免疫；
②产生抗体以IgG为主，也可产生其他类型抗体；③可产 生免疫记忆。
2020/3/23
2.非胸腺依赖抗原(thymus independent antigen, TI -Ag) TI抗原亦称T细胞非依赖性抗原， 其刺激
完全抗原与抗原比较
特性
完全抗原
半抗原
免疫原性
+
-
反应原性
+
+
2020/3/23
2020/3/23
•
在某些情况下，抗原可诱导机体产生
免疫耐受，其抗原称耐受原；抗原也可引
起变态反应，称变应原（al1ergen）。
常见化学发光免疫分析技术比较
常见化学发光免疫分析技术比较1、化学发光免疫分析化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA），英音:［，kemi，lju：mi’nesəns] ［，imju：nəuə’sei]是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
1.1、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子（hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析) 上，或酶作用于发光底物.1。
2、化学发光免疫分析类型化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:（1)化学发光标记免疫分析法；（2）酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法1。
2.1化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CL IA ）, 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法.常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) ，是有效的发光标记物,其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2）作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。
体内药物分析：免疫分析法
④琥珀酸酐法 该法是利用琥珀酸酐在无水吡 啶中与半抗原分子中的羟基反应，首先生成带 有羧基的半抗原琥珀酸衍生物，然后再与蛋白 质的氨基结合，形成肽键。
⑤重氮化的对氨基苯甲酸法 该法是利用重氮 化的对氨基苯甲酸（重氮化合物）先与带酚羟 基的半抗原反应，生成带有羧基的半抗原，然 后再与蛋白质结合
3. 人工抗原的鉴定
三种试剂的作用分别是： 1. 抗体是作为标记药物和非标记药物竞争结合 的蛋白； 2. 标记药物提供可检测的信号（响应值）； 3. 非标记药物在标准曲线制备时是药物标准品， 在样品中则为被测药物。它用于建立被测药物 量（浓度）与响应值之间的函数关系，是样品 中药物浓度计算的依据。
Ag Ab K1 Ag Ab
从图中可见，抗血清A的滴度及它和标记抗 原的亲和力较小，质量最差；B的滴度虽高， 但亲和力不够高；C质量最佳，选其结合率 50%稀释度，建立放射免疫分析方法最适宜。
（2）活度（Avidity）
活度是指抗体与相应抗原的亲和力 （Affinity)。它可反映出抗原与抗体结合的牢 固程度。活度高，表明形成抗原-抗体结合物的 速度快而解离小。抗体活度高低与免疫分析方 法的灵敏度密切相关，它主要表现在剂量反应 曲线的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，测 定效果越好。
4. 标准抗原（Standard antigen）
标准抗原是指在免疫测定中用来 制作标准曲线或制备标记抗原用的药 物标准品。标准抗原是免疫分析法的 定量依据。
（二）特异抗体的制备及鉴定
1. 特异抗体（Specific Antibody）
特异抗体是指抗原（免疫原）作用于机体 产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特 异性结合的免疫球蛋白。抗体具有高度的特异 性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。在 免疫球蛋白中，免疫球蛋白G（IgG）含量最高 （约占70％），是免疫分析中最常用的抗体。
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为 突 出 ，如 ２ ０ ０ ３ 年 广 西 的 猪 氯 霉素 残 留事 件 、２ ０ ０ ６年 上 海 的 多 宝 鱼 事 件 、２ ０ ０ ８年 河北 的红 心 鸭 蛋事 件 、２ ０ １ １年 河 南 的 双
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2.交叉反应(Cross-reaction)： 由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似 决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。 检测意义：假阳性（避免） 多残留检测（利用）
8
9
半抗原免疫分析ABC
1
内容
• 一、基本概念
– 抗原 – 抗体
• 二、免疫分析方法
– 分类 – ELISA原理与方法 – 方法建立-苏丹红为例
2
抗原 antigen,Ag
3
(一)抗原的概念
抗原(Antigen,Ag) 是一类能刺激机体免疫系统 产生特异性免疫应答,并能与相应的免疫应答产 物在体内或体外发生特异性结合的物质.
4
(二)完全抗原与半抗原
1.完全抗原（complex antigen): 既具免疫原性又有免疫反应性的物质. 如:大多数蛋白质.
2.半抗原(hapten): 仅有免疫反应性而无免疫原性的物质. 如:大多数多糖、类脂、某些药物. 半抗原+载体(蛋白质) 完全抗原
5
6
共同抗原与交叉反应
共同抗原与交叉反应
存在形式： 膜型（membrane immunoglobulin, mIg）
— B细胞膜上的抗原受体； 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg)
— 分泌进入体液, 介导体液免疫应答。
二、免疫球蛋白的分子结构
（一）免疫球蛋白的基本结构：
由四条多肽链组成，呈“Y”或“T”型 1.组成： • 2条长链，又称重链（Heavy chain，H链）：
(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)
在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在
反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之
后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者
的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后，
才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme
荧光素
FITC、RB200、TRITC
免疫分析测定
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶 免疫组化
HRP、AP
免疫分析测定
化学发光物 Luminol、lucigenin 测定
金属颗粒
胶体金、铁蛋白
免疫组化 免疫分析测定
免疫分析 免疫组化
一、标记免疫方法分类
1．按标记物的种类分
Step 6: validation
一个难点：基质效应
基质效应
• 基质：样品中除了目标分析物外还含有其他的物质，这些物质可能会对检测 结果造成干扰，这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应(matrix effect)
• （1）基质来源 – 水、土壤的腐殖质 – 食品中的蛋白、脂肪等 – 溶液中作为促溶的有机溶剂等
FV fragment) 单域抗体（single chain Ab)
抗体的结构与功能的关系，
所展现出的生物学功能是其结构的 完美表演者。
免疫分析技术
内容
• 分析方法分类 • 几种常用免疫分析技术
– ELISA – 侧流免疫层析
• 分析方法的建立 • 分析数据的拟合
常用的免疫标记物质
类别 用途
标记物
linked immunosorbent immunoassay)
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25
ELISA简介
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（一） ELISA技术的原理
间接法 夹心法 竞争法
夹心法 Sandwich
竞争法
（二） ELISA所用试剂材料
• 1、固相 • 2、酶 • 3、底物 • 4、缓冲液 • 5、仪器
1、固定相
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33
3、最常用的底物
• 邻苯二酚(OPC) • 四甲基联苯胺(TMB)
4、缓冲液
• PBS(T) • Tris-HCl
• Na3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂
4、仪器 酶标仪
酶标仪
（三） 免疫分析方法建立 ——苏丹红为例
Step 1: Hapten and conjugate
聚次亚乙烯
2、最常用的标记酶
1．辣根过氧化物酶(HRP):约有50％的EIA使用此酶。 2．碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定，其 活性可用分光光度计或荧光计测量。 3．6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA。 4．β-半乳糖苷酶(β-Gal): 适用于均相EIA和非均相 EIA。 5．苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA。
。。。。。
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2．按是否加入分离剂分
(1)均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay)
在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液 中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或 信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进 行测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT) 。
含450-550aa，分子量为55-75KD。
• 2条短链，又称轻链（Light chain，L链）： 含214aa，分子量为25KD。
• 2.分类、分型：
（1）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将Ig 分为五类：
IgM (µ) 、IgG(γ)、IgA(α)、 IgD(δ)、 IgE(ε) • 亚类：IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
(1)放射免疫分析
(radioimmunoassay，RIA)
(2)酶免疫分析
(enzyme immunoassay，EIA)
(3)化学发光酶免疫分析
(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)
(4)荧光免疫分析法
(fluorescence immunoassay，FIA)
IgA：IgA1, IgA2 IgM: IgM1, IgM2
（2）分两型： 根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻 链分为两型：κ和λ型
• 每一Ig单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须 • 同型。
抗体的制备方法
• 3.基因工程抗体(GeAb):
第三代抗体
由基因重组技术制备的抗体,称为基因工程 抗体。 • 嵌合抗体 (chimeric Ab) • 人源抗体（humanized Ab) • 双特异性抗体（bispecific Ab) • Fab/ScFV（single chain
Step 2: characterization of conjugate
Step 3: chessboard tiatrion and calibration curve
Step 4: optimization— nonessential
例1、标记抗原浓度对检测的影响
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例，pH影响
Step 5: sample analysis
农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防腐剂、植物激素等半抗原
在食品安全、植物学、环境检 测等领域，主要是半抗原类物质。
10
抗体
antibody,Ab
抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁； 两者既是好朋友，又是一对冤家。
一、基本概念
1. 抗体（Antibody，Ab）
指B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分 化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异 性结合的免疫球蛋白。
例1：环境水样的基质效应
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（2）基质干扰的消除
• 掩蔽剂（缓冲液调整） • 样品稀释 • 样品前处理：净化
50
感谢下 载
感谢下 载