离子交换层析
离子交换层析
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
样品洗脱
恒定洗脱
离子交换层析的基本操作
分子浓度 离子强度
pH值
阶段洗脱
梯度洗脱
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂：
最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物
离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为 流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混 合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
10 20 30 40 50 60 70 80 90
离子交换层析的原理
离子交换层析的原理离子交换层析是一种常用的分离和富集技术，它利用离子交换树脂对离子进行选择性吸附和解吸，从而实现对离子的分离和富集。
其原理主要包括树脂的选择性吸附、离子交换和洗脱三个步骤。
下面将详细介绍离子交换层析的原理及其应用。
首先，树脂的选择性吸附。
离子交换树脂是一种聚合物材料，具有大量的离子交换基团，能够与溶液中的离子发生化学反应，形成离子交换平衡。
当溶液中的离子与树脂表面的离子交换基团发生反应后，被选择性吸附在树脂表面上，而其他离子则通过树脂层析柱，不被吸附。
这样就实现了对离子的选择性吸附。
其次，离子交换。
在选择性吸附的基础上，溶液中的离子与树脂上的离子发生交换反应，使得被吸附的离子逐渐被替换出来。
这个过程是可逆的，当树脂上的离子被替换出来后，树脂又可以重新吸附其他离子。
这样就实现了对离子的分离。
最后，洗脱。
经过离子交换后，树脂上被吸附的离子需要被洗脱下来。
通常采用盐溶液或酸碱溶液进行洗脱，将被吸附的离子从树脂上彻底洗脱出来。
洗脱后的溶液中含有高浓度的目标离子，可以用于后续的分析或提纯。
离子交换层析技术在环境监测、食品安全、生物医药等领域有着广泛的应用。
例如，可以用于水质监测中对重金属离子的富集和分离，也可以用于生物样品中对蛋白质、核酸等生物大分子的富集和提纯。
由于其选择性强、操作简便、效果显著等特点，已成为分离和富集领域中不可或缺的重要技术手段。
总之，离子交换层析技术是一种重要的分离和富集技术，其原理简单清晰，应用广泛。
通过选择性吸附、离子交换和洗脱三个步骤，可以实现对离子的分离和富集，为后续的分析和提纯提供了重要的支持。
希望本文的介绍能够帮助大家更好地理解离子交换层析的原理及其应用。
离子交换层析配基、基架、填料
离子交换层析配基、基架、填料
离子交换层析是一种常见的分离和纯化方法，广泛应用于生物、化学、环境等领域。
离子交换层析的基本原理是利用离子交换材料与待分离物质之间的化学亲和性差异，通过物质在离子交换材料中的分配来实现分离纯化。
离子交换层析的关键组成部分包括配基、基架和填料。
配基是指离子交换材料上的活性基团，其化学性质决定了材料的亲和性。
常见的配基包括阴离子交换基、阳离子交换基、强酸交换基和弱酸交换基等。
基架是指离子交换材料的骨架结构，常用的基架材料包括聚苯乙烯、聚乙烯、硅胶等。
填料是指用于填充离子交换柱的材料，常见的填料材料包括硅胶、聚合物、玻璃等。
离子交换层析的选择和优化要考虑到多个因素，如待分离物质的性质、离子交换材料的性能、离子交换柱的尺寸、流速等。
通过合理选择配基、基架和填料，并调整操作条件，可以实现高效、经济的分离纯化过程。
总之，离子交换层析是一种重要的分离纯化技术，配基、基架和填料是其关键组成部分。
选择合适的离子交换材料和填料，并合理调整操作条件，可以实现高效、经济的分离纯化过程。
- 1 -。
离子交换层析名词解释
离子交换层析名词解释
离子交换层析（Ion exchange chromatography，简称IEC）是一种分析和分离离子的技术方法。
在离子交换层析中，样品溶液被注入到一个含有离子交换树脂的柱子中，离子交换树脂具有特定的离子交换基团，可以选择性地吸附和释放样品溶液中的离子。
离子交换层析的分离原理基于离子交换树脂对溶液中的离子的亲和力不同。
当样品溶液通过柱子时，带有相同电荷的离子与离子交换树脂产生吸附作用，而带有相反电荷的离子则可以自由通过。
通过调节溶液的pH值、离子浓度和离子交换树脂的性质，可以实现对不同离子的选择性分离。
离子交换层析常用于分离和纯化蛋白质、核酸和多肽等生物大分子，并且在药物研发、环境分析和生命科学研究中得到广泛应用。
生化技术第六章 离子交换层析
3.不同离子型交换剂的选择 原则：选择结合力较小的反离子，有利于提高交 换容量。 强阳性——选H型；强阴性——选OH型； 弱酸性——选Na型；弱碱性——选Cl型。 4.不同基质离子交换剂的选择 疏水性的树脂交联度大，空隙小，大分子很难进 入，且骨架的疏水性不利于蛋白质的稳定。分离 大分子物质时一般用亲水性的基质。
疏水性离子交换剂
疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合
力较小的树脂。常用的树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的
聚合物，其中二乙烯苯是交联剂，能把聚乙烯苯直链化合
物连接成类似海绵状的结构，在此结构中以共价键引入不
同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有：
阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱
三、分离原理 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主
要以离子交换方式进行。
假设以R-A+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+
能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式
为：R-A++B+
R-B++A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力， 这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。
+
+
+
+
+
+
+
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析
Ixv_2 JB 980910
16
Troubleshooting
Ixv_2 JB 980910
17
Screening for the optimal ion exchanger
Sample:
Columns:
Start buffer: Elution buffer: Flow rate: Running parameters:
5
Lane 1: Lane 2: LMW markers Lane 3: Starting material Lane 4: Flow through Lane 5: 1st peak
(containing α-amylase) Lane 6: 2nd peak Lane 7: LMW markers
20
Monodisperse media
MiniBeads™ 3 µm micro-purification MonoBeads™ 10 µm polishing SOURCE™ 15 15 µm polishing SOURCE™ 30 30 µm intermediate steps
Ixv_2 JB 980910
EDTA absorbs at 254 nm
RNA/DNA
%B
100
RNA
DNA
50
0
0
2
4
6
8
Time (min)
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27
Elution schemes
• Isocratic • Step gradient • Linear gradient • Adapted
– Not usual（浓缩） – Excellent for capture steps – Standard method – Saves time and improves results
生物分离工程-离子交换层析
可利用普通的凝胶过滤介质偶联特殊的离子交换基制 备．如Pharmacia公司生产的PBEll8和94即为以Sepharose 6B 为载体的阴离子交换剂，前者与Pharmalyte 匹配使用，后 者与Polybuffer96和Polybuffer 74匹配使用。
Pharmacia生产的另一种多缓冲离子交换剂为Mono P，其离于交换基为具有不同pKa值的弱碱性胺基．Mono P可与上述三种多缓冲剂匹配使用，粒径仅10m，用作 高效层析聚焦柱的固定相。
应用：
由于HAP晶体表面结构特别，吸附机理特殊，因此 可用于识别DNA及RNA的单链和双链，分离IEC和HIC难 于分离的蛋白质物系。例如，人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor,hTNF)中构成蛋白质分子的差异很 小, 利用IEC法、高效RPC法和电泳法只能得到一个洗脱 峰或电泳带，而利用HAP层析可分离得到4个洗脱峰。
再见
层析聚焦的应用
层析聚焦需使用特殊的固定相和流动相，难于应用 在大规模分离纯化过程，主要用于生化实验规模的样品 制备或成分分析．但作为一种蛋白质分离纯化手段，层 析聚焦的纯化效率极高，峰宽可小到0.02 – 0.05pH单位， 可分离等电点差仅0. 02的蛋白质。
平衡液：25mmol／ml乙醇胺—10％甘油(pH9.4) 洗脱液：用10% Polybuffer96(pH6.O)
(2)破坏水化作用的物质
SCN, ClO4 ,和 I 等离子半径较大、电荷密度低的阴
离子可减弱水分子之间相互作用。这类阴离子与上述盐 析作用强的高价阴离子(如 SO42 ，HPO42 等)的作用正好 相(antichaotropic ion)。在离液离子存在下 疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。
离子交换层析
以Sepharose CL－6B 为载体，引入电荷基团制成的。
二、性质
（一）颜色与形状 树脂类离子交换剂颜色很多，褐色、黄色、乳白
色等；亲水性的离子交换剂基本都是白色的。 （二）交联度：交联剂在载体中所占的百分数。
树脂交联剂为二乙烯苯，交联葡聚糖和纤维素 的交联剂为3-氯代-1，2-环氧丙烷，琼脂糖交 联剂2，3-二溴丙醇
亲水性离子交换剂的载体是一类天然的或人 工合成的、与水结合力较大的物质。
常用的有纤维素(Cellulose) 、交联纤维素 (Sephacel) 、交联葡聚糖(Sephadex) 、交联琼 脂糖(Sepharose) 。
引入电荷基团
1、纤维素离子交换剂
交换剂
名称-纤维素
阴离子 交换剂
二乙基氨基乙基 氨乙基
R-N(CH3)3-Cl＋OH –
弱碱性： R-NHCH3 OH ＋Cl – R-N(CH3)2-Cl＋OH –
1
2
3
4
5
起始缓冲 液中的反 离子
1. 平衡阶段: 离子交换剂与反离子结合
2. 吸附阶段：样品与反离子进行交换
样品液中的 离子
洗脱液中的 离子
3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ吸附物质，后洗下强 吸附物质
实用的离子交换剂应满足下列要求
有高度的不溶性 有疏松的多孔结构和巨大的比表面积 有较多的交换基团 有稳定的物理化学性质
一、分类
根据载体的组成和性质分为：
（一）疏水性离子交换剂 （二）亲水性离子交换剂
（一）疏水性离子交换剂 载体是一种人工合成的、与水结合力小 的树脂物质。苯乙烯和二乙烯苯的聚合 物，海绵状结构。
3、琼脂糖离子交换剂
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析法
离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
⒈离子交换剂预处理和装柱：对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。
为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。
离子交换层析
液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分 离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子 交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交 换剂的结合有较大的差别。
一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。尽量使
杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下可以 使杂质与离子交换剂牢固地结合，而样品与离子交换剂结合 不稳定，也可以达到分离的目的。
离子交换层析的基本操作
（1） 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，
离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和 柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装 柱时要均匀平整，不能有气泡。
装柱用于平衡离子交换柱的缓冲
■ 胶体的组成与外型：
Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24
Cellulose Sephcel Monobead
Pharmacia (1980) Separation News: 5
离子交换剂的选择、处理和保存
Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0
mg / mL gel
Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64
影响交换容量的因素很多，主要可分为两个方面。
换剂上的样品组份洗脱下来。
柱效
通过柱子分离得到窄而对称的洗脱峰的能力（分辨率）
装柱的质量
树脂颗粒的大小
正确的洗脱条件
离子交换层析
离子交换层析在各方面的应用离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。
【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。
【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。
近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。
1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。
作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。
存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。
在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。
05第五章__离子交换层析
5．稳定性
• 离子交换剂都具有理化稳定性。 • 特别是树脂类离子交换剂，在浓度较高的酸或碱溶液 中进行短期处理后，其性质仍无改变。 • 而亲水性离子交换剂的理化稳定性，一般与其基质的 稳定性相近，即在水、盐、碱、弱酸和有机溶剂等溶 液中是稳定的。 • 而且经交联引进离子基团之后，稳定性还会有所提高。
(2)阴离子交换剂
• 阴离子交换剂是在树脂中分别引入 季胺[-N(CH3) 3]、叔胺[-N(CH3) 2]、 仲胺[-NHCH3]、伯胺[-NH2]基团后构成的。 • 当引入季胺和叔胺基团时，分别为强阴性和中强阴性 离子交换剂， • 当引入仲胺和伯胺基团时，为弱阴性离子交换剂。
• 它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：
根据电荷基团的强弱，又可将阳离子交换剂分为三种： • 强酸型 带磺酸基团的树脂，可简写为 R-SO3H，R代表树脂 • 中强酸型 带磷酸基团和亚磷酸基团的树脂，前者可简写为RPO3H2，后者可简写为 R-POH2 • 弱酸型 带羧基的和酚基的树脂，前者可简写为R-COOH，后 者可简写为R-苯环-OH
• 离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水 化作用形成的)的结合力是： • 与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成 反比。 • 所以，离子价数越高，结合力越大。 • 在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合
离子半径越小，结合力亦越大。
• 因此在稀溶液中离子发生水化时，各种阴离子和阳离 子结合力大小的排列次序如下： • 一价离子：Li+<Na+<K+<Rb+<Cs+ (对阳离子交换剂)
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8.1 概述 8.2 层析的基本原理与基本概念 8.3 层析分离方法介绍 凝胶过滤，离子交换，疏水，羟基磷灰石， 共价，反相及亲和层析等。
8.1 概 述
㈠ 层 析 的 概 念
层析是根据混合物中，溶质在互不相溶的 两相之间分配行为的差别，引起移动速度 的不同而进行分离的方法
又称色谱法，层离法，层析法;
层 析分 类
4.流动相的流动方向 轴向流层析； 径向流层析：溶质 在半径方向上得到 分离，优点是规模 放大时，半径不变 ，通过增加柱高提 高处理能力，且压 降不会增加，适于 大规模；但造价高 。
层 析分 类
5.分离操作方式
洗脱展开 (elution development) 迎头分析 (front analysis) 顶替展开 (Elution chromatography)
层 析分 类
5.分离操作方式 ：洗脱展开 降样品尽量浓缩，引入色谱柱上部，用溶剂洗脱 （溶剂与固定相无亲和力），依亲和力的大小 而速度不同，前进靠溶剂的推动。
层 析分 类
5.分离操作方式 ：洗脱展开 恒定洗脱法：不改变洗脱剂组成，优点是操作简单，不 需要较复杂的设备；但洗脱剂组成需实验确定，太弱 的洗脱剂不能有效洗脱，太强的洗脱剂，分辨率较差 。 逐次洗脱法：洗脱剂组成至少改变一次，优点是操作简 单，重现性好，但洗脱条件一次改变后，有些组分会 共同洗下，影响分离效果。 梯度洗脱：逐次改变洗脱剂的组成，优点是消除重叠峰 现象，但洗脱体积过大，组分浓度变稀。
层 析分 类
2. 固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层
析法又分纸层析法、薄层层析法和柱层析法
纸层析和薄层层析多用于分析目的，而柱层 析易于放大，适用于大量制备分离，是主要 的层析分离手段。
层 析分 类
3. 压力
在以固体为固定相的液相柱层析中，根据操 作压力的不同，分为低压(压力一般小于 0.5MPa)、中压(压力为0.5～4.OMPa)和高 压(压力为 4.0～40MPa)液相层析法； 高压液相层析法中层析介质(固定相)微细，分 离精度高、速度快，主要用于成分分析。大 量制备分离常用低压或中压液相层析法。
DNA重组技术的发展，制备色谱研究成为热
8.1 概 述
㈡ 层 析 的 发 展 历 程
英国生物学家Martin和Synge(1952诺贝尔化学 奖
他们首先提出了色谱塔板理论。以理论塔板来表 示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。 其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了 液－液分配色谱。 特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相 可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用 力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细 的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得 到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这
8.1 概 述
色谱分离的规模：
色谱分析：<10mg 半制备：10～50mg 制备：0.1～10g
工业生产：>20g/d
㈣ 生 物 工 业 中 的 色 谱 分 离
分析色谱与制备及工业色谱的比较： 应用色谱技术范围不同：分析（柱，纸和 薄板）；制备（柱）
操作上不同：分析（进样量越小越好，检 测灵敏度越高越佳；制备（进样量越大越 好，色谱柱适当大）
8.1 概 述
㈢ 层 析 的 特 点
分离效率高：每米柱可达几千至几十万的塔
板数，适于极复杂混合物的分离。
应用范围广
选择性强：通过操作方法，洗脱方式和操作
条件来实现。
高灵敏度的在线检测：紫外、荧光、折光等 快速分离：高效层析剂和高压液相色谱 过程的自动化操作
㈣ 生 物 工 业 中 的 色 谱 分 离
色谱分离理论不同：
理论塔板数的不同；分配系数不同；样品 保留值与峰高的不同
8.2 原理与基本概念
原理：
层析是根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之 间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行 分离的方法；
互不混溶的两相分别称为固定相和流动相；
料液中的溶质在固定相和流动相之间发生扩散传 质，产生分配平衡，分配系数大的溶质随流动相 移动的速度小。
可用于生产规模，也可作为分析检测，控 制产品的质量。
8.1 概 述
㈡ 层 析 的 发 展 历 程
1903年，俄国植物学家Tswett提出色层分离 法的概念 1931年，Kuhn和Lederr在氧化铝和碳酸钙 柱体上，以制备规模分离胡罗卜素和叶黄素。
1938年，适用范围扩展到无色物质。 1940～1943年间，Tswett提出了前流分析 和置换分析法。 50年代，气相色谱Martin和Synge，60年代 ，液相色谱
层 析分 类
5.分离操作方式：迎头分析
又称前流，前沿分析法，将待分离的混合物不 断输入柱中，让它一直流下去，直到过程结 束。亲和力小的先流出，一般不能达到组分 的分离，只有作用力最弱的组分为纯品。适 于除痕量杂质，组分浓度不会被稀释。 C A B
A+B
层 析分 类
5.分离操作方式 :顶替展开 又称置换，排代展开，利用一种与固定相作用力极 强的置换剂作流动相，去替代结合在固定相表面 的溶质分子。优点是浓缩，单位柱长固定相的利 用率最高。但各组分一个连一个的流出，界线不 明，分离不理想；合适的置换剂不易找到。 D D：置换剂
A
B
层 析分 类
6.分配机理 凝胶过滤层析、离子交换层析、反相层析； 疏水性相互作用层析和亲和层析等。
基本概念
1.分配系数：kd＝q/c
2.阻滞因数Rf ：溶质的迁移速率与一理想标准物质
（既不吸附也不溶解）的移动速率之比，移动长 度一样时：
tm tm Rf t R tm ts
tm， ts ：理想物质和溶质的消耗时间 tR ：保留时间
层 析分 类
流动相与固定相 固定相的形状 压力 流动相的流动方向 分离操作方式 分配机理
层 析分 类
1. 流动相与固定相
根据流动相的相状态分气相层析法、液相层 析法和超临界流体层析法 ； 固定相为液体的分配层析法、固定相为固体 的吸附层析法以及固定相为固定于固体表面 的液体薄层(以固体为载体)的分配层法等 。