万寿菊花萃取物中叶黄素的分离与纯化

万寿菊花萃取物中叶黄素的分离与纯化（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：李高峰聂永亮王佩维
【摘要】目的从万寿菊花萃取物的皂化产物中分离、纯化制备高纯度叶黄素。

方法万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取得到万寿菊花萃取物，加碱皂化的产物用水稀释后，用二氯甲烷从中萃取叶黄素，在分出的水相中加入氯化钙，分离出被分散在水相的叶黄素，蒸馏溶剂后用醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂洗涤，再用无水乙醇洗涤，制得高纯度叶黄素。

结果实验确定了加水量为皂化产物的4倍；二氯甲烷用量为水与皂化产物的和；醋酸乙酯与石油醚的体积比为1∶4，用量为分离产物的3倍。

结论此法制得的叶黄素纯度高，色泽纯正，工艺简单。

【关键词】万寿菊；叶黄素；分离；纯化
叶黄素是天然抗氧化剂，具有良好的抵御游离基在人体内造成的细胞与器官损伤的能力［1］,可用于防治由于机体衰老引发的冠心病、心血管硬化［2］和肿瘤等疾病。

另外，叶黄素是眼中含有的仅有的两种类胡萝卜素之一，预防和治疗老年性眼球视网膜黄斑区病变
［3］、白内障等眼部疾病是叶黄素的独特功能。

不仅如此，叶黄素着色能力强，又富有营养，是优良的食品着色剂和动物饲料添加剂［4］,因此，叶黄素被广泛应用于医药、保健品、化妆品、食品、动物饲料、水产、烟草等行业［1］。

万寿菊中的反式叶黄素酯的含量很高，而其他类胡萝卜素的含量较少，是非常好的叶黄素来源。

本研究从叶黄素浸膏皂化产物中萃取分离、纯化制备高纯度叶黄素的工艺条件，以期为规模制备高纯度叶黄素提供参考。

1 材料与仪器
万寿菊干花颗粒由大同市天然色素有限公司提供；叶黄素标准样品，由万寿菊干花经超临界CO2萃取制备出浸膏，经皂化、分离和纯化处理制得,经天然产物标准样品国家核心实验室（北京）分析鉴定含量为97.29%。

HA121-50-01-C超临界萃取装置（采用一萃二分流程）由江苏南通华安超临界萃取有限公司制造；LC5500型高效液相色谱仪由北京东西电子技术研究所制造；ME211 型超声波清洗器，美国Metter Electronics 公司生产; Millipore 膜过滤器及真空泵, 美国Waters 公司生产；DF-20型流水式中药粉碎机，由无锡中银机械制造有限公司制造。

CO2，由太原天计应用化工有限公司生产，食品级，纯度在99%以上；万寿菊萃取物由万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取制得；皂化、分离与纯化所用试剂均为分析纯，由天津精细化工
开发中心生产；HPLC分析用试剂为分析纯，由北京化工厂生产；水为二次蒸馏水。

2 方法
2.1 万寿菊萃取物的制备及皂化
万寿菊干花颗粒经超临界CO2萃取，得到的萃取物在KOH的醇溶液中皂化反应后，将溶剂蒸馏得到皂化产物。

2.2 游离叶黄素的分离
将皂化产物加水稀释后，用二氯甲烷萃取，分出水层，水洗二氯甲烷层至水相无色透明，且为中性。

收集萃取与水洗过程中分出的水相，在其中加入足量氯化钙，至水相无色透明，过滤沉淀，用二氯甲烷洗涤沉淀，收集洗液，并用水洗至水相无色透明且为中性。

将洗液与萃取所得的二氯甲烷相合并，蒸馏溶剂得到叶黄素粗品。

2.3 游离叶黄素的纯化
叶黄素粗品中加入醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂洗涤，过滤除去杂质，得到叶黄素结晶体；再用无水乙醇洗涤，得到叶黄素的重结晶体。

2.4 叶黄素的高效液相色谱分析
称取叶黄素样品20.0 mg，用流动相配成8×10-6 g·ml -1的溶液。

色谱条件: 色谱柱为Diamonsil C18柱; 甲醇∶乙腈∶醋酸乙酯∶水（V∶V∶V∶V）= 30∶29∶40∶1 为流动相; 流速0.75 ml·min-1; 检测波长450 nm; 柱温25 ℃; 进样量20 μl。

色谱图见图1。

3 结果
3.1 分离过程
3.1.1 皂化产物稀释过程中的加水量
加水稀释皂化产物,可以去除其中水溶性杂质,水的用量过大，会使油水界面上的脂肪酸皂浓度增大，容易形成较厚的中间层，要想得到较好的分离效果，必须加大二氯甲烷的用量；而水的用量过小，则会使体系的黏度过大，不利于分离。

经实验确定：水的用量为皂化产物脱出溶剂后浓缩物量的4倍。

3.1.2 萃取分离中二氯甲烷的用量
皂化生成的脂肪酸皂能使部分二氯甲烷和叶黄素单体分散于水相中，所以二氯甲烷与水的体积比至关重要，太大则造成溶剂浪费，太小则不利于叶黄素单体分离。

经实验确定二氯甲烷用量为水与皂化产物脱出溶剂后浓缩物量的和。

3.1.3 水洗二氯甲烷层中水的用量
水洗二氯甲烷层要确保滤液呈中性，且无色透明。

3.1.4 回收水相中分散的叶黄素
由于皂化生成产物中的脂肪酸皂具有表面活性,使部分叶黄素分散于水相中难以分出,加入氯化钙，形成脂肪酸钙皂悬浮于水的表面，使得叶黄素释放出来，氯化钙加量应使得水相无色透明，过滤悬浮物，二氯甲烷洗涤滤饼，滤液为二氯甲烷的叶黄素溶液。

3.2 纯化过程
3.2.1 叶黄素结晶中溶剂的选择
在结晶纯化过程中要求溶剂对杂质和叶黄素的溶解具有很好的
选择性,且毒性要小,安全性好。

实验确定了醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂，在一定配比和用量下，能够除去与叶黄素结构相似、难以去除的杂质，如隐黄素等。

3.2.2 混合溶剂的用量
比15 g万寿菊萃取物经皂化、分离所得的叶黄素粗品用不同配比的醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂60 ml洗涤，所得叶黄素晶体经无水乙醇洗涤、40 ℃真空干燥得到叶黄素单体。

所得结果如图2（a）。

取样品20.0 mg，用流动相配成8×10-6 g·ml-1的溶液，在上述色谱条件下测定叶黄素含量。

所得结果如图2（b）。

从图中看出，当醋酸乙酯与石油醚体积比为1∶4时，叶黄素的得量与含量均最高。

3.2.3 混合溶剂用量
15 g万寿菊萃取物经皂化、分离所得的叶黄素粗品用体积比为1∶4的醋酸乙酯与石油醚的混合溶剂分别用不同用量洗涤，所得叶黄素晶体经无水乙醇洗涤、40 ℃真空干燥得到叶黄素单体。

所得结果如图3（a）。

取样品20.0 mg，用流动相配成8×10-6 g·ml -1的溶液，在上述色谱条件下测定叶黄素含量。

所得结果如图3（b）。

从图3中看出，叶黄素晶体的得量随着混合溶剂的用量的增加而减少，这主要是由于醋酸乙酯对叶黄素的溶解度较大，使得部分叶黄素溶入混合溶剂,当混合溶剂用量为粗品的3倍（ml/g）时叶黄素含量最高,说明此时混合溶剂溶剂杂质效果最好。

3.2.4 叶黄素重结晶
用混合溶剂结晶出的叶黄素晶体含有少量极性较强的杂质，用
无水乙醇洗涤晶体可以驱除此类杂质，无水乙醇洗涤至滤液无色透明为止。

叶黄素在无水乙醇中重结晶后，色泽纯正，纯度可达90%以上。

3.3 真空干燥
在40 ℃下真空干燥6 h，得到高纯度叶黄素晶体。

4 结论
用二氯甲烷从万寿菊花萃取物的皂化产物中萃取分离叶黄素单体，脂肪酸钾皂使部分叶黄素单体增溶于水相中，很难完全分离，加入氯化钙形成脂肪酸钙皂，释放出叶黄素单体，然后用二氯甲烷溶解这部分叶黄素，可以完全分离叶黄素单体，提高其收率。

选用醋酸乙酯与石油醚、无水乙醇纯化叶黄素，此法工艺简单，产品纯度高，色泽纯正，有较高的工业生产应用价值。

【参考文献】
［1］Alexandra,AR.AndrewS.The science behind lutein ［J］.Toxicology Letters，2004，150:57.
［2］张慧，李涛，徐公世.一种前景广阔的天然食品着色剂—叶黄素［J］.中国食品添加剂，2004，5:45.
［3］Whitehead, A. J.; Mares, J. A.; Danis, R. P. Macular pigment: a review of current knowledge［J］.Arch. Ophthalmol. 2006, 124：1038.
［4］孟祥和，毛忠贵，潘秋月.叶黄素的保健功能［J］.中国食品添加剂，2003，1:17.。