常用基因检测方法原理与局限
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结构改变 单亲二倍体（UPD）
标本培养
核型分析 √
>=3M √ × √
CMA √
>=100k × √ ×
NGS √* ×** × × ×
* ：仅限于全基因组测序能做到核基因组全局分析，若只是全外显子组或者 Gene Panel则不行。
**：不能保证检出，若检出则需经过其他实验（例如MLPA）验证 。
.
保证中彩票头 奖的方法：
• 线粒体遗传病：呈母系遗传 （复习：母系遗传=患病
女性所有子女都患病？）
.
没有一种药包治百病，如果有，那就是 毒药
没有哪一种检测方法能够搞定所有 的事情，如果有，那就是忽悠
.
复习
• 遗传病的基因检测，本质上就是以参考基因为基准，对样本基因进行校对
.
.
一代测序/Sanger测序
• 经典的直接测序方法，基因突变检测 的“金标准” • 检测范围：
• 片段分析的应用范围广泛
.
片段分析（Fragment Analysis，FA）
• 可用于单亲二倍体/LOH的检测
• 以下为全染色体组UPD的CMA结 果
• 一对染色体分别来自父母。当缺失
了其中一方来源的染色体（LOH），
或者是某一对染色体同时来自父或
母亲的一方（单亲二倍体，UPD）
• UPD可以发生在局部，也可发生于 整个染色体组
12
34
56
78
13
正常
17
.
57
12
34
56
78
13
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同源
11
.
12
34
56
78
13
57
异源
13
.
.
PWS/AS：CMA or FA？？？
CMA
FA
核基因组全局分析
√
×
仅检测患者，区分PWS/AS
×
√
仅检测患者，区分LOH/UPD
√
×
对于首选片段分析（FA）方法的PWS/AS患者， 先做3370项目（协助确诊）。 若结果为阳性，可以再做3381（协助判断预后） 注意：若患者为异源性UPD，则CMA无法检出， 但片段分析项目可以…… .
•
对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠产物的遗传学检测 书撕成一页一页的再拿去
• 可以检测出同源性单亲二倍体（UPD）
校对，就不能检查出页码 装订错误了
• 局限性
• 无法检出染色体倒位,易位,互换等结构变异
相当于升级版的核型分析，能查到比普通核型分析
更加细小的拷贝数改变以及单亲二倍体。
但是结构改变不行 .
“下一代”测序技术 Next-generation sequencing , NGS
• 优势：能同时对无数条DNA分子进行序列测定，效率极高 • 技术特点：每次测很短的片段（读长较短），但是可以通过超大量的平行测序，获得 大量的序列。
.
（某个位点的）深度：这个位点 被测的次数 read(s)：测序直接得出的短序列
.
技术原理
.
扩增产物毛细管 电泳结果
MLPA探针结构
.
.
片段分析（Fragment Analysis，FA）
• 借助毛细管电泳，检测待测物（通常为PCR扩增产物）中是否有特定长度 （范围）DNA片段出现
• 无法检测出序列内部的碱基改变
• 例如“SRY基因片段分析”项目：提取样本总DNA后，用SRY基因特异引物进行PCR 扩增，并将扩增产物进行毛细管电泳，观察是否有目标长度的扩增产物
猜中“有奖” 猜不中“白折 腾”
.
染色体显带技术，Chromosome
banding G显带染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断的“金标准”
•应用范围 • 使染色体大小和形态一目了然,特别是发生在染色体上的遗传疾病，如染色体倒位、易 位、互换和短缺，都可以及时发现,有利于临床诊断
•局限性 • 细胞培养耗时长、分辨率低以及耗费人力 • 对线粒体病无能为力
• 如果发生在染色体“印迹区”，则 可导致疾病发生
.
• 对样本目标序列进行甲基化特异性 PCR后，印迹（DNA甲基化状态） 不同的序列会发生碱基的改变，并 扩增得到长短不一的片段
• 借助毛细管电泳，检测待测物 （通常为PCR扩增产物）中是 否有特定长度DNA片段出现
.
.
低通量检测：“有的放矢”
报告单出现类似右边的图像→_→ 就是核型报告 有该项目疑问请咨询 @陈帆 @吴梦华
47，XX，+21
.
染色体微阵列分析
Chromosome microarray analysis, CMA
• 应用范围
• 儿童复杂、罕见遗传病，如：智力障碍、生长发育迟缓、多发畸形、孤独症样临床表现，排 除染色体病、代谢病和脆性X综合征之后的全基因组CNV检测 （包括智力低下、发育迟缓、 多种体征畸形以及自闭症中，CMA比传统G显带核型分析技术的检出率提高了10％）
常用基因检测方法原理 与局限单击此处添加副标题
• 陈白雪 • Oct. 31, 2018
.
• 染色体病：染色体畸变引起 • 单基因遗传病
• 常染色体显性遗传：携带杂合致病突变即可发病。 • 常染色体隐性遗传：携带纯合致病突变或复合杂合
突变才能发病。 • 伴X连锁遗传 • 伴Y连锁遗传
• 多基因遗传病：多基因、环境因素联合 作用导致疾病发生
• 细胞核基因 • 线粒体基因
• 检测精度：20个以内碱基的替换、缺 失、重复 • 局限性
• 仅适用于目标基因明确的单基因遗传病检 测
.
Sanger测序应用举例
.
多重连接酶依赖性探针扩增技术 （MLPA） • 探针与待检测基因序列进行特异性杂交，通过探针的连接、PCR扩
增，收集数据并进行分析 • 可应用于缺失、重复突变检测，主要针对基因外显子。 • 亦可用于分析特定的点突变（通常是热点突变），前提是试剂盒里 已经有针对该突变设计的探针
相当于把几本一样的书撕碎了（一份DNA溶液里面有 无数条DNA分子）。再叫一堆人（一个人就是一个 read），每人发一个碎片校对。 由于撕碎是随机的，会有N个人校对到同一个句子 （N=深度）。一个地方被校对的次数越多，校对结果 准确性就越高。
.
高通量检测：“鸟枪法”
核基因组全局分析 大片段缺失/重复
Sanger测序 MLPA
FA
已知微小突变
√
√
×
wk.baidu.com
未知微小突变
√
×
×
大片段重复/缺失
×
√
√*
UPD（单亲双体）
×
×
√
动态突变
√**
×
√
* ：FA分析大片段缺失需要明确具体缺失范围，而MLPA只需要明确基因即可
**：理论上Sanger测序也能数动态突变重复单位个数，但人工数易出错，且当 片段过长时容易超出Sanger测序分析的范围。
标本培养
核型分析 √
>=3M √ × √
CMA √
>=100k × √ ×
NGS √* ×** × × ×
* ：仅限于全基因组测序能做到核基因组全局分析，若只是全外显子组或者 Gene Panel则不行。
**：不能保证检出，若检出则需经过其他实验（例如MLPA）验证 。
.
保证中彩票头 奖的方法：
• 线粒体遗传病：呈母系遗传 （复习：母系遗传=患病
女性所有子女都患病？）
.
没有一种药包治百病，如果有，那就是 毒药
没有哪一种检测方法能够搞定所有 的事情，如果有，那就是忽悠
.
复习
• 遗传病的基因检测，本质上就是以参考基因为基准，对样本基因进行校对
.
.
一代测序/Sanger测序
• 经典的直接测序方法，基因突变检测 的“金标准” • 检测范围：
• 片段分析的应用范围广泛
.
片段分析（Fragment Analysis，FA）
• 可用于单亲二倍体/LOH的检测
• 以下为全染色体组UPD的CMA结 果
• 一对染色体分别来自父母。当缺失
了其中一方来源的染色体（LOH），
或者是某一对染色体同时来自父或
母亲的一方（单亲二倍体，UPD）
• UPD可以发生在局部，也可发生于 整个染色体组
12
34
56
78
13
正常
17
.
57
12
34
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78
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同源
11
.
12
34
56
78
13
57
异源
13
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PWS/AS：CMA or FA？？？
CMA
FA
核基因组全局分析
√
×
仅检测患者，区分PWS/AS
×
√
仅检测患者，区分LOH/UPD
√
×
对于首选片段分析（FA）方法的PWS/AS患者， 先做3370项目（协助确诊）。 若结果为阳性，可以再做3381（协助判断预后） 注意：若患者为异源性UPD，则CMA无法检出， 但片段分析项目可以…… .
•
对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠产物的遗传学检测 书撕成一页一页的再拿去
• 可以检测出同源性单亲二倍体（UPD）
校对，就不能检查出页码 装订错误了
• 局限性
• 无法检出染色体倒位,易位,互换等结构变异
相当于升级版的核型分析，能查到比普通核型分析
更加细小的拷贝数改变以及单亲二倍体。
但是结构改变不行 .
“下一代”测序技术 Next-generation sequencing , NGS
• 优势：能同时对无数条DNA分子进行序列测定，效率极高 • 技术特点：每次测很短的片段（读长较短），但是可以通过超大量的平行测序，获得 大量的序列。
.
（某个位点的）深度：这个位点 被测的次数 read(s)：测序直接得出的短序列
.
技术原理
.
扩增产物毛细管 电泳结果
MLPA探针结构
.
.
片段分析（Fragment Analysis，FA）
• 借助毛细管电泳，检测待测物（通常为PCR扩增产物）中是否有特定长度 （范围）DNA片段出现
• 无法检测出序列内部的碱基改变
• 例如“SRY基因片段分析”项目：提取样本总DNA后，用SRY基因特异引物进行PCR 扩增，并将扩增产物进行毛细管电泳，观察是否有目标长度的扩增产物
猜中“有奖” 猜不中“白折 腾”
.
染色体显带技术，Chromosome
banding G显带染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断的“金标准”
•应用范围 • 使染色体大小和形态一目了然,特别是发生在染色体上的遗传疾病，如染色体倒位、易 位、互换和短缺，都可以及时发现,有利于临床诊断
•局限性 • 细胞培养耗时长、分辨率低以及耗费人力 • 对线粒体病无能为力
• 如果发生在染色体“印迹区”，则 可导致疾病发生
.
• 对样本目标序列进行甲基化特异性 PCR后，印迹（DNA甲基化状态） 不同的序列会发生碱基的改变，并 扩增得到长短不一的片段
• 借助毛细管电泳，检测待测物 （通常为PCR扩增产物）中是 否有特定长度DNA片段出现
.
.
低通量检测：“有的放矢”
报告单出现类似右边的图像→_→ 就是核型报告 有该项目疑问请咨询 @陈帆 @吴梦华
47，XX，+21
.
染色体微阵列分析
Chromosome microarray analysis, CMA
• 应用范围
• 儿童复杂、罕见遗传病，如：智力障碍、生长发育迟缓、多发畸形、孤独症样临床表现，排 除染色体病、代谢病和脆性X综合征之后的全基因组CNV检测 （包括智力低下、发育迟缓、 多种体征畸形以及自闭症中，CMA比传统G显带核型分析技术的检出率提高了10％）
常用基因检测方法原理 与局限单击此处添加副标题
• 陈白雪 • Oct. 31, 2018
.
• 染色体病：染色体畸变引起 • 单基因遗传病
• 常染色体显性遗传：携带杂合致病突变即可发病。 • 常染色体隐性遗传：携带纯合致病突变或复合杂合
突变才能发病。 • 伴X连锁遗传 • 伴Y连锁遗传
• 多基因遗传病：多基因、环境因素联合 作用导致疾病发生
• 细胞核基因 • 线粒体基因
• 检测精度：20个以内碱基的替换、缺 失、重复 • 局限性
• 仅适用于目标基因明确的单基因遗传病检 测
.
Sanger测序应用举例
.
多重连接酶依赖性探针扩增技术 （MLPA） • 探针与待检测基因序列进行特异性杂交，通过探针的连接、PCR扩
增，收集数据并进行分析 • 可应用于缺失、重复突变检测，主要针对基因外显子。 • 亦可用于分析特定的点突变（通常是热点突变），前提是试剂盒里 已经有针对该突变设计的探针
相当于把几本一样的书撕碎了（一份DNA溶液里面有 无数条DNA分子）。再叫一堆人（一个人就是一个 read），每人发一个碎片校对。 由于撕碎是随机的，会有N个人校对到同一个句子 （N=深度）。一个地方被校对的次数越多，校对结果 准确性就越高。
.
高通量检测：“鸟枪法”
核基因组全局分析 大片段缺失/重复
Sanger测序 MLPA
FA
已知微小突变
√
√
×
wk.baidu.com
未知微小突变
√
×
×
大片段重复/缺失
×
√
√*
UPD（单亲双体）
×
×
√
动态突变
√**
×
√
* ：FA分析大片段缺失需要明确具体缺失范围，而MLPA只需要明确基因即可
**：理论上Sanger测序也能数动态突变重复单位个数，但人工数易出错，且当 片段过长时容易超出Sanger测序分析的范围。