微生物实验常用抗生素浓度配制
常用微生物培养基
常用微生物培养基分离真菌：注：抗生素所有培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40°C左右），同时加入氯霉素和链霉至终浓度为0.5 mg/mL（提前配置好，用0.22 µm微孔滤膜过滤，-20℃存储），混匀后倒平板，用于抑制细菌生长。
1.GPY培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母提取物10 g，海盐15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.5，115℃，30 min灭菌2.PDA培养基：Potato Dextrose Agar干粉39 g/L，海盐15 g，蒸馏水1 L，pH 6.5-7.0，121℃，15 min灭菌3.马丁培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾1 g，七水合硫酸镁0.5 g，孟加拉红0.03 g，海盐15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，115℃、30 min灭菌4.MEA培养基：麦芽浸粉17g，蛋白胨3g，海盐15g，蒸馏水1L，121℃，20 min 灭菌5.YPD培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，115℃，30 min灭菌6.沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，每升培养基）：蛋白胨（peptone）10.0 g，葡萄糖（glucose）40.0 g，琼脂（agar）15.0 g，pH 4.0 - 6.0；7.酵母汁麦芽提取物琼脂培养基（YM，每升培养基）：麦芽浸粉（malt extract）3.0 g，酪蛋白胨（casein peptone）5.0 g，酵母提取物（yeast extract）3.0 g，葡萄糖（glucose）10.0 g，琼脂（agar）15 g，pH 6.0 - 6.5；8.察氏培养基（CDA，每升培养基）：硝酸钠（NaNO3）3. 0 g，氯化钾（KCl）0.5 g，蔗糖（sucrose）30. 0 g，七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0. 01 g，磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0 g，琼脂（agar）15.0 g，pH 6.0 - 6.5；分离放线菌：注：抗生素所有培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40℃左右），同时加入制霉菌素（终浓度为100.0 μg/ml）和萘啶酮酸（终浓度为25.0 μg/ml）（提前配置好，用0.22µm 微孔滤膜过滤，于-20℃冻存），混匀后倒平板，分别用于抑制真菌和细菌生长。
管碟法
实验2 管碟法测定土霉素生物效价一、目的要求1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
二、基本原理衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。
此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。
因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法的一种。
本实验采用管碟法测定抗生素的效价。
管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。
抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。
因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。
将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。
三、实验材料1、培养基（供摊布平板用）蛋白胨6g 酵母膏6g 牛肉膏1.5g 葡萄糖1g 琼脂15—18g蒸馏水1000ml pH:6.8 1.05kg/cm?/SPAN> 121.3?/SPAN>C灭菌20分钟2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcina flava）3、土霉素碱标准品4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（5 00ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。
微生物实验培养基配方
微生物实验培养基配方基础培养基配方：1.水：用去离子水或蒸馏水配制培养基。
2.碳源：葡萄糖是最常用的碳源，可提供微生物的能量和碳原子。
浓度通常为0.2-1%。
3.氮源：氨基酸、氨基酸类衍生物、蛋白胨、氨基酸盐等都可以作为氮源。
蛋白胨的浓度通常为0.5-1%。
4.无机盐：常用的无机盐包括NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。
它们提供微量元素和维持渗透平衡。
浓度根据不同微生物的要求而变化。
5.辅助物质：维生素、生长因子、酶、抗生素等物质有时会被添加到培养基中以满足微生物特殊的生长需求。
基础培养基通常是通用的，适用于多种微生物的培养和繁殖。
然而，根据不同的微生物，配方中可能会有一些调整和特殊需求。
以下是一些常见微生物群体的基础培养基配方：1.嗜热菌培养基配方：-水：去离子水。
-碳源：葡萄糖（1-2%）。
-氮源：氨基酸、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
2.嗜酸菌培养基配方：-水：蒸馏水。
-碳源：果糖（2-4%）。
-氮源：天门冬氨酸盐、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
3.嗜碱菌培养基配方：-水：去离子水。
-碳源：葡萄糖（1-2%）。
-氮源：氨基酸、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
4.厌氧菌培养基配方：-水：蒸馏水。
-碳源：葡萄糖（1-2%）。
-氮源：氨基酸、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
除了上述配方外，还可以根据实验需求添加抗生素、指示剂等。
抗生素可以抑制细菌、真菌和其他微生物的生长；指示剂则可以用来检测微生物的生长或一些特殊代谢产物的形成。
总之，微生物实验培养基的配方需要根据微生物的类型和特殊需求进行调整，以提供适宜的营养和环境条件，促进微生物的生长和繁殖。
抗生素敏感试验操作规程
抗生素敏感试验操作规程一、抗生素敏感试验原理:抗生素敏感试验是测定抗生素或其它抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力，通常用扩散法或稀释法。
1、扩散法敏感试验:有抗生素的纸片或药片贴在已接种试验菌的平板上，抗生素浓度梯度通过纸片上的抗生素的弥散作用而形成，距纸片一定范围内试验细菌的生长受到抑制，这种抑制生长与细菌敏感及其他诸因素相关。
2、稀释法敏感试验：为了定量测定抗生素的活性，抗生素与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，以最低浓度抑制细菌生长的，称为最低抑菌浓度（MIC），然后将最低抑菌浓度与机体血清或体液中可获得浓度相比较，来确定恰当的临床治疗浓度。
（1）最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration。
MIC）:抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。
单位：μg/ml或U/ml,mg/L。
（2）最低杀菌浓度（minimal bacteriacidal concentration，MBC）:抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。
单位：μg/ml或U/ml，mg/L。
（3）MIC90：能抑制90%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC90。
（4）MIC50：能抑制50%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC50。
二、抗生素敏感试验的作用：1、指导临床医生对各患者选择最佳抗生素。
2、在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料。
三、抗生素敏感试验的临床意义：1、敏感：表示被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗生素常用剂量而达到治疗的目的。
2、中介：表示被测菌株可通过提高剂量受到抑制，或在药物被生理性浓集的部位受到抑制，由于微小的技术因素失控可以对结果解释错误，所以这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的“缓冲域”抑菌环落入中介范围，其意义不明确，如果没有其他可以替代的药物，应重复或再以稀释法测定MIC。
3、耐药：被测菌不能被该抗生素的常用剂量在组织内或血液中的浓度达到抑制作用，而且不管其剂量大小或细菌所在部位。
临床微生物学与检验
4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 4.用镊子将E TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，9mm平板只能放置1～2试条 。 条，9mm平板只能放置1 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
徐元宏
常用方法：
纸片扩散法 微量液体稀释法 E-TEST法 TEST法
原理：
纸片扩散法（Kirby纸片扩散法（KirbyBauer法 Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度10 CFU/ml。 浓度105 CFU/ml。
6.用微量加样器接种100μl 6.用微量加样器接种100μl 到96孔中，盖上盖板。 96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。 6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
微生物实验常用抗生素浓度配制
微⽣物实验常⽤抗⽣素浓度配制微⽣物实验常⽤抗⽣素浓度配制----------四川⼤学⽣命学院-微⽣物代谢与⼯程重点实验室1、氨苄青霉素（[Amp]Ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
2、羧苄青霉素（[Car]Carbenicillin）（50mg/ml）溶解0.5g羧苄青霉素⼆钠盐于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
3、甲氧西林（[Met]Methicillin）（100mg/ml）溶解1g甲氧西林钠于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以37.5ug/ml 终浓度与100ug/ml氨苄青霉素⼀起添加于⽣长培养基。
4、卡那霉素（[Kan]Kanamycin）（10mg/ml）溶解100mg卡那霉素于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
5、氯霉素（[Cm]Chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素⾜量的⽆⽔⼄醇中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
6、链霉素（[Str]Streptomycin）（50mg/ml）溶解500mg链霉素硫酸盐于⾜量的⽆⽔⼄醇中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
7、萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）溶解50mg萘啶酮酸钠盐于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以15ug/ml 的终浓度添加于⽣长培养基。
8、四环素（[Tet]Tetracyyline）（10mg/ml）溶解100mg四环素盐酸盐于⾜量的⽔中，或者将⽆碱的四环素溶于⽆⽔⼄醇，定容⾄10ml。
微生物学检验(第3版)药物敏感试验
抗生素的种类 一.目的：
四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。
抗生素的种类 一.目的：
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
纸片的名称，然后用棉试子蘸取菌液，在试管内
壁轻挤去多余菌液后均匀涂布于整个平板表面3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂一周。放 置约5分钟后用镊子分别挟取所选择的药敏纸片贴 上。室温放置10分钟左右，恒温箱培养24h。
验操实作
• (4)、MH平板涂布均匀，放置5分钟再贴纸 片，纸片放置应该迅速准确，不得在平板 上拖动纸片，纸片间的距离和位置要均匀。 离平板边缘不小于15mm，两纸片间距离不 小于24mm。
实验原理 1.原理：
实验操作（接种与培养）
• (1)、取待测菌平板，观察菌落形态，涂片镜检， 革兰阴性杆菌做氧化酶试验，革兰阳性球菌做触 决定选择何组、何种药敏纸片。
酶实验。并根据实验结果对该菌株作出初步判断，
药敏试验选择纸片
• 触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环
丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林 庆大、环丙沙星、万古
(一）苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。
普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度
普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度下面的内容摘自《分子克隆》第三版附录2①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度氨苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）羧苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）氯霉素贮液浓度 34 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 25 μg/ml （严紧型质粒） 170 μg/ml （松弛型质粒）卡那霉素贮液浓度 10 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）链霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）四环素贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）利福平，Rifampicin (INN) 简写为Rif。
分子式：C43H58N4O12，相对分子质量为822.94022 [g/mol]。
化学名 3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]-利福霉素利福平是一种半人工合成的抗生素，最初从地中海氏拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）中获得。
利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。
该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。
药敏试验稀释法实验步骤
药敏试验稀释法实验步骤
药敏试验稀释法是一种评估微生物对抗生素敏感性的方法，它涉及到
一系列实验步骤。
下面，我们将详细介绍药敏试验稀释法的实验步骤。
第一步：制备培养基和药物
首先需要准备适用于试验的培养基和药物。
培养基通过混合一定比例
的营养物质和水来制备。
药物则需要选择合适的抗生素，并浓度梯度
制备一定浓度范围内的药物，以评估微生物对其的敏感性。
第二步：制备菌液悬浮液
将待测试的微生物进行处理和制备，使之能够形成可滴定的菌液悬浮液。
第三步：制备不同浓度的药物溶液
选定适当的抗生素浓度范围，制备不同浓度的药物溶液。
第四步：将菌液和药物溶液依次加入培养基
按照不同的规格加入菌液和药物，稀释到一定程度，与培养基混合，确保未发生任何污染并在适宜的温度下进行培养。
第五步：观察并记录结果
在适当时间内观察培养基中生长情况，并记录不同浓度的药物对不同菌株的作用。
根据菌液的生长情况和抗生素的效果，评估微生物对抗生素的敏感性。
总之，药敏试验稀释法实验步骤需要准确制备培养基和药物、从微生物制备出随着浓度稀释的菌液，将药物作为稀释剂加入培养基，并根据实验结果，进行细菌药敏感性的判定。
这种方法既简单易行，又能够为人们提供比较精准的药物治疗方案，目前已广泛应用于临床和学术调研工作中。
微生物学实验常用培养基的
牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）121℃灭菌20min。
2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000mL。
121℃灭菌20min。
3、查氏（Czapek）培养基（培养霉菌用）121℃灭菌20min。
4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）112℃灭菌30min。
临用前加入0.03%链霉素稀释液100mL，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
5、马铃薯培养基（简称PDA）（培养真菌用）培养基的配制：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补足水至1000mL。
121℃灭菌30min。
6、麦芽汁琼脂培养基培养基的配制：(1)、取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。
(2)、将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。
加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
(3)、将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
(4)、将滤液稀释到5—6波美度，pH约6.4，加入2%琼脂即成。
121℃灭菌30min。
7、无氮培养基（自生固氮菌、钾细菌）113℃灭菌30min。
8、半固体肉膏蛋白胨培养基121℃灭菌20min。
9、合成培养基加12 mL0.04%的溴钾酚紫（pH5.2—6.8，颜色由黄变紫，作指示剂）。
121℃灭菌20min。
10、豆芽汁蔗糖（或葡萄糖）培养基培养基的配制：称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加入水1000mL，煮沸约30min，用纱布过滤。
用水补足原量，再加入蔗糖（或葡萄糖）50g，煮沸熔化。
比浊法操作手册
⽐浊法操作⼿册⽐浊法操作规程⼀、准备⼯作：（⼀）培养基的制备：1、III号培养基的制备胨 5 g 葡萄糖 1 g⽜⾁浸出粉 1.5 g 磷酸氢⼆钾 3.68g磷酸⼆氢钾 1.32 g 氯化钠 3.5 g酵母浸出粉 3 g ⽔1000 ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
2、营养琼脂培养基的制备按照营养琼脂培养基上标注的⽐例系数，进⾏营养琼脂培养基和纯化⽔配制。
或者按照药典进⾏配制。
胨10 g 氯化钠 5 g琼脂15~20 g ⾁浸液1000 ml 除琼脂外，混合上述成分，调节pH值使⽐最终的pH值略⾼0.2～0.4，加⼊琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜⾯。
3、注意事项（1）含有葡萄糖的培养基应在各成分加热溶解后再加⼊，其⽬的是防⽌葡萄糖加热被破坏。
（2）配制的培养基必须调节pH值，保证培养基灭菌后其pH值在规定范围之内；测定硫酸庆⼤霉素的培养基pH值灭菌后最好在7.15～7.20。
pH值的测定使⽤酸度计或其它准确度较⾼的仪器，使⽤20%的氢氧化钠溶液或浓盐酸进⾏调整；调节pH时应避免反复调节。
（3）配制的培养基应透明、⽆沉淀。
应先调节pH再分装后灭菌。
（4）配制好的培养基应储存在冷处，出现浑浊后不能继续使⽤。
（⼆）缓冲液的制备：1、pH7.0磷酸盐缓冲液（BP）磷酸⼆氢钾13.6 g 氢氧化钠 2.37 g 灭菌⽔2000 ml2、pH7.8磷酸盐缓冲液磷酸氢⼆钾 5.59g 磷酸⼆氢钾0.41 g ⽔1000ml3、注意事项（1）所⽤化学药品规格不低于⼆级试剂(AR)规格。
（2）配制后若出现沉淀或浑浊应⽤耐酸滤过漏⽃滤过，使溶液澄清。
（3）缓冲液配制后应澄明⽆⾊、⽆菌、⽆浑浊沉淀，应避免被⽑点、纤维污染。
（4）配制后应灭菌保存使⽤。
抗生素生物效价测定详细参考
---一参照秘斗一一页眉页脚可删除一一实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2.掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于乂集（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）（式 2.10-1）V=（UH+UL）-（SH+SL）（式2.10-2）式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出① 0=D-antilog（IV/W）（式 2.10-3）式中：。
抗生素的测定
抗生素效价的生物测定一、目的要求学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。
二、基本原理某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。
抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。
在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。
由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。
但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。
尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。
本实验以龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）产生的土霉素效价测定为例。
三、器材黄色八叠球菌（Sarcina flava）；（土霉素效价测定用）培养基，（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶， 0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。
四、操作步骤1．pH6．0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO40．8g和K2HPO40．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。
2．标准土霉素溶液的配制精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。
生物实验--抗生素微生物检定法
生物实验--抗生素微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
标准品的品种、分子式及理论计算值见表2.培养基及其制备方法培养基I胨5g琼脂15～20g 牛肉浸出粉3g水1000ml磷酸氢二钾3g除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH 值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ胨6g葡萄糖1g牛肉浸出粉1.5g琼脂15～20g酵母浸出粉6g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ胨5g磷酸氢二钾3.68g牛肉浸出粉1.5g磷酸二氢钾1.32g酵母浸出粉3g葡萄糖1g氯化钠3.5g水1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅳ胨10g葡萄糖10g氯化钠10g琼脂20～30g枸橼酸钠10g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅴ胨10g琼脂15～20g麦芽糖40g水1000ml除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基Ⅵ胨8g磷酸二氢钾1g 牛肉浸出粉3g 葡萄糖2.5g酵母浸出粉5g琼脂15～20g氯化钠45g水1000ml 磷酸氢二钾 3.3g 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。
微生物药敏实验报告
微生物药敏实验报告微生物药敏实验报告概述微生物药敏实验是鉴别细菌对抗生素敏感性的重要实验方法。
通过药敏实验，临床医生能够选择合适的抗生素治疗感染，从而提高治疗效果，减少不必要的药物使用，降低细菌耐药性的风险。
本报告将详细介绍药敏实验的过程和结果，并分析实验数据。
实验过程1、菌株选择与培养实验开始前，我们从临床样本中选择了具有代表性的菌株，包括革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）和革兰阴性菌（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等）。
这些菌株通过分离培养、纯化及鉴定，确保其种类和特性的准确性。
2、抗生素选择与制备根据临床常见感染和抗生素使用情况，我们选择了多种常用的抗生素，包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等。
在实验前，我们将每种抗生素制备成适合药敏实验的浓度。
3、药敏实验我们将上述菌株和抗生素按照规定的比例和方法进行接种和培养。
在设定的时间点观察细菌的生长情况，并记录每个菌株对不同抗生素的敏感性。
4、数据处理与分析根据实验结果，我们将各种抗生素对不同菌株的抑菌圈直径进行测量和记录，并计算出各个菌株对不同抗生素的敏感性和耐药性。
实验结果以下是实验中部分抗生素对部分菌株的药敏结果：从上表可以看出，不同的菌株对同一种抗生素的敏感性不同，同一种菌株对不同抗生素的敏感性也可能存在差异。
例如，金黄色葡萄球菌对青霉素G、头孢唑林、庆大霉素等敏感，但对氨苄西林/舒巴坦耐药；大肠埃希菌对氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、阿米卡星等耐药，但对左氧氟沙星、环丙沙星敏感。
这些结果对于临床医生选择合适的抗生素治疗感染具有指导意义。
结论通过本次微生物药敏实验，我们获得了大量有关不同菌株对常用抗生素敏感性的数据。
这些数据不仅有助于临床医生精确选择抗生素，提高治疗效果，还能减少不必要的药物使用，降低细菌耐药性的风险。
本实验也提醒我们，对于感染的治疗，除了选择合适的抗生素外，还需要结合患者的具体情况，采取综合治疗措施，以提高治疗效果，缩短病程。
病原微生物的药敏试验与抗生素选择
病原微生物的药敏试验与抗生素选择病原微生物引起的感染疾病对人类健康构成了严重威胁。
为了有效治疗这些感染，药敏试验和合理的抗生素选择变得至关重要。
本文将介绍病原微生物的药敏试验方法，并讨论如何基于试验结果进行抗生素的选择。
一、药敏试验的方法与步骤药敏试验旨在评估病原微生物对不同抗生素的敏感性，以确定最适合的治疗方案。
常见的药敏试验方法包括盘扩散法和微量稀释法。
1. 盘扩散法：盘扩散法是最常用的药敏试验方法之一。
它将药物溶液均匀涂布在琼脂平板上，再在平板上接种病原微生物。
经过一段时间后，观察形成的抑菌圈直径，根据直径大小判断微生物对抗生素的敏感程度。
2. 微量稀释法：微量稀释法主要用于对革兰阳性和革兰阴性菌的药敏试验。
该方法在96孔板中逐渐稀释不同浓度的抗生素，并接种微生物。
通过观察最小抑菌浓度（MIC），确定微生物对抗生素的敏感性。
二、抗生素选择的原则与策略根据药敏试验结果，选择合适的抗生素是有效治疗病原微生物感染的关键。
以下是常用的抗生素选择原则和策略：1. 根据敏感性结果选择：选择对病原微生物敏感的抗生素。
根据敏感性结果，将抗生素划分为敏感（S）、中介（I）和耐药（R）三类。
优先选择敏感的抗生素，避免使用耐药菌株常见的药物，以防止感染的进一步扩散和耐药菌株的增加。
2. 考虑细菌特性：根据病原微生物的特性选择抗生素。
有些抗生素对革兰阳性菌更有效，而一些对革兰阴性菌更具杀菌作用。
了解病原微生物的革兰染色特性以及其它特性，有助于更好的选择合适的抗生素。
3. 个体化选择：根据患者的情况进行个体化抗生素选择。
考虑患者的年龄、性别、过敏史和药物相互作用等因素，选择合适的抗生素。
避免使用患者已知过敏的药物，同时选择副作用较小的药物，以减少不必要的风险。
4. 注意治疗周期和剂量：遵守药物的推荐剂量和治疗周期，以确保药物对病原微生物的有效杀菌作用。
过短的治疗周期可能导致病原微生物的耐药性增加，而过长的周期则可能增加耐药菌株的选择压力。
微生物药敏实验及合理使用抗生素
微生物药敏实验技术的发展趋势
高通量自动化
随着技术的进步，微生物药敏实验将更加趋向高 通量、自动化，提高实验效率和准确性。
智能化分析
借助人工智能和机器学习技术，对实验数据进行 智能分析，快速准确地解读药敏结果。
耐药性检测
针对多重耐药菌的耐药性检测将更加精准和快速， 为临床提供及时有效的指导。
将样本接种在培养基上，在适 宜的温度和环境下培养一定时 间，使病原体生长繁殖。
药敏试验
在培养后的病原体中加入不同 种类的抗菌药物，观察病原体 对药物的反应，如抑制生长、 杀菌效果等。
结果解读
根据病原体对药物的敏感程度 ，判断哪种药物对该病原体有
效，从而指导临床用药。
药敏实验结果的解读
敏感
表示病原体对该药物敏感，通常 在常规用药剂量下即可达到治疗
的副作用。
抗生素的联合使用
01
02
03
04
协同作用
在某些情况下，联合使用两种 或多种抗生素可以产生协同作
用，增强抗菌效果。
扩大抗菌谱
联合用药可以扩大抗菌谱，覆 盖更多种类的病菌。
减少耐药性
合理地联合使用抗生素可以减 少单一用药时病菌产生耐药性
的机会。
注意配伍禁忌
不同抗生素之间可能存在配伍 禁忌，需谨慎选择联合用药方
四环素类
包括四环素、土霉素等，通过 抑制细菌蛋白质合成发挥抗菌 作用。
其他类
包括氯霉素、磺胺类、喹诺酮 类等，通过不同机制发挥抗菌 作用。
各类抗生素的作用机制
四环素类
氨基糖苷类
通过抑制细菌蛋白质合成的关键 酶，使细菌细胞膜功能受损，引 起细菌死亡。
通过与核糖体结合，抑制细菌蛋 白质合成，导致细菌生长受阻死 亡。
抗生素效价测定技术—抗生素效价微生物检定法
知识点3：浊度法
四、检定操作方法
（一）线性试验
除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验
管内精密加入含试验菌的液体培养基9. 0ml，再分别精密加入各浓
度的标准品溶液1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定
条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。
知识点3：浊度法
（三）空白试验
线关系，可采用t检验。
4．测定结果的计算及可信限率估计。
5．实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的1 10%，则检验
结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。
知识点3：浊度法
6．原料药效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符
合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
供试品低剂量溶液
（即SH→TH→SL→TL）
6.测量抑菌圈 双碟透明度好，无破损和不透明现象；抑菌圈应圆满，无破
圈或圈不完整现象，否则应弃去该双碟。
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
在恒温培养箱中培养至规定时间
技能点1：二剂量法操作规程
• 测量抑制圈
的污染，放双碟的台面应用水平仪调水平。
玻璃/塑料
平皿(d=90mm
h=16-17mm)
菌层
5ml
含菌培养基
底层
20ml
灭菌培养基
技能点1：二剂量法操作规程
制备底层
制备菌层
技能点1：二剂量法操作规程
4.放置钢管
5.滴碟、培养
毛细滴管（或滴管）滴碟
滴加顺序：按标准品高剂量溶液→供试品高剂量溶液→标准品低剂量溶液→
抗菌药物最小抑菌浓度的测定
抗菌药物最小抑菌浓度的测定一、概念：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵冇24 小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于泄量测立体外抗菌活性。
二、实验目的：通过采用常量稀释法，检测几种抗菌药物对--菌株的最小抑菌浓度（MIC）, 对临床诊断用药有指导作用。
三、仪器和试剂:MH液体培养基无菌试管分光光度计0.5麦氏标准比浊管MH琼脂微量加样器蒸饰水吸头0.1 mol磷酸缓冲液接种环(PH6.0)无菌生理盐水无菌平板无菌滤膜0.22无菌针筒抗菌药物金黄色匍萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌四、检验方法：液体稀释法、琼脂稀释法、E试验（Etcst）液体稀释法操作步骤：抗菌药物原液配置0000000000000MH液体试管中抗菌药物梯度稀释观察结果1..抗菌药物原液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000ug/ml(如1280ug/ml)或10倍于最高测左浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280ug/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750ixg/mgo用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg.根据公式讣算所需稀释剂用量为：(182.6 mgX75O u g/ml)/1280 ug/ml= 107.0ml,然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表1。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20°C环境，并注意抗菌药物的保存期限。
表1稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法2.药敏试验用抗菌药物浓度范带|根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范国应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
3.培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton (MH)肉汤，pH7.2~7.4。
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微生物实验常用抗生素浓度配制
----------四川大学生命学院-微生物代谢与工程重点实验室
1、氨苄青霉素（[Amp]Ampicillin）（100mg/ml）
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
2、羧苄青霉素（[Car]Carbenicillin）（50mg/ml）
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
3、甲氧西林（[Met]Methicillin）（100mg/ml）
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以37.5ug/ml 终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。
4、卡那霉素（[Kan]Kanamycin）（10mg/ml）
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
5、氯霉素（[Cm]Chloramphenicol）（25mg/ml）
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6、链霉素（[Str]Streptomycin）（50mg/ml）
溶解500mg链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7、萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以15ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。
8、四环素（[Tet]Tetracyyline）（10mg/ml）
溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。
分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
9、庆大霉素（[Gm]Gentamicin）（50mg/ml）
溶解500mg硫酸庆大霉素于足量的去离子水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。