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生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法

(一)制备工艺流程

（1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺

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|猴肾细胞培养

| ←接种病毒（测0%正常细胞对照）

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收获病毒，合并，加MgCl2→ |

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无菌试验→ | ←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40）

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B病毒检查（兔肾细胞）→ | ←病毒效价滴定

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|←合并，过滤加MgCl2

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| ←无菌试验

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分亚批→ | ←柯萨奇病毒检查（乳鼠）

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病毒滴定→ | ←型特异性检查

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B病毒复检（家兔）→ | ←T特征试验

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分装病毒滴定→ | ←猴体残余致麻痹力试验

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（安全试验）病理切片 |

结核杆菌检查→ |

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分装→ | ←无菌试验

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病毒滴定→ |

→

保存于-20℃待检定合格后

加工糖丸

2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺

地鼠肾

剪碎，胰酶消化

地鼠肾细胞悬液

37℃,3天细胞培养液，pH7.0～pH7.2

单层细胞

洗涤细胞，去除牛血清

10-4～10-5浓度病毒感染细胞

32～34℃培养2～3天

收获病毒液（收二次）

按1:2000加入甲醛

22℃，8天

灭活病毒液

合并，安全及效力试验

原液

加入亚硫酸氨钠

半成品

分装

成品

检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验，

防腐剂、试剂及残余牛血清含量等）

合格成品

(二)生产方法：

病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。

1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺

作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6 Log TCID50/m L，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。

①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。

②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。

微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，

3～4天后细胞密度已达1×106细胞/mL

静置30分钟

尽量吸去原培养基

37℃

将10-2VSV病毒按50mL培养体积加入1mL病毒液于微载体细胞中

37℃50r/min搅拌5分钟

静置吸附1小时（每20分钟搅拌2分钟）

加入病毒维持液至原体积

37℃继续搅拌培养20小时

于-30℃冻融后

2000 r/min 低温离心10分钟

收集上清，即为VSV增殖的病毒液，分装冻存，待测效价

结果，在微载体悬浮培养的三株细胞所繁殖VSV病毒不仅产量大，而且病毒效价平均高1LogTCID50，尤以CHO-K1效价最高，平均可达7.75logTCID50比原先的毒种效价还要高1.75LogTCID50，又起到了提高病毒效价的作用。

此方法也可应用于生产病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感细胞能在微载体上大量生产。若疫苗株是减毒活疫苗株，此法生产的病毒可直接制备活疫苗。若疫苗株为非减毒活疫苗株，此法生产的病毒可用甲醛灭活法制备死疫苗。

2、转瓶培养法

此法是目前各大生物制品研究所常用于生产疫毒疫苗的方法，如生产脊髓灰质炎病毒疫苗，麻疹疫苗等。

将细胞制备成悬液后，在温室内（37℃）使支架以8～12转/小时缓慢转动，以使细胞贴壁，当加入病毒后，待细胞出现+++以上细胞病理性改变(CPE)时，标志病毒已大量繁殖，此时收获病毒，按生物制品程序加工成疫苗。

3、罗式瓶培养

将许多大罗氏瓶，在净化室内，把制备好的细胞悬液人工加入瓶内，100mL/瓶，在温室内的货架上一排排放置，进行静置贴壁培养，待细胞呈单层后，倒去旧液，加含病毒疫苗株和维持液，继续静置培养，每天观察细胞和记录温室的温度，待细胞有明显的CPE产生时，收获病毒液，然后按疫苗生产加工工艺制成疫苗。

以上2、3两种方法是我国各大生物制品所常规方法，由于制品工艺的要求，目前仍然采用，但正在不断改进和采用新工艺、新方法和高技术来生产疫苗。