人胚胎干细胞研究进展

人胚胎干细胞的研究进展

周进学号10170807

【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。

【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述

1、胚胎干细胞的概念

胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。

胚胎干细胞属全能干细胞。ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞

相同的特征; ⑧、表达转录因子Oct- 4, 后者继而激活或抑制大量的靶基因, 以使ESCs 维持未分化状态; ⑨、可被诱导而继续增殖或进入分化状态; ⑩、缺乏细胞周期中的G1 期的限制点。ESCs 大部分时间都处于细胞周期的S 期, 在此期进行DNA 合成。与已分化的体细胞不同, ESCs 不需任何外界刺激来启动DNA 的复制。其中①、②、⑤、⑥、⑦不适用于人的EGCs, ⑤和⑥不适用于人的ESCs, 所有的标准都适用于小鼠的ESCs。

2、胚胎干细胞的获取途径及其“多能性

目前胚胎干细胞的获取途径主要有2个:一是从自然胚胎中获取,可在胚胎发育的不同阶段获得;二是通过细胞克隆得到的胚胎中获取,也可在胚胎的不同发育阶段获得。随着克隆技术的发展,后者显得更为容易。胚胎干细胞的多能性表现在它具有多种分化发育的潜能。其多能性学术上用两个词来加以区分:全能(totipotent),即指受精卵及囊胚细胞所具有的能力,除具有分化为机体所有细胞类型的潜能外,还有形成完整生物体的潜能;多能(pluripotent),即指从内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(又称胚胎生殖系干细胞)衍生而来的细胞或细胞株所具有的能力，能形成包括生殖系在内的所有组织类型,但形成一个完整的生物体的可能性很小。

3、胚胎干细胞研究的主要物种类型

3. 1人类目前全世界已取得了60 余种不同基因的胚胎干细胞系,主要分布在美国、澳大利亚、新加坡、印度及以色列等地。由于助孕技术中的超促排卵及体外受精2胚胎移植(试管婴儿) 技术的不断成熟和在世界各地的迅速开展,人胚胎干细胞的来源显得比其他物种更为容易和丰富,同时因为研究的直接性而为广大学者所重视。但由于法律和伦理的原因,胚胎干细胞的研究将受到诸多的限制。

3. 2 灵长类灵长类动物与人的关系密切且没有太多法律与伦理上的限制,所以灵长类胚胎干细胞是目前研究最多的胚胎干细胞种类,以恒河猴与绢猴为代表[2] 。

恒河猴与人类的关系最为密切,在生殖与生长发育过程中与人有许多相似之处,因此是胚胎学研究的最佳模型,恒河猴胚胎干细胞也就成了了解各种人体组织分化的很好的体外模型,但其生殖特性(性成熟晚、妊娠期长、单胎孕育等) 限制了其应用;绢猴为西半球灵长类动物,与人类的关系不如恒河猴近,但因其生殖特性在实验中获得了广泛的应用。绢猴一般是多胎孕育,性成熟期只有18 个月,妊娠期较短,更重要的是绢猴的卵巢周期可以在前列腺素的调节下同步化,这就可能收集到大量生长发育一致的胚胎。目前,绢猴胚胎干细胞为我们提供了一个了解灵长类胚胎移植和妊娠母系识别的非常重要的模型。

从恒河猴与绢猴胚胎中分离出的胚胎干细胞均具有其特有的一套特异性标志物,它们包括阶段特异性胚胎抗原3和4 (SSEA-3 和SSEA-4) 、高分子糖蛋白TRA-1-60 和

TRA-1-81、碱性磷酸酶等。这些标志物与标志人胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cells , EC 细胞) 的表面抗原相同。这表明灵长类与人类在胚胎学上有高度的相似性,而鼠胚胎干细胞仅表达SSEA-1 与碱性磷酸酶活性,说明胚胎干细胞表面标志物具有物种差异。

3. 3 小鼠(mouse) 由于历史上的广泛应用及已明了的遗传学机制和多产特性,使小鼠成为哺乳动物胚胎学的主要研究对象。世界上最早的胚胎干细胞株就是首先从小鼠胚胎中分离出来的。胚胎干细胞分离及培养的方法学也是由此建立并发展起来的。对小鼠胚胎干细胞做进一步研究有助于灵长类及人类胚胎干细胞研究的发展。

3. 4 其他如鱼、鸟、兔、猪等脊椎动物中亦能分离出多能胚胎干细胞株。胚胎干细胞研究物种的多样化对于研究生物体的早期发生过程是十分必要和重要的,如细胞的谱系定型和重组基因印迹等,对基因修饰及核移植技术的研究和发展也有重要的作用。

4、胚胎干细胞的分离与增殖技术

以从灵长类胚胎ICM中分离灵长类胚胎干细胞为例[3]

简述如下。

4. 1 分离ICM前的准备准备小鼠原始成纤维细胞层。将小鼠原始成纤维细胞用30Gy 的γ-射线处理,使它终止有丝分裂活动,以5 ×104 个/ cm2 的密度置于用0. 1 %动物胶处理后的组织皿中,加入培养液(80 % DMEM、20 %胎牛血清、0.1mmol/ L 22巯基乙醇和1 %非必需氨基酸溶液) ,置5 % CO2温箱中孵育过夜。

4. 2 分离ICM 将排卵后6d 的恒河猴囊胚(或排卵后8d 的绢猴囊胚) 放入0. 5 % DMEM 中孵育,至透明带破裂时立即将囊胚移入含兔抗恒河猴脾细胞(或兔抗绢猴脾细胞) 抗体的DMEM中,孵育30min ,经DMEM冲洗后再移入1 :10 的几内亚猪补体中30min ,再经DMEM 冲洗后,用吸管吸除ICM中的滋养层细胞,最后将ICM种植在饲养层上。

4. 3 胚胎干细胞的培养和增殖种植7～10d 后,将ICM来源的细胞团移入含0. 05 %胰蛋白酶的EDTA 中3～5min ,用吸管轻轻吹打使它散开,将细胞种植到新培养基上。细胞集落形成后,再将单个细胞分离出来种植到新培养基上,如此反复,7～10d 进行1 次。

4. 4 胚胎干细胞的冷冻保存如需要将胚胎干细胞冷冻,最好在培养早期进行,选择细胞形态及核型均正常的细胞冷冻,并在液氮中长期保存。

4. 5 操作注意事项(1) 定期将未分化的细胞集落从已分化的细胞中分离出来并种植到新的培养基上; (2) 转移细胞时尽量快,以免细胞发生解离和死亡; (3) 分离细胞集落时使每个部分含5～10 个细胞,否则细胞过多将导致分化,细胞过少则克隆的效率低; (4) 由于胚胎干细胞是对各种内毒素最为敏感的细胞,故要重视培养液和血清的质量; (5) 重视原始成纤维细胞的质量,没有原始成纤维细胞所有的胚胎干细胞将在7～10d 内分化或死亡,若原始成纤维细胞质量差,则不能有效地抑制胚胎干细胞的分化而导致培养增殖失败。总之,胚胎干细胞的分离与培养是极其复杂的实验室技术,目前的培养条件尚不能避免胚胎干细胞的分化,而且随着培养周期次数的增多,胚胎干细胞的稳定性也会下降。因此,如何改进培养条件和培养技术