植物转基因方法及特点和转基因沉默现象_崔广荣
植物转基因沉默的机制、对策
3．位臵效应
目前的转基因方法整合到基因组中的位臵是随机 的，因基因组中染色质的分布不均衡，外源基因 整合到目的基因组即染色体的物理位臵就直接决 定着外源基因的表达，这种情况称为位臵效应 （position effect）
（ 1 ）外源基因插入染色体中高度甲基化的区 域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基 因沉默。 （ 2 ）外源基因的碱基组成与整合区域的不同 而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录 使基因沉默，这两种情况都属于转录水平上调 控的转基因沉默。
RNAi 发现历程：
1990年，Napoli等将1个查尔酮合成酶基因（chs）置于1 个强启动子后导入矮牵牛，试图加深花朵的紫颜色。但
意想不到的事发生了：结果部分花的颜色并非期待中
的深紫色，而是花瓣形成了花斑状甚至白色，而且这种 性状可以遗传。
??
1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫(C.elegans)为消除线虫第 一次分裂的不对称性的研究中，利用反义RNA技术抑制par-1 的表达，同时也注入正义RNA（对照）。结果两种方法都抑 制par-1基因。 该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。
转基因植物的生产
抗除草剂作物
抗虫玉米
抗虫棉花
转查尔酮合成酶矮牵牛花
抗CMV病毒转基因番茄
抗CMV病毒转基因甜椒
bacterial speck disease(细菌斑点病）. Plant on left has been genetically engineered with a gene for resistance to the disease, and plant on right is a susceptible, nonengineered variety.
转基因沉默
• 主要观察转化子在添加相应抗生素或除草 剂培养基上的生长
• 抗的存活，不抗的死亡
1
NPTⅡ活性检测
• 目的 ：检测NPTⅡ基因在植物组织中的表达 • 原理： NPTⅡ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，
影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时 使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移， 生成放射性的卡那霉素来检测。 • 检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法 • NPTⅡ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放 射自显影
• 检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微 镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植 株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿 色荧光蛋白检和定位。
6
7
8
GFP在水稻原生质体中的瞬时表达结果
不含有OSPK1基因的 原生体pUC-GFP
含有OSPK1基因的原生 体pUC-OSPK1-GFP
转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色 荧光，而转化含有OSPK1基因质粒的原 生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上
9
3、转基因植物分子检测
• PCR • Southern blotting • Northern blotting • RT-PCR • QRT-PCR • Western blotting
荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG
4
组织化学染色定位法检测GUS
• 以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物 水解成蓝色物质，
5
gfp基因的检测
• 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光 素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内， 能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与 目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解 目的基因表达情况。
一文看透转基因
一文看透转基因01、揭开转基因技术迷雾杂交育种为何不能解决所有问题？在中国农业领域，杂交育种技术格外有名，通过几十年的努力，袁隆平、朱英国等科学家不断创出主粮亩产的新高，还打造出不少新品种，实现了主粮自给自足。
转基因技术看似并非必需之选。
生物育种是利用现代生物技术等方法创造遗传变异并培育生物新品种的过程。
卢宝荣介绍说，传统杂交育种本质上也属于“转基因”范畴，主要通过有性杂交方式，将基因从具有优异性状的供体植物转移到目标植物上，供体植物往往是科学家偶然找到的具备特殊本领的农家传统品种和野生近缘种，它们能抗虫、耐寒，或者富含某种营养成分。
但有性杂交方式比较耗时，效率较低，最大困难是难以逾越物种间的生殖隔离来转移优质基因。
科学家们曾有过一个梦想，希望将西红柿和马铃薯进行杂交，让植株长出又大又红的西红柿，地下还可长出特别大的马铃薯，但无法实现。
要想跨越物种之间的生殖隔离，从亲缘关系较远的物种上获得优质基因，就要用到转基因技术，它可以提供广阔的选择空间，使得农作物获得大量其他物种的优质基因。
福建省农业科学院水稻分子设计创新团队首席专家王锋研究员在转基因水稻研究领域工作了整整30年，这些年他在研发对抗草地贪夜蛾的转基因水稻品种。
“草地贪夜蛾是入侵物种，对玉米和水稻的危害严重，抗药能力很强，在水稻种质资源中，没有针对鳞翅目害虫的抗虫基因资源，不能通过杂交育种方式培育抗二化螟、草地贪夜蛾等的品种，最后的防守方法是转基因技术。
”王锋说。
早在1992年，转基因技术就曾临危受命。
当年棉铃虫肆虐，农药无法杀灭，也无抗虫能力的野生棉花品种可用于杂交，直接经济损失达到60多亿元。
“在束手无策之际，转基因抗虫棉花品种被投放到市场，在挽救产业过程中起到了关键作用。
”复旦大学生命科学学院卢大儒教授回忆道。
转基因技术潜在危害究竟在何方？食用转基因食品会造成各种疾病？前些年，关于转基因食品的安全问题被不断提及。
但在科学家眼中，这似乎缺乏科学依据。
【精品】植物转基因原理与技术
植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程.微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。
自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。
下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。
原理根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。
在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。
以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。
外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。
受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同,可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。
一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系.植物转基因流程图如下所示。
外植体）愈伤组织瞬时表达外源基因植物受体细胞原生质体生殖细胞稳定表达获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定(PCR，Southernblot，Northernblot，生理指标鉴定等)技术就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术,直接转化技术和种质转化技术。
下面分别叙述。
一载体转化技术载体转化技术是指通过农杆菌的Ti或Ri质粒,植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法.其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法.病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。
土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌.它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒.它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”—冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。
植物细胞转基因技术
适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株； 可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴定
时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快
捷； 转化速度较快，变异性状稳定较快； 方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。
01
03
02
缺点： 转化受体受植物花期的限制，同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。 在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。 操作的经验性很强,需要一定的技巧。 利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的 转基因植株。
10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界是 T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重
DNA
1
2
3
4
5
6
vir基因
Ti 质粒的 vir 区大小为30kb ,分 VirA 、B 、C 、D 、E 、G 、H 等7 个操纵子,一共有24 个 基因共同控制着 T -DNA 的加工和转移,它们总 称调控子。
4.化学物质诱导法
01
优点：
02
PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性
03
好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很
04
少产生。
缺点： 原生质体培养再生难度较大； 原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白 化苗，且由于 PEG法对原生质体活力有害，转化 率低。 应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡 椒等植物的转基因植株。
电击法
DNA 混合入电击缓冲液 幼苗
02
01
优点： 操作简便，可以一次转化许多原生质体，转化效
率较高，特别适于瞬间表达。
缺点： 有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。
植物转基因沉默与消除
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植物学通报
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作者简介： 崔欣， 作物遗传育种专业硕士研究生， 研究方向为植物转基因。导师杨庆凯， !PQR 年生， !P$P 年生，教 授， 博士生导师， 国家级有突出贡献的中青年专家， 国务院学位委员会作物学科评议组成员， 农业部教学指导委员 会作物学科组委员， 国家大豆工程中心副主任， 中国作物学会理事， 中国作物学会大豆专业委员会副理事长。主 省部级奖 " 项。出版了 R 部著 持了国家自然科学基金 S 项重点项目， " 项面上项目。荣获国家科技进步奖 S 项， 作， 发表大豆遗传育种等论文 "# 多篇。 收稿日期： 接受日期： 责任编辑： 刘 晖 S##!2!#2!" S##S2#S2SQ
转基因植物的方法
转基因植物的方法转基因植物是指通过人工手段将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物的方法主要包括以下几个步骤：1. 基因克隆基因克隆是指将所需的基因从外源生物中分离出来，并将其插入到载体DNA中。
载体DNA是一种能够自我复制的DNA分子，通常采用的载体有质粒、噬菌体等。
基因克隆的过程需要利用限制性内切酶切割DNA，将所需的基因与载体DNA连接起来，形成重组DNA分子。
2. 转化转化是指将重组DNA分子导入植物细胞中，使其成为植物细胞的一部分。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法。
农杆菌是一种能够感染植物的细菌，通过将重组DNA分子导入农杆菌中，再将农杆菌接种到植物体内，使其将重组DNA分子导入植物细胞中。
3. 选择选择是指通过筛选，将转化成功的植物细胞筛选出来。
为了使转化成功率更高，通常会在重组DNA分子中加入一些标记基因，如抗生素抗性基因等。
在转化后，将植物细胞培养在含有抗生素的培养基上，只有转化成功的细胞才能够生长下去，从而筛选出转化成功的植物细胞。
4. 培育培育是指将转化成功的植物细胞培养成完整的植物。
在培育过程中，需要对植物进行筛选和鉴定，以确保其具有所需的性状。
同时，还需要对植物进行基因检测，以确保其基因组稳定性和安全性。
转基因植物的方法虽然可以为人类提供更多的食品和药品，但也存在一定的风险。
因此，在进行转基因植物研究和开发时，需要严格遵守相关法律法规，确保其安全性和可控性。
同时，还需要加强对转基因植物的监管和管理，以保障公众的健康和安全。
植物转基因沉默的机制及克服方法
植物转基因沉默的机制及克服方法专业:植物学学号:220100905010 姓名:潘婷摘要:植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用,转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。
使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。
关键词:转基因沉默;外源基因;DNA甲基化;共抑制1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后,研究者对转基因沉默进行了许多深入探索,以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。
1 转基因沉默机制转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。
1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制1.1.1 甲基化作用从目前报道看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关,DNA甲基化都是从启动子区域开始的,主要发生在基因5’端启动子区域。
甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上,C碱基甲基化不是转基因沉默前提,但对维持基因沉默是必需的。
甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。
1.1.2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。
研究发现,转基因烟草中稳定表达的T-DNA至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻,并且位于端粒附近。
而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。
1.1.3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。
重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。
植物转基因技术和方法概述
植物转基因技术和方法概述高俊山1) 林毅1) 叶兴国2) 马传喜1) (1)安徽农业大学,合肥230036;2)中国农业科学院作物研究所)摘要 从技术原理和方法进展着手,综述了植物转基因的不同方法。
植物基因转化方法主要包括载体介导的转化和直接基因转移,着重阐述了植物转基因方法的机制以及各种方法的适用范围、应用实例和进展;比较了相互的优缺点。
相比之下,农杆菌介导方法具有明显优势。
关键词 植物转基因;载体介导法;直接导入法中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2003)05-0802-04Summ ary of the T echniques and M ethods of P lant G ene T ransform afionG ao Junsh an et al (Anhui Agricultural University,H efei230036)Abstract In the thesis,the different m easures of plant gene trans form ation were summ arized according to the techn ology principle and m eth od de2 velopm ent,especially in ex patiating the m echanism and applicable range of the m eth ods,providing s om e exam ples in application and developm ent, and its advantage and disadvantage.T he m eth ods of gene trans form ation m ainly included C arrier-M ediated trans form ation and direct gene trans fer, Agrobacterium-M trans form ation m eth od had m ore advantages than the other ones.K ey w ords Plant gene trans form ation,Direct gene trans fer,C arrier-M ediated trans form ation 早在20世纪70年代,人们就开始探索植物转基因研究。
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法组长：费京珂组员：王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯（北京化工大学，生命科学与技术学院）【摘要】近些年，随着植物基因工程的不断发展，转基因后的基因沉默现象也越来越受到人们的关注，为了使得转入的基因能够高效表达且起到相应的功能作用，我们就基因沉默的机制进行综述，并阐述对解决方法的最新研究。
【关键词】植物，基因沉默，转录沉默，转录后沉默，irna【正文】转基因植物中，基因沉默主要存在两种机制，转录中水平上基因沉默与转录后水平上的基因沉默。
涉及到DNA启动子甲基化，重复序列，同源序列一起的TGS等内容。
针对基因沉默的机制，经过查找资料，我们提出了相应的解决方法。
最后，我们要运用基因沉默的机理，进而使得转基因能更加高效。
一．转基因植物沉默机制【1】【2】【3】【4】【5】【6】为了极大的提高和完善在植物中通过导入外源基因使其获得新性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的,而大量转基因植株不能正常表达,通常并不是由于外源基因的缺失或突变引起,而是基因失活的结果,这种失活现象就是基因沉默。
转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后三个不同的层次上。
发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应(effect position),位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。
当导入的外源基因整合到宿主高度甲基化、转录活性低的异染色区域时，外源基因一般表现沉默。
位置效应引起的基因沉默不需要基因组中有同源序列,而同源依赖的基因沉默有转录水平上的基因沉默(Transcription-al gene silencing, TGS)和转录后水平上的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)两种形式。
转基因沉默的机制是多方面的,转基因的拷贝数、构型及在植物基因组上的结合位点等诸多因素都与沉默有关,外界环境条件如过高的温度、过强的光照也会增加沉默发生的几率。
以科学的视角揭开作物转基因的神秘面纱
以科学的视角揭开作物转基因的神秘面纱崔德周 李永波 樊庆琦 隋新霞 黄承彦 楚秀生（山东省农业科学院作物研究所/农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室，济南 250100）摘要：转基因技术是近现代农业史上发展最为迅猛的作物遗传改良技术。
1996年首例转基因作物开展商业化种植，截至2016年转基因作物种植面积已呈百倍增加。
人们从转基因作物的大面积推广应用中获得了巨大的经济效益与社会效益。
目前转基因在我国被“妖魔化”，甚至出现“谈转基因色变”的局面。
为使公众对转基因有科学全面的认识，对转基因的基本概念、国内外发展现状、安全性评价等内容进行了阐述，同时展望了转基因作物在我国产业化的发展趋势。
关键词：转基因；发展现状；安全评价当前世界人口已突破74亿，并且以每年近8000万的速度持续增长，2050年预计将达93亿。
为保证世界人口粮食的充分供给，粮食产量必须增加70%以上，这就要求全球的粮食总产持续增加。
然而，目前全球的粮食生产正面临一系列严峻的挑战：近20多年来，主要粮食作物单产增产潜力出现瓶颈，总产量徘徊不前；极端恶劣天气及作物病虫害频繁爆发，且有逐年加重势头；氮磷钾肥料过量施用导致土壤质地和水质富营养化日趋严重；人民物质生活水平的提高同对作物品质需求的矛盾，成为亟待解决的问题。
因此，提高农业产能以确保充足的粮食供给和原料来源具有十分重要的意义。
发展并推广转基因作物已成为缓解资源约束、保障粮食安全的重要举措。
不幸的是，由于知识的不对称性，公众对转基因缺乏科学的认识，致使转基因陷入了被过度“妖魔化”的局面。
为使读者对作物转基因有个科学、理性的认识，本文系统阐述了转基因的基本概念、发展现状、安全性评价等内容，并对未来的发展方向进行了展望。
1 转基因相关的基本概念1.1 基因 植物、动物和微生物等生命体都是由细胞构成的，细胞内有细胞核，细胞核中的染色体是由A、T、C、G共4种碱基组成的脱氧核糖核酸，称之为DNA。
植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
综上所述，基因沉默可能来源于转基因植株 体内的不同核酸之间的相互作用，即DNA— DNA、DNA—RNA、RNA—RNA的非正常配 对作用而导致基因核苷酸的甲基化作用和 mRNA的降解，从而引发基因沉默。基因沉默 可能是植物防御机制的一种自然现象——在 DNA或RNA水平上抵御外源DNA，就象植物 体内的对细菌、病毒的天然抗性一样[11]。这 一现象给转基因工作者提出了新的难题，它 已经成为转基因技术的严重障碍。它要求我 们不断去探索、改进植物转基因技术，做到 转基因定点、定量转化重要农作物，并得以 稳定、高效表达，从而加速转基因技术在农 业生产中的应用。
2．1 植物转录基因沉默（TGS） 植物转录基因沉默（TGS）
植物转录基因沉默的主要方式有两类：顺式失活和 反式失活。当一个或多拷贝基因整合进入或接近高 甲基化基因组序列时，转基因的顺式失活就可能发 生。这种现象与果蝇中的位置斑驳效应（position effect variegation）很相似[12]。植物中的甲基化可以 象果蝇中的异染色质一样进行传递，当甲基化传递 进转基因中时，就会导致基因沉默[19]。多拷贝基因 整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默， 这种现象又与果蝇中的由于转基因重复延伸而导致 的基因沉默现象类似，即所谓的重复诱导失活[5]。 有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引 起转录基因沉默[11]。总的来说甲基化（或超甲基化） 和染色质凝集（异染色质化）是与转录基因沉默相 关联的普遍特征[11]。
1．3 显微注射法、电击法及激光法 显微注射法、 显微注射法（microinjection）是用显微注射器 将遗传物质注射到培养细胞中，通过组织培 养最终获得转化植株。此项技术起初主要应 用于动物，八十年代中期开始应用于植物的 遗传转化。虽然该法具有DNA注射的准确性、 预见性、克服远源杂交的困难等优点，但其 又有工作效率低、表达不稳定等缺点，故其 应用受到了限制。自基因枪法诞生以来，这 种转化方法在植物上的应用走入了低谷[2]。
02-第5讲 转基因技术及其利用--PPT
转基因技术及其应用
瞿礼嘉 北京大学
转基因技术及其应用
转基因技术 转基因动物 转基因植物 转基因食品安全性讨论
1 转基因技术
动物转基因技术（以小鼠为例）
逆转录病毒载体法 用带有目标基因癿重组逆转录病毒侵染早期胚胎 （八细胞），然后把胚胎植入代孕母鼠。 优点：效率高。 缺点：基因长度有限制 (约8 kb)，病毒基因组整 合后转基因动物有可能产生病毒，一般丌用于商 品化转基因动物生产。
“溶酶体酸性脂肪酶缺乏”也是一种罕见癿遗 传病，脂肪积聚在肝等处可致婴儿死亡，老年 患者则肝肿大、纤维化、硬化以及心血管疾病。
美国FDA于2015年12月8日批准利用 转基因鸡 生产人癿重组sebelipase α治疗溶酶体酸性脂 肪酶缺乏，商品名Kanuma。
转基因牛生产人癿乳铁蛋白（荷兰）
花粉管通道法 授粉后向子房注射含目标基因癿DNA溶液，通过花粉 管通道，将外源DNA导入受精卵，整合到其基因组中， 受精卵发育而成为转基因新植株。
优点：简单，丌依赖组织培养技术。
2 转基因动物
基础研究
基因调控、肿瘤发育、免疫特异性、发 育癿分子遗传学、遗传病等。
建立人类疾病癿动物模型
1988年，美国哈佛医学院癿Philip Leder利用c-myc基因诱
2016年美国佛罗里达大学研究人员对酸橙进行基因 改良，最新培育一种紫色果肉癿柑橘。紫色果肉富含 花青素，有益于人体健康。 转基因酸橙癿研发直接促进了佛罗里达州癿橙子产业 发展，该州再也丌用从意大利进这一基础研究成果，成功获得“原癌小鼠” (oncomouse)。成熟癿原癌小鼠会得乳腺癌，为人类研发针 对乳腺癌癿药物提供了研究动物。原癌小鼠是第一个高等动 物癿与利 (美国与利号：4,736,866)，3年后他们癿“前列腺 小鼠” （prostate mice）又获得了第二个与利。
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法组长：费京珂组员：王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯（北京化工大学，生命科学与技术学院）【摘要】近些年，随着植物基因工程的不断发展，转基因后的基因沉默现象也越来越受到人们的关注，为了使得转入的基因能够高效表达且起到相应的功能作用，我们就基因沉默的机制进行综述，并阐述对解决方法的最新研究。
【关键词】植物，基因沉默，转录沉默，转录后沉默，irna【正文】转基因植物中，基因沉默主要存在两种机制，转录中水平上基因沉默与转录后水平上的基因沉默。
涉及到DNA启动子甲基化，重复序列，同源序列一起的TGS等内容。
针对基因沉默的机制，经过查找资料，我们提出了相应的解决方法。
最后，我们要运用基因沉默的机理，进而使得转基因能更加高效。
一．转基因植物沉默机制【1】【2】【3】【4】【5】【6】为了极大的提高和完善在植物中通过导入外源基因使其获得新性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的,而大量转基因植株不能正常表达,通常并不是由于外源基因的缺失或突变引起,而是基因失活的结果,这种失活现象就是基因沉默。
转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后三个不同的层次上。
发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应(effect position),位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。
当导入的外源基因整合到宿主高度甲基化、转录活性低的异染色区域时，外源基因一般表现沉默。
位置效应引起的基因沉默不需要基因组中有同源序列,而同源依赖的基因沉默有转录水平上的基因沉默(Transcription-al gene silencing, TGS)和转录后水平上的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)两种形式。
转基因沉默的机制是多方面的,转基因的拷贝数、构型及在植物基因组上的结合位点等诸多因素都与沉默有关,外界环境条件如过高的温度、过强的光照也会增加沉默发生的几率。
转基因方法
转基因方法一、基因枪法：1、综述：基因枪法又称为高速微弹法、微粒抢法、微粒轰击法，是由康奈尔大学的Sanford等于1987年首次研制出的火药引爆基因枪，并与该校工程技术专家Wolf及Kallen合作研究出的一种基因转移的新方法。
1990年美国杜邦公司推出商品基因枪PDS-1000系统。
在此期间，高压放电、压缩气体驱动等各种基因枪相继出现，并都在重复的实践中得到改进和发展。
其改进的核心是粒子加速系统，以提高射弹的可控度，即粒子速度和射入的浓度等。
2、基本原理：其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。
微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。
根据基因枪的动力系统，可将它们分为三种类型：一类是以火药爆炸力为加速动力，其显著特征是塑料子弹和阻挡板。
塑料子弹前端载放已沉淀有DNA的钨金粉。
当火药爆炸时，塑料子弹带着钨金粉向下高速运动，至阻挡板时，塑料子弹被阻遏，而其前端的钨金粉粒子继续以高速向下运动，击中样品室的靶细胞。
其粒子的速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制，不能做到无级调整，可控度较低。
第二类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等。
其工作原理是把载有DNA的钨金粉喷洒在一张微粒载片上，电极间悬滴众着微水滴。
在压缩空气的冲击下，微水滴雾状喷射，驱动载片。
当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨金粒继续向下冲击射入细胞。
第三类是以高压放电为驱动力。
其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度及射入浓度可准确控制，使载有DNA的钨金粉粒子能到达具有再生能力的细胞层。
3、步骤：（1）微粒体的洗涤。
取60-100mg钨或金粉，溶于1ml无水乙醇中，用超声波振荡洗涤。
微粒体处理后可在密闭条件下室温贮存一周。
离心除去乙醇，密闭贮存于室温中，备用，保存时间不要超过一周。
（2）DNA微粒载体的制备。
（3）靶外植体材料准备。
植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
植物转基因方法及特点和转基因沉默现象
崔广荣
【期刊名称】《安徽科技学院学报》
【年(卷),期】2003(017)001
【摘要】本文概述和比较了植物转基因方法、特点和在转基因中出现的基因沉默现象及其机制.
【总页数】5页(P37-41)
【作者】崔广荣
【作者单位】安徽技术师范学院农学系,安徽,凤阳,233100
【正文语种】中文
【中图分类】Q943.2
【相关文献】
1.植物基因的克隆与转化（3）转基因植物中报告基因的检测方法 [J], 李成云
2.植物转基因沉默现象的发生机制 [J], 翟敏;魏华丽
3.转基因植物转录后基因沉默的特点、机理及应用 [J], 卢龙斗;常青;等
4.转基因植物成分检测方法及标准概述 [J], 刘岑杰;杨滴
5.转基因植物油中提取DNA的多种提取方法 [J], 邓家超
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转基因植物技术的鉴定ppt课件
组员：魏翠芳、杨帆、甘小东、孙圆圆、 王翠华、张辉、曹盼、王凯、罗青帮 田晓瑞、马小莉、王亚平、袁源
转基因技术
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组 中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的 可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术 （Transgene technology）。
方法成熟可靠，简便易行， 限制了该法在禾谷类作物
周期短，转化率高；
中的应用。
转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞
DNA直接转化法
（1）基因枪转化法 （2） 电击法 （3） PEG介导基 因转化法
（4）花粉管通道法
无宿主限制，适用于各种单、 转化效率低，需要专门设
双子叶植物，操作简单
其它报告基因
荧光素酶（LUC）基因 二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 抗除草剂Basta（bar）基因 胭脂碱、章鱼碱基因 新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）基因 潮霉素磷酸转移酶（HPT）
杂交鉴定
外源基因整合的 Southern 杂交鉴定
外源基因转录的 Northern杂交检测
花粉管通道法是利用 开花植物授粉后形成的 花粉管通道,直接将外 源目的基因导入尚不具 备正常细胞壁的卵、合 子或早期胚胎细胞,实 现目的基因转化.
PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇 (PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高 pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分 子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,
技术路线 目的基因分离 植物表达载体的构建
受体材料的准备
遗传转化 转化组织
炼苗
转化植株筛选 组织脱分化
1.目的基因的分离
（1）已知基因的获得
引起基因沉默的原因
引起基因沉默的原因研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关,外界环境如过高的温度、过强的光照也会增加基因沉默发生的几率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本年龄)的影响。
因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的,而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环境因素协同作用的产物。
转基因沉默可以发生在染色体DNA水平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。
1.染色体DNA水平的转基因沉默发生在染色体DNA水平的转基因沉默叫做位置效应(positioneffect)。
当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转录。
按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合,使两个MAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环(1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独立的表达调控单位而存在。
MAR可能使转基因在受体基因组整合后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差异2.转录水平的基因沉默发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。
反向重复的基因或转基因可以进行异位配对,配对的DNA作为信号,使DNA异染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。
此外,DNA-RNA协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原因之一。
（1）转移基因及其启动子甲基化甲基化是活细胞中最常见的一种DNA其价修饰形式,它通常发生在DNA的GC和CN G序列的C碱基上,C甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。
甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。
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2 转基因植物中的基因沉默现象 如前所述, 植物转基因技术在基础和应用研
究中都 展示了巨大的 潜力。但是近 年来人们发 现, 几乎在所有的转基因方法得到的转基因植株 中, 都有外源基因在整合进基因组后出现基因沉 默( gene silence) 现象[ 11] , 转基因在受体植株中的 表达水平很不稳定。这已经成为植物遗传转化技 术应用于基础和应用研究的严重障碍。因此, 研 究外源基因沉默的分 子机理及其相 应的解决方 法, 已经成为当代分子生物 学研究的一个热点。 目前对转基因植物中的基因沉默现象已经有了较 为深入的研究, 但对其分子机理的理解及相应的 控制手段还很有限。
基因 枪法( particle gun bombardment ; microprojectile bombart ment ; biolist ics) 是 1987 年由美 国康奈尔大学的 Sanford 提出的一种直接基因导 入法, 它避开了原生质体再生植株培养的困难和 当时人们认为的所谓的农杆菌的宿主限制问题。 这种方法是借高速运动的金属粒将附着于其表面 的核酸分子引入受体细胞, 然后通过组织培养再 生出完整植株。由于基因枪法导入外源基因的技 术本质上是一种物理过程, 因此它具有不用原生 质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限 制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因 植株变异 率低、通常具 有正常的育性 等优点[ 1] 。 特别是在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的 应用。但是基因枪法也有自身的缺点: 转化效率 不高, 大多在 0. 1~ 1. 0% 的范围内, 难以选择; 外 源基因序列常是多拷贝插入, 从而导致基因沉默; 转入的基因有时是呈非孟德尔遗传; 费用较高 等[ 4] 。 1. 2 PEG 法
自 1983 年利用农杆菌转化获得首例转基因 烟草以来, 农杆菌介导的基因转化重要环节已形 成了相当成熟的实验流程, 在油料、糖料、纤维、花
17 卷第 1 期
崔广荣, 植物转基因方法及特点和转基 因沉默现象
39
卉、果树、蔬菜、林木、谷类等植物中均获得了转基
因植株。据统计至今获得的 转基因植株中 80% 以上是农杆菌介导 转化法获得的[ 2] 。农杆菌转 化的具体操作方法也多种多样, 如直接感染植物 伤口法、叶盘法、原生质体共培养法、真空容器中 浸染完整植株[ 14] 、愈伤组织共培养等。由于单子
转基因植株表型
转移 DNA 片段大小
农杆菌法
PEG 法
原生质体组织 细胞完整植物
原生质体
有
无
有或无、较简单 复杂
较高
低
简单
简单
简单
简单
单拷贝较多 复杂
单位点多
多位点
稳定
不稳定
较清楚
不清楚
较少
较多
表型单一 较稳定
表型丰富 不稳定
较大
较小
电击法
原生质体
无 复杂 低 复杂 复杂昂贵 复杂 多位点 不稳定 不清楚 较多 表型丰富 不稳定 较小
38
安 徽技术师范学院学报
2003 年
PEG 法是一 种通过化 学物质 P EG ( 聚 乙二 醇) 处理去壁的原生质体作为转化受体, 改变细胞 膜的通透性而使原生质体获得转化。Krens 等首 次通过此法在烟草中获得成功。此后许多人在双
子叶和单子叶植物如烟草、矮牵牛、水稻、玉米等
作物上都获得了成功。由于 PEG 法具有实验成 本低廉、结果也较稳定、重复性好、无需特殊的仪 器设备等特点, 因而在发明起初也成为应用较为 广泛的方法。但是此法具有明显的缺点: 原生质 体培养再生难度较大; 受基因型限制; 原生质体再 生培养的转化植株变异率高, 易产生白化苗; 转化 率低[ 4] 。
关键词: 植物转基因; 基因沉默 中图分类号: Q943. 2 文献标识码: A 文章编号: 1007- 3302( 2003) 01- 0037- 05
自从 1983 年第一个转基因植株问世以来, 植 物转基因技术日益得到广泛的应用, 已经成为植 物生物技术的核心 工具之一[ 4] 。它对 于分子生 物学、分子遗传学等基础研究和植物的遗传改良 都具有特别重要意义。如今世界上许多国家都投 入了大量的人力和物力进行植物转基因方面的研 究, 中国也于 1999 年设立了植物转基因及应用专 项基金。据 Janes 的统 计资料, 1986~ 1997 年间 已有 45 个国家在 60 多种作物上进行了近 25000 例转基因植物的田间试验[ 13] 。到 1997 年底, 全 球已有 12 种作物的 48 种转基因作物产品获准进 行商品化生产, 据估计全球范围内转基因产品的 市场销售额将由 1986 年的不足 5 亿美元增加到 2000 年的 20~ 30 亿美元; 2010 年将增加到 200 亿美元[ 13] 。在植物遗传改良应用上, 与传统育种 手段相比, 转基因技术有其自身独到之处: 它不仅 可以缩短育种年限, 加快育种进程, 而且可以打破 种间基因交流的界限, 广泛利用植物、微生物、甚 至动物的基因来使植物获得抗病性、抗虫性、抗逆 性、提高产量、改善品质、人工创造雄性不育系、制 造植物反应器等[ 3] 。 1 植物的遗传转化方法及特点
件下, 细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔, 为外 源物质提供了通道, 借此导入 DNA 等遗传物质, 达到转化的目的。激光法同电击法类似, 一定波 长的激光聚焦后直径达 0. 3~ 0. 5 微米时, 高能量 的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔, 短时间内 又可自动 修复, 因 而可利用激光 束将外源 DNA 导入到细胞中。Weber 等利用此法将荧光素酶基 因导入油菜叶绿体中, T oper 转化烟草、中国的傅 荣昭等转化小麦均 获得成功[ 2] 。激光 法和电击 法均可用于双子叶和单子叶植物, 转化受体材料 广泛。但这种方法的效率低是显而易见的, 使用 范围小, 存在问题较多, 发展缓慢。 1. 4 花粉管通道法
本科 粮 食作 物的 遗 传转 化 方面 还 存在 许 多局 限[ 18] 。
由上所述, 各种基因转化方法都有自己的优 点又有自己的不足, 列表 1 比较如下。
表 1 常见植物转化方法 特点比较
受体材料
有无寄主范围 培养条件 转化率 操作程序 设备要求 目的基因拷贝数 目的基因插入位点 稳定性 基因整合机制 基因沉默
1. 3 显微注射法、电击法及激光法 显微注射法( microinject ion) 是用显微注射器
将遗传物质注射到培养细胞中, 通过组织培养最 终获得 转化植株。此 项技术起初主 要应用于动
物, 八十年代中期开始应用 于植物的遗传转化。 虽然该法具有 DNA 注射的准确性、预见性、克服 远源杂交的困难等优点, 但其又有工作效率低、表 达不稳定等缺点, 故其应用受到了限制。自基因 枪法诞生以来, 这种转化方法在植物上的应用走 入了低谷[ 2] 。电击法( elect roporat ion) 是八十年代 初发展起来的一种转化技术, 首先在原生质体上 运用此法将 CAT 基因( 氯霉素乙酰转移酶基因) 转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并 得以表达[ 2] 。此法的主 要原理是在高 压脉冲条
植物基因工程研究中的关键步骤之一是通过 特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内, 使
收稿日期: 2002- 11- 30 崔广荣: 男, 1965 年出生, 讲师, 硕士, 农学专业
之发生定向的、永久性的遗传变异, 即所谓的植物 遗传 转化 ( genet ic t ransf orm at ion) 。为 了方 便有 效地将外源基因导入植物体内, 人们不断地探索、 发展新的植物遗传转化方法。目前发展较为成熟 的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、P EG 法、花粉管通道法、微注射法、激光法等, 其中基因 枪法和农杆菌介导法是最为有效的两种方法。 1. 1 基因枪法
农杆菌是一种革兰氏染色阴性菌, 普遍存在 于双子叶植物中。农杆菌属共分为四个种, 即根 癌农杆菌、毛根农杆菌、放射性农杆菌、和旋钩子 农杆菌。目前研究较多的是根癌农杆菌( agrobact erium tumef aciens AT ) 和 毛 根农 杆菌 ( agrobact erium rhizogenes AR) , 它们 都可以 浸染植 物细 胞, 但引起不同的病症, 根癌农杆菌常引起植物近 地面的根茎交界处形成帽状的肿瘤。科学家们经 过长期的研究发现, 农杆菌中存在一种环状的、大 小约 150 ~ 200kb 的 质 粒 ( tumor- inducing plasm id, 简称为 T i 质粒) , 植物肿瘤即是有 T i 质粒上 的一段 DNA 引起的, 它通过特定的机制复制、切 割、转移、整合到植物基因组中并表达, 从而引起 肿瘤的发生, 这段 DNA 称为 T - DNA( t ransferred DNA) , 是一种天然存 在的遗传转化体 系。人们 利用这种遗传转化体 系将外源基因 导入植物细 胞, 并利用植物细胞的全能性, 通过组织培养, 由 一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株, 此即农杆菌介导的遗传转化( agrobacterium- med-i ated transfermat ion) [ 18] 。农杆菌 T i 质粒 的 T DNA 中带有 Onc 基因( 致癌基因) , 它在植物细胞 内编码植物生长素和细胞分裂素, 使受浸染的植 物细胞不受 限制地增殖而致瘤。此外 T - DNA 还编码 Opine 类化合物, 作为农杆菌代谢的氮源 和碳源。T i 上的 T- DNA 是由两端两个不完整的 25 个碱 基对的 顺向 重复序 列所界 定, 由 于 T DNA 不含编码促使自身转移物质的基因, 故可将 其上的 Onc 基因及其它不必要的序列去掉, 而插 入要转化的目的基因序列, 从而达到既不致使植 物致瘤而又能改良植物的目的[ 18] 。
花粉管通道法( pollen- t ube pat hw ay) 又称子 房注射法( overy inject ion) , 是将外源 DNA 注入到 子房中轴的胎座位置, 经形成的花粉管胚囊, 转化