转基因沉默

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• GUS • GFP • LUC
2、报告基因检测
ß-葡萄糖苷酸酶基因 绿色荧光蛋白基因 荧光酶素基因
产生蓝色物质 产生绿色荧光 发射光子
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gus基因的检测
• gus基因编码 ß-葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，
能催化许多ß-葡萄糖苷酯类物质的水解。 • 检测常用底物有3种：
5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 4-甲基伞形酮酰- ß-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 对硝基苯-ß-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG） • 检测方法：组织化学染色定位法X-Gluc
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PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
• 转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞 总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称 Northern杂交。它是 RNA-DNA异质双链杂交。
• 步骤同Southern杂交法 • mRNA水平
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RT-PCR
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RT-PCR
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外源基因表达蛋白的检测
• 外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正 常表达并表现出应有的功能是植物基因转 化的最终目的。表达蛋白应具有一定的稳 定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同 时应对植物细胞无毒性。
荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG
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组织化学染色定位法检测GUS
• 以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物 水解成蓝色物质，
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gfp基因的检测
• 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光 素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内， 能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与 目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解 目的基因表达情况。
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PCR
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Southern鉴定
• Southern杂交技术是1975年发明 • 原理：利用两条单链DNA的碱基互补性，
来检测外源DNA的转化结果 • DNA水平
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外源基因转录的Northern检测
• 通过Southern杂交可以得知外源基因是否整合到 植物染色体上。但是，整合到染色体上的外源基 因并不一定表达。
• 检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微 镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植 株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿 色荧光蛋白检测和定位。
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GFP在水稻原生质体中的瞬时表达结果
不含有OSPK1基因的 原生体pUC-GFP
含有OSPK1基因的原生 体pUC-OSPK1-GFP
• 转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的，外源DNA可以 插入任何一条染色体，也可以插入一条染色体上的任何位点， 但对转录活跃区具有优先插入特性。
– 染色体的选择、染色体上的整合位点、一个基因组中发生的整合事 件次数、一条染色体上发生的整合事件次数、一个整合位点的拷贝 数
• 规律性：外源DNA的整合较多发生在DNA同源序列区、植物 DNA的高度重复序列区。
• 蛋白质区带-----抗体（同位素标记） • 蛋白质水平
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4、生物学鉴定及代谢测定
• 表型鉴定 • 稳定性鉴定 • 最终鉴定
• 抗病 • 抗虫 • 抗除草剂 • 花色改变 • 品质改良
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甜菜碱醛脱氢酶 （AhBADH）转枳 及其抗盐性研究
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AhBADH基因转枳及植株再生
30 days
60 days
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转基因整合的遗传效应
• 位置效应(position effect)： • 重组效应(recombination effect) • 转基因沉默(transgene silencing) • 表达多样性(diverse expression)。
1、选择基因检测
• 主要观察转化子在添加相应抗生素或除草 剂培养基上的生长
• 抗的存活，不抗的死亡
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NPTⅡ活性检测
• 目的 ：检测NPTⅡ基因在植物组织中的表达 • 原理： NPTⅡ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，
影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时 使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移， 生成放射性的卡那霉素来检测。 • 检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法 • NPTⅡ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放 射自显影
转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色 荧光，而转化含有OSPK1基因质粒的原 生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上
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3、转基因植物分子检测
• PCR • Southern blotting • Northern blotting • RT-PCR • QRT-PCR • Western blotting
90 days
120 days
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Hale Waihona Puke Baidu
转基因植株分子鉴定
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转基因株系GB含量
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200 mM NaCl处理
The transgenic plants were more tolerant to salt stress than the WT
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Na+、Cl-、K+ 含量
WT #48 #51 #133
• 外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原 理，ELISA及Western杂交是经典的方法。
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Western杂交
• 是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS 聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上， 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是 根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特 异抗体相结合的原理而进行的。
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Na+、Cl-、K+ 含量
The transgenic plants accumulate lower levels of Na+ and Cl-, but they had higher K+ under salt conditions.
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第五节
遗传转化问题及新技术
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1、转基因整合
• 转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制过 程整合到核基因组中。