转基因沉默
植物转基因沉默的机制、对策
3．位臵效应
目前的转基因方法整合到基因组中的位臵是随机 的，因基因组中染色质的分布不均衡，外源基因 整合到目的基因组即染色体的物理位臵就直接决 定着外源基因的表达，这种情况称为位臵效应 （position effect）
（ 1 ）外源基因插入染色体中高度甲基化的区 域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基 因沉默。 （ 2 ）外源基因的碱基组成与整合区域的不同 而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录 使基因沉默，这两种情况都属于转录水平上调 控的转基因沉默。
RNAi 发现历程：
1990年，Napoli等将1个查尔酮合成酶基因（chs）置于1 个强启动子后导入矮牵牛，试图加深花朵的紫颜色。但
意想不到的事发生了：结果部分花的颜色并非期待中
的深紫色，而是花瓣形成了花斑状甚至白色，而且这种 性状可以遗传。
??
1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫(C.elegans)为消除线虫第 一次分裂的不对称性的研究中，利用反义RNA技术抑制par-1 的表达，同时也注入正义RNA（对照）。结果两种方法都抑 制par-1基因。 该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。
转基因植物的生产
抗除草剂作物
抗虫玉米
抗虫棉花
转查尔酮合成酶矮牵牛花
抗CMV病毒转基因番茄
抗CMV病毒转基因甜椒
bacterial speck disease(细菌斑点病）. Plant on left has been genetically engineered with a gene for resistance to the disease, and plant on right is a susceptible, nonengineered variety.
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一摘要：本篇论文探讨了转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默现象的相关研究。
首先，介绍了转基因阿尔巴斯白绒山羊的背景及其在畜牧业中的重要性。
其次，详细描述了外源基因沉默的机制及其在转基因动物中的影响。
最后，通过实验数据和结果分析，探讨了外源基因沉默的潜在原因和解决方法，为转基因动物的研究提供了新的思路。
一、引言随着生物技术的不断发展，转基因动物在畜牧业中的应用越来越广泛。
阿尔巴斯白绒山羊作为一种重要的经济动物，其转基因技术的研究具有重要意义。
然而，在转基因阿尔巴斯白绒山羊的研究中，外源基因沉默现象屡见不鲜，严重影响了转基因动物的表达效率和经济效益。
因此，研究外源基因沉默的机制及其影响因素，对于提高转基因动物的表达效率和推动畜牧业的发展具有重要意义。
二、转基因阿尔巴斯白绒山羊的背景及重要性阿尔巴斯白绒山羊是一种优质的绒毛动物，具有生长快、产绒量高等特点。
随着人们对高品质绒毛的需求不断增加，阿尔巴斯白绒山羊的养殖业得到了快速发展。
然而，传统的养殖方式已经无法满足人们对高品质绒毛的需求。
因此，通过转基因技术改良阿尔巴斯白绒山羊的品种，提高其产绒量和品质，成为了当前的研究热点。
三、外源基因沉默的机制及其在转基因动物中的影响外源基因沉默是指外源基因在转基因动物体内无法正常表达或表达水平较低的现象。
这种现象可能是由于基因插入位置效应、甲基化、染色体结构改变等多种因素导致。
外源基因沉默不仅会影响转基因动物的表达效率，还会对动物的生长发育和健康产生不良影响。
因此，研究外源基因沉默的机制及其影响因素，对于提高转基因动物的表达效率和安全性具有重要意义。
四、实验数据和结果分析为了研究外源基因沉默的机制及其影响因素，我们进行了以下实验：首先，我们构建了含有不同启动子的外源基因表达载体，并将其导入阿尔巴斯白绒山羊的受精卵中。
然后，我们观察了不同转基因个体中外源基因的表达情况，并分析了影响外源基因表达的因素。
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，转基因技术已广泛应用于农业、医药和畜牧业等多个领域。
其中，转基因动物的研究为畜牧业的改良和疾病防控提供了新的途径。
阿尔巴斯白绒山羊作为我国特有的优良品种，其产绒量高、绒质优良，具有极高的经济价值。
近年来，通过转基因技术改良阿尔巴斯白绒山羊的品种特性已成为研究的热点。
然而，外源基因在转基因动物中的沉默现象一直是制约转基因动物研究的重要问题。
因此，研究转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默的机制及其影响因素，对于提高转基因动物的表达效率和改良动物品种具有重要意义。
二、研究背景及意义转基因阿尔巴斯白绒山羊的研究旨在通过导入外源基因，提高其产绒量、抗病性等经济性状。
然而，外源基因在转基因动物中往往会出现沉默现象，导致表达效率低下，甚至无法表达。
因此，研究外源基因沉默的机制及影响因素，对于提高转基因动物的表达效率和改良动物品种具有重要意义。
三、研究方法本研究采用分子生物学、遗传学和生物信息学等方法，对转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默现象进行深入研究。
首先，通过构建转基因阿尔巴斯白绒山羊的基因组文库和表达谱分析，筛选出外源基因沉默相关的关键基因和序列。
其次，利用生物信息学方法分析关键基因和序列的功能及与外源基因沉默的关系。
最后，通过遗传学和分子生物学手段，验证关键基因和序列与外源基因沉默的关联性。
四、实验结果与分析1. 外源基因沉默现象观察通过对比转基因阿尔巴斯白绒山羊与野生型山羊的外源基因表达情况，发现外源基因在转基因动物中存在不同程度的沉默现象。
2. 关键基因和序列筛选通过构建转基因阿尔巴斯白绒山羊的基因组文库和表达谱分析，筛选出与外源基因沉默相关的关键基因和序列。
这些关键基因和序列主要涉及基因表达调控、DNA甲基化、组蛋白修饰等方面。
3. 关键基因和序列功能分析利用生物信息学方法分析关键基因和序列的功能，发现这些基因和序列参与了转录水平、转录后水平及表观遗传水平的调控，可能对外源基因的沉默产生重要影响。
植物抗病毒的可能机制-基因沉默
植物抗病毒的可能机制——基因沉默植物抗病性是植物抵抗病原物侵染的性能。
1986年有人首次将烟草花叶病毒(TMV，下称)的衣壳蛋白(CP，下称)基因导人烟草获得了抗TMV转基因植株后，很多学者开展了转基因抗病毒的研究。
1990年Carylon等人首先报道了转基因沉默(Transgene silencing)现象。
基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。
它发生在两种水平上，1种是转录水平上的基因沉默，另1种是转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing．PTGS．下称)。
转录后水平基因沉默在植物表现型上称为共抑制，是指在外源基因沉默的同时，与其同源的内源基因的表达也受到抑制的现象。
Carylon为加深花色将查尔酮合成酶基因(ehalcone synthase，CHS)转到紫花矮牵牛中，发现42％的转基因植株中不仅花色未加深，反而变为白色或紫白相间，这种转入的外源基因和内源基因共同沉默的现象就是转基因沉默。
目前认为．植物基因沉默是植物长期进化形成的用来防止外来遗传物质干扰自身基因组功能和保持稳定性的重要机制，是生物体中1种不完全的原始的生物免疫系统。
本文将从基因沉默的角度介绍植物抗病毒的可能机制。
1 RNA介导的病毒抗性和PTGS近20年来，植物抗病毒基因工程的研究逐步深入。
在CP基因介导的抗性研究中，对CP基因进行改造，插入翻译终止密码子或去掉翻译起始密码子，使其不能翻译产生CP蛋白，结果也能获得高抗病甚至免疫的转基因植株。
这种病原来源的抗性称之为RNA介导的病毒抗性(RNA mediated virus re— sistance，RMVR．下称)。
RMVR与PTGS机制类似。
两者均发生在胞质中。
PTGS与RMVR两种现象具有许多共同特征，如序列特异性、与转基因的拷贝数有关，减数分裂后沉默保持的不可预见性(George，1998)，所以RMVR也是1种PTGS。
植物转基因沉默与消除
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植物学通报
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作者简介： 崔欣， 作物遗传育种专业硕士研究生， 研究方向为植物转基因。导师杨庆凯， !PQR 年生， !P$P 年生，教 授， 博士生导师， 国家级有突出贡献的中青年专家， 国务院学位委员会作物学科评议组成员， 农业部教学指导委员 会作物学科组委员， 国家大豆工程中心副主任， 中国作物学会理事， 中国作物学会大豆专业委员会副理事长。主 省部级奖 " 项。出版了 R 部著 持了国家自然科学基金 S 项重点项目， " 项面上项目。荣获国家科技进步奖 S 项， 作， 发表大豆遗传育种等论文 "# 多篇。 收稿日期： 接受日期： 责任编辑： 刘 晖 S##!2!#2!" S##S2#S2SQ
植物转基因沉默的机制及克服方法
植物转基因沉默的机制及克服方法专业:植物学学号:220100905010 姓名:潘婷摘要:植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用,转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。
使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。
关键词:转基因沉默;外源基因;DNA甲基化;共抑制1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后,研究者对转基因沉默进行了许多深入探索,以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。
1 转基因沉默机制转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。
1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制1.1.1 甲基化作用从目前报道看,几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关,DNA甲基化都是从启动子区域开始的,主要发生在基因5’端启动子区域。
甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上,C碱基甲基化不是转基因沉默前提,但对维持基因沉默是必需的。
甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。
1.1.2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。
研究发现,转基因烟草中稳定表达的T-DNA至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻,并且位于端粒附近。
而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。
1.1.3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。
重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。
“基因表达的调控——转基因沉默”复习教学设计
“基因表达的调控——转基因沉默#复习教学设计金莉1吴春萍2（1北京市古城中学北京100043；2北京市京源学校北京100040）摘要本节课利用真实的科学研究案例创设情境进行教学，以深色紫花矮牵牛和浅色紫花矮牵牛的培育为主线，引导学生发现和了解转基因沉默现象、基因沉默现象,加深对“基因表达的调控”的认识，并让学生在不断应用已学知识解决实际问题的过程中提升探究能力、发展科学思维,进一步树立稳态与平衡观、进化与适应观。
关键词基因表达的调控转基因沉默情境教学高三复习课高中生物学1教材分析及设计思路“基因的表达”揭示了基因是如何行使功能控制性状的，是“遗传与进化”模块的核心知识,也是学生学习“基因工程”“蛋白质工程”“分子杂交技术”等内容的知识基础。
本节课是“基因的表达”一轮复习第2课时。
前一课时教师引导学生梳理了基因表达的基础知识% 本课时教师意图通过创设情境，让学生应用基因表达的基础知识解决实际问题，提升他们的问题解决能力。
笔者在搜索文献资料时发现了两篇文献'T,这两篇文献中研究者分别利用转基因技术培育深色紫花矮牵牛和浅色紫花矮牵牛，与基因表达知识关系紧密，同时两个研究案例的逻辑性很强并且符合高三学生的认知水平，是不可多得的好素材。
于是笔者利用这两篇文献进行教学设计%先引导学生应用转基因技术培育深色紫花矮牵牛,以与预期不符的实验结果激发学生一步步探究发现“转基因沉默”现象,在学生了解了“转基因沉默”和“基因沉默”现象后，再引导学生利用“基因沉默”原理培育浅色紫花矮牵牛，培养学生的问题解决能力、探究能力,发展学生的科学思维。
2教学目标基于课程标准的内容要求、学业要求和学业质量标准，并围绕培养学生核心素养的要求,制订了如下教学目标：（1）通过认识基因表达过程中复杂精密的调控有利于系统维持稳态，进一步形成稳态与平衡、进化与适应相统一的生命观念。
（2）通过探究转基因紫花矮牵牛没有变得更紫的原因，发展科学思维。
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一一、引言近年来，转基因技术已成为生物科学领域的重要研究手段。
其中，转基因动物的研究更是备受关注。
阿尔巴斯白绒山羊作为一种重要的经济动物，其毛绒品质的改良对于畜牧业的发展具有重要意义。
然而，外源基因在转基因动物中的表达稳定性问题一直是研究的热点和难点。
因此，本研究旨在探讨转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默的相关因素及机制。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料包括转基因阿尔巴斯白绒山羊的基因组DNA、mRNA以及相关实验试剂和仪器。
2. 方法（1）基因组DNA提取及外源基因鉴定：采用常规的基因组DNA提取方法，对转基因阿尔巴斯白绒山羊的基因组DNA进行提取，并通过PCR等分子生物学技术对外源基因进行鉴定。
（2）mRNA提取及表达分析：采用Trizol法提取转基因阿尔巴斯白绒山羊的mRNA，通过实时荧光定量PCR等技术分析外源基因在mRNA水平的表达情况。
（3）外源基因沉默机制研究：通过生物信息学分析、染色体免疫共沉淀等技术，研究外源基因沉默的相关因素及机制。
三、实验结果1. 外源基因鉴定及表达分析通过PCR等分子生物学技术，成功鉴定出转基因阿尔巴斯白绒山羊中的外源基因。
实时荧光定量PCR结果显示，外源基因在转基因山羊中的表达水平存在显著差异，部分个体中外源基因表达量较低或甚至出现沉默现象。
2. 外源基因沉默相关因素分析通过生物信息学分析，我们发现外源基因的沉默与基因序列、启动子活性、染色体环境等因素有关。
进一步研究发现，外源基因的整合位置、拷贝数、甲基化程度等也与外源基因的沉默密切相关。
3. 外源基因沉默机制研究通过染色体免疫共沉淀等技术，我们发现外源基因沉默可能与染色体上某些特定蛋白的结合有关。
进一步研究表明，这些蛋白可能通过影响外源基因的转录、翻译等过程，从而导致外源基因的沉默。
四、讨论本研究发现，转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因的沉默与多种因素有关，包括基因序列、启动子活性、染色体环境、整合位置、拷贝数、甲基化程度以及与特定蛋白的结合等。
转录后基因沉默及其在植物中的应用
。非洲木薯花叶病毒 （ 8%(C ）
水稻黄化斑驳病毒 （ ,-(C） 的 4) 蛋白 的 8%" 蛋白， 和番茄丛矮病毒 （ +I*C ） 的 ?JKL 蛋白， 豇豆花叶病 毒 （ %4(C ） 等也能使植株内已发生的 4+5* 受到抑 制。不同植物病毒对 4+5* 的抑制作用在空间模式 和程度上存在着很大差异。 8%(C 对 4+5* 的抑制 发生在受侵染植株的老叶和新生叶上， %(C 只在新 生叶上对 4+5* 产生抑制作用， +I*C 的抑制作用则 只发生在新生叶的叶脉内。 万 方数据 可见， 4+5* 及其抑制可能是病毒与寄主植物相
0 0 利用反义 +12 能对基因表达进行调控的特点， 使其与靶 设计出一段与靶 +12 互补的 +12 片段， +12 碱基配对， 以抑制与疾病发生直接相关的基因
［ A］ 同样的病毒再次感染产生抗性 。如用 5/4 9,78
的马铃薯 B 病毒 （ 4CB） 感染 5/4 转基因植物后， 编 码 5/4 的病毒 ,78 和高度表达的转基因 ,78 均 被降解。当两个不同的非诱导复性的病毒都具有某 个同源基因时， 将它们先后接种到植物上， 一个病毒 诱导的 4+5* 的抗病毒性可抵抗另一种病毒。因 此， 高等植物正是通过 4+5* 这一以同源或互补核 酸序列间的相互作用为基础的高度特异的细胞防卫 机制， 来识别外源核酸从而降解入侵的病毒 ,78。 转基因或它的转录产物在很多方面类似植物细胞的 入侵者， 如病毒、 类病毒等。,78 的降解和 4+5* 信 号的触发， 可能是植物的防御体系将外源基因的转 录物作为类似病毒的 ,78 或 ,78 蛋白质复合物来 对待， 从而激活了 4+5*。 马铃薯 - 病毒 （ 4C-） &DEF= 蛋白和黄瓜花叶病 毒 （ %(C） ,78" 编码的 "@ 蛋白被最早发现可以抑 制 4+5* 的发生
引起基因沉默的原因
引起基因沉默的原因研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关,外界环境如过高的温度、过强的光照也会增加基因沉默发生的几率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本年龄)的影响。
因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的,而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环境因素协同作用的产物。
转基因沉默可以发生在染色体DNA水平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。
1.染色体DNA水平的转基因沉默发生在染色体DNA水平的转基因沉默叫做位置效应(positioneffect)。
当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转录。
按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合,使两个MAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环(1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独立的表达调控单位而存在。
MAR可能使转基因在受体基因组整合后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差异2.转录水平的基因沉默发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。
反向重复的基因或转基因可以进行异位配对,配对的DNA作为信号,使DNA异染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。
此外,DNA-RNA协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原因之一。
（1）转移基因及其启动子甲基化甲基化是活细胞中最常见的一种DNA其价修饰形式,它通常发生在DNA的GC和CN G序列的C碱基上,C甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。
甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法
转基因植物中基因沉默的机制与解决方法组长：费京珂组员：王丹旭，游高平，陈亚冬，郑昕凯（北京化工大学，生命科学与技术学院）【摘要】近些年，随着植物基因工程的不断发展，转基因后的基因沉默现象也越来越受到人们的关注，为了使得转入的基因能够高效表达且起到相应的功能作用，我们就基因沉默的机制进行综述，并阐述对解决方法的最新研究。
【关键词】植物，基因沉默，转录沉默，转录后沉默，irna【正文】转基因植物中，基因沉默主要存在两种机制，转录中水平上基因沉默与转录后水平上的基因沉默。
涉及到DNA启动子甲基化，重复序列，同源序列一起的TGS等内容。
针对基因沉默的机制，经过查找资料，我们提出了相应的解决方法。
最后，我们要运用基因沉默的机理，进而使得转基因能更加高效。
一．转基因植物沉默机制【1】【2】【3】【4】【5】【6】为了极大的提高和完善在植物中通过导入外源基因使其获得新性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的,而大量转基因植株不能正常表达,通常并不是由于外源基因的缺失或突变引起,而是基因失活的结果,这种失活现象就是基因沉默。
转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后三个不同的层次上。
发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应(effect position),位置效应是指基因在基因组中的位置对基因表达的影响。
当导入的外源基因整合到宿主高度甲基化、转录活性低的异染色区域时，外源基因一般表现沉默。
位置效应引起的基因沉默不需要基因组中有同源序列,而同源依赖的基因沉默有转录水平上的基因沉默(Transcription-al gene silencing, TGS)和转录后水平上的基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)两种形式。
转基因沉默的机制是多方面的,转基因的拷贝数、构型及在植物基因组上的结合位点等诸多因素都与沉默有关,外界环境条件如过高的温度、过强的光照也会增加沉默发生的几率。
引起基因沉默的原因
引起基因沉默的原因研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关,外界环境如过高的温度、过强的光照也会增加基因沉默发生的几率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本年龄)的影响。
因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的,而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环境因素协同作用的产物。
转基因沉默可以发生在染色体DNA水平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。
1.染色体DNA水平的转基因沉默发生在染色体DNA水平的转基因沉默叫做位置效应(positioneffect)。
当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转录。
按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合,使两个MAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环(1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独立的表达调控单位而存在。
MAR可能使转基因在受体基因组整合后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基因在不同株系表达差异2.转录水平的基因沉默发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。
反向重复的基因或转基因可以进行异位配对,配对的DNA作为信号,使DNA异染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。
此外,DNA-RNA协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原因之一。
（1）转移基因及其启动子甲基化甲基化是活细胞中最常见的一种DNA其价修饰形式,它通常发生在DNA的GC和CN G序列的C碱基上,C甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。
甲基化修饰在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。
转录后基因沉默_PTGS_及其在作物遗传改良中的应用_黄冰艳
综 述转录后基因沉默(PTGS)及其在作物遗传改良中的应用*黄冰艳1,2吉万全1**郭蔼光3 Sadequr R 4 李忠宜4(1西北农林科技大学农学院 杨凌 712100)(2河南省农业科学院生物技术研究所河南省农作物新品种重点实验室 郑州 450002)(3西北农林科技大学生命学院 杨凌 712100)(4Pl ant Industry,Commonwealth Scientific and Indus trial Research Organiz ati on,Canberra 2601,Aus tralia)摘要 转录后基因沉默(PTGS)或RNA 干扰(RNAi)技术的发展为创造植物遗传变异体提供了新途径。
P TGS 于1998年被明确为双链RNA(dsRNA)诱导的序列特异性基因沉默,短短几年内有关研究取得了突破性进展。
结合利用PTGS 技术进行的淀粉合成关键酶基因沉默研究,概述了PTGS 的作用机理和特点、dsRNA 表达载体设计、沉默效应的遗传稳定性及在作物改良应用方面的研究进展。
研究表明,基因沉默效应可在子代间稳定遗传并可通过杂交进行重组,显示了其在农作物改良方面的应用潜力。
关键词 转录后基因沉默 RNA 干扰 反向遗传学 双链RNA RNA 发卡结构 作物遗传改良收稿日期:2004-11-01 修回日期:2005-03-03*国家留学基金管理委员会资助项目(21841046)**通讯作者,电子信箱:jiwanquan2003@作物遗传改良离不开突变体的创造。
传统的创造突变体的方法包括自发突变的筛选、物理诱变、化学诱变、插入突变和基因剔除等。
90年代以来发展起来的通过抑制特定基因表达产生突变体的方法为突变体创造提供了新的途径。
近年来,转录后基因沉默(PTGS)或RNA 干扰(RNAi)技术研究取得了突破性进展,使利用基因沉默技术创造突变体成为可能[1~6]。
基因沉默(gene silencing)是转基因植物中特定基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现象。
转录水平上的基因沉默
1995年，康奈尔大学的Guo等尝试用反义
RNA阻断线虫Par21基因的表达，结果发现 反义RNA和正义RNA都阻断了基因的表达， 人们对这种现象百思不得其解。
直到1998年2 月，美国科学家安德鲁· 法尔和
克雷格· 梅洛才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射 线虫时发现，仅以抑制效应变的十分微弱； 而经过纯化后的双链RNA注射线虫时，能够 高效特异性阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo博士遇到的正义RNA抑制基 因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对 基因表达的阻断，都是由于体外转录所得的 RNA中污染了微量双链RNA而引起的。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特
定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探 索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因 治疗领域。
用于基因结构功能研究
对基因沉默进行深入研究，可帮助人们进一
步揭示生物体基因遗传表达调控的本质，在 基因克服基因沉默现象，从而使外源基因能 更好的按照人们的需要进行有效表达；利用 基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的 表达，达到治疗疾病的目的，所以研究基因 沉默具有极其重要的理论和实践意义
基因沉默的利与弊
基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，对植物而 言都是诱发突变的外来侵入的核酸，植物为保护自 己，在长期的生物进化中，形成了基因沉默这种限
制外源核酸入侵的防卫保护机制。 为用抗病毒基因植物工程育种提供了具有较大潜在实 用价值的策略——RNA介导的病毒抗性。
法国研究人员发现，哺乳动物细胞能关闭入侵的病
马江 王长兰 朱家选 胡维 郭欢
RNA干扰现象是如何被发现的？
作用机制是什么？ 实际的应用？
RNA干扰是如何发现的？
转基因沉默
45
基
因
的
转录
表
（转运RNA）
达 翻译
（核糖体RNA）
34
基因沉默，即 性状不表现
外源导入或者转
基因表达反义 RNA，抑制rRNA 和tRNA的翻译。
35
RNAi
RNA 干扰(RNA interference，RNAi) ：外源或 内源性的双链RNA(dsRNA)介导的特异性地与 其同源的mRNA 结合并导致其降解，从而抑制 基因的表达，致使内源基因沉默的现象。
28
转基因整合的遗传效应
• 位置效应(position effect)： • 重组效应(recombination effect) • 转基因沉默(transgene silencing) • 表达多样性(diverse expression)。
29
2、转基因沉默（transgene silencing)
• 转录后水平的基因沉默(PTGS)转基因 在细胞核里能稳定转录，但在细胞质 里没有相应的稳定的mRNA存在的现象
31
转录水平的基因沉默
• 转基因及其启动子甲基化 • 多拷贝重复序列 • 同源基因间的反式失活 • 位置效应引起 • 后成修饰作用
32
转录后水平的基因沉默
•RNA干扰技术
33
（细胞膜） （细胞核） （细胞质）
• 转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞 总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称 Northern杂交。它是 RNA-DNA异质双链杂交。
转基因沉默
在转基因作物研发过程中，有个现象一直困扰着转基因科学家们，基因虽然转入了植物体，但是外源基因不能稳定表达，甚至完全不表达，这就是转基因沉默现象。
转基因沉默现象的发生，反映了生物体在基因调控水平上的一种自我保护。
这种保护机制可以让生物体避开生活过程中随机进入细胞核内，甚至整合到基因组上的外源基因干扰，保持生命体征的稳定，维持物种在一个相当长时间内的稳定。
然而其背后的分子机理是什么？科学家们发现，转基因沉默有很多机理。
但是各种机理归根结底都离不开DNA-DNA、DNA-RNA 和RNA-RNA相互作用。
例如，DNA以及其启动子的甲基化，在之前提到的1986年的烟草实验中的转基因沉默即是这种原因。
植物细胞中DNA甲基化水平是很高的，核基因组中大约20-30%的胞嘧啶都处于甲基化状态。
植物DNA甲基化引起外源基因失活，可能是一种有效识别并抵制外来DNA的防御机制。
植物染色体上四种碱基A、T、G、C的组成是不均一的，某些区段常有确定的GC含量。
外源DNA的插入破坏了其原有的组织结构，引起了植物的抵抗机制。
随着对转基因沉默机制的研究，科学家还发现了一种称为RNA干扰的基因调控机制。
RNA 干扰可以有效地解释Jorgensen的矮牵牛花实验。
在Jorgensen实验中，外源的查尔酮合成酶基因已经被成功地转入矮牵牛植物体中，并且基因发生了转录，产生了mRNA，然而基因的表达却停止在了这一步，没有继续向下进行，产生的mRNA很快被降解掉，不能维持在一个稳定的数量上。
产生这种现象的原因在于矮牵牛植物体内本身就存在查尔酮合成酶基因，这个基因和转入的外源基因有着序列上的同源性。
为什么转入一个植物体自身也有的外源基因就这么麻烦，不能产生1+1=2的效果，反而成了1-1近似于0？科学家推测，生物体可能有一套自我保护机制，不允许某个基因过度表达，产生太多的某种蛋白质，因此提出了RNA阈值模型。
即细胞只能容纳或者处理一个特定阈值之下的特定基因转录的mRNA。
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一一、引言随着现代生物技术的快速发展，转基因技术已经成为改良动植物品种、提高其经济性状和改善人类生活的重要手段。
阿尔巴斯白绒山羊作为我国重要的绒山羊品种，其绒质和产绒量直接关系到畜牧业的可持续发展。
近年来，转基因技术在阿尔巴斯白绒山羊的育种中得到了广泛应用，然而，外源基因的沉默现象成为了影响其遗传性状稳定表达的重要问题。
因此，对转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究具有重要意义。
二、外源基因沉默现象的概述外源基因沉默是指转基因在受体细胞或个体中无法正常表达或表达水平显著降低的现象。
在阿尔巴斯白绒山羊的转基因过程中，外源基因沉默是一个普遍存在的问题，它可能导致转基因性状无法稳定遗传，甚至导致整个转基因过程的失败。
因此，研究外源基因沉默的机制和影响因素，对于提高转基因阿尔巴斯白绒山羊的育种效率和遗传性状稳定性具有重要意义。
三、外源基因沉默的机制研究1. 基因甲基化：基因甲基化是导致外源基因沉默的重要机制之一。
研究表明，甲基化程度越高，外源基因的表达水平越低。
因此，通过检测转基因阿尔巴斯白绒山羊的基因甲基化程度，可以了解外源基因沉默的情况。
2. 染色体结构变化：染色体结构的变化也可能导致外源基因沉默。
例如，外源基因可能被插入到染色体的非表达区域或被其他染色体序列包裹，从而影响其表达。
3. 转录后调控：除了基因结构和染色体结构的变化，转录后调控也是导致外源基因沉默的重要因素。
例如，某些基因的表达可能受到microRNA的调控，从而影响其表达水平。
四、影响外源基因沉默的因素研究1. 插入位点：外源基因在染色体上的插入位点对其表达水平有重要影响。
不同位点的插入可能导致基因表达水平的显著差异。
2. 载体类型：转基因过程中使用的载体类型也可能影响外源基因的表达水平。
不同载体的复制能力、稳定性以及与宿主细胞的相互作用等因素都可能影响外源基因的表达。
3. 细胞类型和个体差异：不同细胞类型和个体之间存在差异，对转基因的反应也可能不同。
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一摘要：本文以转基因阿尔巴斯白绒山羊为研究对象，探讨其外源基因沉默的机制及其对基因表达和生物学特性的影响。
通过对转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默现象的研究，以期为后续转基因动物的培育及改良提供理论基础和实验依据。
一、引言随着生物技术的发展，转基因技术已在动物育种和遗传病治疗等多个领域取得重要突破。
阿尔巴斯白绒山羊作为一种具有优良绒毛品质的动物，被广泛应用于科学研究与产业实践中。
近年来，研究者通过向阿尔巴斯白绒山羊导入外源基因以改善其经济性状或提供新性状的研究日趋增多。
然而，在基因转导过程中出现的基因沉默现象一直是研究的重点和难点。
本文旨在研究转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默的机制及其对生物特性的影响。
二、材料与方法1. 材料选择健康、无特定病原体的转基因阿尔巴斯白绒山羊作为实验对象，并准备相应的实验试剂和仪器。
2. 方法（1）建立转基因阿尔巴斯白绒山羊模型：通过基因编辑技术将目的基因导入山羊体内，并筛选出成功转导的个体。
（2）外源基因沉默检测：采用PCR、荧光定量PCR、Western Blot等技术手段，检测外源基因在山羊体内的表达情况及沉默现象。
（3）分析外源基因沉默机制：通过生物信息学分析、基因组学研究等方法，探讨外源基因沉默的分子机制。
（4）观察生物学特性变化：比较沉默基因与正常表达基因的山羊在生长速度、产绒量、抗病性等方面的差异。
三、结果与分析1. 外源基因沉默现象的观察通过PCR和荧光定量PCR等实验方法，发现部分转基因阿尔巴斯白绒山羊的外源基因出现了不同程度的沉默现象。
其中，某些位点的沉默率较高，而其他位点则相对较低。
2. 外源基因沉默的分子机制通过生物信息学分析和基因组学研究，发现外源基因沉默与基因甲基化、非编码RNA的调控等因素有关。
此外，宿主细胞的免疫反应也可能对外源基因的表达产生影响。
3. 生物学特性变化比较沉默基因与正常表达基因的山羊在生长速度、产绒量、抗病性等方面的差异，发现外源基因沉默对山羊的生物学特性产生了一定影响。
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，转基因技术已成为现代畜牧业改良的重要手段。
阿尔巴斯白绒山羊作为我国特有的优良品种，其绒质优良、产绒量高，深受养殖户喜爱。
近年来，通过转基因技术改良阿尔巴斯白绒山羊的育种工作已取得显著成效。
然而，外源基因在山羊体内的表达沉默现象，成为制约其进一步应用的关键问题。
本文旨在探讨转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默的机制及相关研究。
二、外源基因沉默现象概述外源基因沉默是指外源基因在转基因生物体内无法正常表达或表达水平显著降低的现象。
在阿尔巴斯白绒山羊的转基因过程中，外源基因沉默现象普遍存在，严重影响了转基因山羊的育种效果。
因此，研究外源基因沉默的机制，对于提高转基因阿尔巴斯白绒山羊的育种效率和经济效益具有重要意义。
三、外源基因沉默的机制研究1. 基因甲基化：基因甲基化是导致外源基因沉默的重要机制之一。
研究表明，甲基化程度越高，外源基因的沉默率越高。
因此，降低基因甲基化程度可能是解决外源基因沉默问题的有效途径。
2. 基因转录和翻译水平调控：除了基因甲基化外，基因转录和翻译水平的调控也是导致外源基因沉默的重要因素。
包括RNA 干扰、miRNA作用等在内的多种分子机制都可能影响外源基因的表达。
3. 宿主基因组对转基因的响应：宿主基因组对转基因的响应也是影响外源基因沉默的重要因素。
包括宿主免疫反应、染色体结构改变等在内的多种生物过程都可能对转基因的表达产生影响。
四、解决外源基因沉默的策略1. 选择合适的转基因技术和方法：采用先进的转基因技术和方法，如CRISPR-Cas9等基因编辑技术，提高转基因的效率和准确性，降低外源基因沉默的概率。
2. 优化转基因载体：通过优化转基因载体，如使用更高效的启动子、调控元件等，提高外源基因的表达水平。
3. 深入研究外源基因沉默的机制：通过深入研究外源基因沉默的机制，寻找有效的解决方法，如降低基因甲基化程度、调控宿主免疫反应等。
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• 主要观察转化子在添加相应抗生素或除草 剂培养基上的生长
• 抗的存活，不抗的死亡
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NPTⅡ活性检测
• 目的 ：检测NPTⅡ基因在植物组织中的表达 • 原理： NPTⅡ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，
影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时 使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移， 生成放射性的卡那霉素来检测。 • 检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法 • NPTⅡ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放 射自显影
• 检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微 镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植 株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿 色荧光蛋白检和定位。
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GFP在水稻原生质体中的瞬时表达结果
不含有OSPK1基因的 原生体pUC-GFP
含有OSPK1基因的原生 体pUC-OSPK1-GFP
转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色 荧光，而转化含有OSPK1基因质粒的原 生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上
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3、转基因植物分子检测
• PCR • Southern blotting • Northern blotting • RT-PCR • QRT-PCR • Western blotting
荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG
4
组织化学染色定位法检测GUS
• 以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物 水解成蓝色物质，
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gfp基因的检测
• 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光 素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内， 能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与 目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解 目的基因表达情况。
90 days
120 days
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转基因植株分子鉴定
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转基因株系GB含量
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200 mM NaCl处理
The transgenic plants were more tolerant to salt stress than the WT
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Na+、Cl-、K+ 含量
WT #48 #51 #133
• 蛋白质区带-----抗体（同位素标记） • 蛋白质水平
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4、生物学鉴定及代谢测定
• 表型鉴定 • 稳定性鉴定 • 最终鉴定
• 抗病 • 抗虫 • 抗除草剂 • 花色改变 • 品质改良
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甜菜碱醛脱氢酶 （AhBADH）转枳 及其抗盐性研究
20
AhBADH基因转枳及植株再生
30 days
60 days
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Na+、Cl-、K+ 含量
The transgenic plants accumulate lower levels of Na+ and Cl-, but they had higher K+ under salt conditions.
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第五节
遗传转化问题及新技术
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1、转基因整合
• 转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制过 程整合到核基因组中。
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转基因整合的遗传效应
• 位置效应(position effect)： • 重组效应(recombination effect) • 转基因沉默(transgene silencing) • 表达多样性(diverse expression)。
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PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
• 转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的，外源DNA可以 插入任何一条染色体，也可以插入一条染色体上的任何位点， 但对转录活跃区具有优先插入特性。
– 染色体的选择、染色体上的整合位点、一个基因组中发生的整合事 件次数、一条染色体上发生的整合事件次数、一个整合位点的拷贝 数
• 规律性：外源DNA的整合较多发生在DNA同源序列区、植物 DNA的高度重复序列区。
• 外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原 理，ELISA及Western杂交是经典的方法。
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Western杂交
• 是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS 聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上， 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是 根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特 异抗体相结合的原理而进行的。
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• GUS • GFP • LUC
2、报告基因检测
ß-葡萄糖苷酸酶基因 绿色荧光蛋白基因 荧光酶素基因
产生蓝色物质 产生绿色荧光 发射光子
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gus基因的检测
• gus基因编码 ß-葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，
能催化许多ß-葡萄糖苷酯类物质的水解。 • 检测常用底物有3种：
5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 4-甲基伞形酮酰- ß-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 对硝基苯-ß-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG） • 检测方法：组织化学染色定位法X-Gluc
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PCR
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Southern鉴定
• Southern杂交技术是1975年发明 • 原理：利用两条单链DNA的碱基互补性，
来检测外源DNA的转化结果 • DNA水平
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外源基因转录的Northern检测
• 通过Southern杂交可以得知外源基因是否整合到 植物染色体上。但是，整合到染色体上的外源基 因并不一定表达。
• 转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞 总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称 Northern杂交。它是 RNA-DNA异质双链杂交。
• 步骤同Southern杂交法 • mRNA水平
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RT-PCR
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RT-PCR
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外源基因表达蛋白的检测
• 外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正 常表达并表现出应有的功能是植物基因转 化的最终目的。表达蛋白应具有一定的稳 定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同 时应对植物细胞无毒性。