蛋白质的不稳定性及其对策
蛋白质的不稳定性及其对策
螯合剂（所有水溶液）
乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1
柠檬酸/柠檬酸盐
0.02-1
制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ），
磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 • 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，
使用螯合剂
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速；
• 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸
• 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
Β-消除反应 转肽作用 外消旋作用 二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀
表面吸附
可能的解决方案
控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度 控制PH、缓冲液 硫醇的消除（如半胱氨酸）
防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反 应
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长
蛋白质表达研究中的难点和挑战
蛋白质表达研究中的难点和挑战蛋白质是生物体中不可或缺的组成部分，它们在细胞中扮演着重要的功能角色。
研究蛋白质表达，即在生物体内合成蛋白质的过程，是生物医学科学领域中的一个重要研究方向。
然而，在进行蛋白质表达研究时，研究人员面临着一些难点和挑战。
本文将介绍蛋白质表达研究中的一些常见难点，并探讨如何应对这些挑战。
一、蛋白质结构复杂多样的挑战蛋白质的结构复杂多样，包括氨基酸序列、三维结构以及其所处的细胞环境等。
对于研究人员来说，了解蛋白质结构对于准确表达目标蛋白质至关重要。
然而，确定蛋白质的准确结构是一项相当困难的任务。
许多蛋白质的结构尚未被完全解析，或者存在变异和异常表达。
这为蛋白质表达研究带来了挑战，需要针对具体蛋白质结构的特点进行设计和优化。
二、蛋白质表达的低产量和不稳定性在蛋白质表达中，研究人员常常面临低产量和不稳定性的问题。
很多目标蛋白质在表达时难以得到足够的产量，甚至无法进行充分表达。
此外，有些蛋白质在表达过程中容易失去折叠或聚集成大量的非功能性物质，从而难以获取纯净的目标蛋白质。
这些问题不仅会延长研究时间，还会增加实验的复杂性和成本。
因此，提高蛋白质表达的产量和稳定性是一个重要的挑战。
三、选择适合的表达系统在蛋白质表达研究中，选择适合的表达系统是一个关键的决策。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
不同的表达系统具有各自的特点和优势，因此选择合适的表达系统对于获得高效的目标蛋白质表达至关重要。
然而，确定适合的表达系统需要综合考虑蛋白质的生理特性、表达需求以及其它实验条件的限制。
这需要研究人员具备丰富的经验和专业知识。
四、后续处理和纯化的困难蛋白质表达的成功并不意味着表达的蛋白质已经满足研究的需求。
在蛋白质表达后，研究人员需要进行后续的处理和纯化步骤，以获得纯净的目标蛋白质。
这些步骤通常包括分离、浓缩、纯化和结晶等过程。
然而，这些步骤可能会影响蛋白质的结构和功能，导致实验结果的偏差。
蛋白质稳定性及相关研究方法
蛋白质稳定性及相关研究方法蛋白质是生命体中最重要的基础分子之一，它们参与了生命的方方面面，扮演着至关重要的角色。
因此，无论从科学角度还是从医学角度，研究蛋白质的结构和功能都是至关重要的。
但是，由于许多蛋白质在自然状态下非常不稳定，很容易发生降解、变性和聚集等问题，限制了研究的深入程度。
因此，蛋白质稳定性及相关研究方法成为了近年来科学家们研究的热门课题。
一、蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性是指蛋白质在存储、转运和使用过程中维持其天然构象和活性的能力。
然而，许多因素都可能影响蛋白质的稳定性，包括温度、PH值、盐浓度、氧化还原状态、界面作用和聚集等。
其中，温度是影响蛋白质稳定性的最主要因素之一。
日常生活中，许多蛋白质只能在温度较低的条件下保持活性，如酶的最适温度通常在20-40℃之间。
但有些蛋白质需要在高温或极度低温的环境下保持活性，如一些古菌和嗜极生物所表达的蛋白质，在高温或极端寒冷环境下具有较高的热稳定性和冷稳定性。
此外，蛋白质在不同的PH值和盐浓度下也可能表现出不同的稳定性。
例如，有些酶在低盐浓度下会出现聚集现象，并导致失活，而在高盐浓度下，聚集现象可能消失而活性得以维持。
类似地，某些蛋白质在不同PH值下可能会发生酸性或碱性变性，影响其稳定性和活性。
二、蛋白质稳定性的研究方法为了研究蛋白质的稳定性，科学家们提出了许多方法。
最常用的方法之一是热力学分析方法。
热力学分析方法包括热重分析、差示扫描量热法和热差分析等，可以通过测定蛋白质在不同条件下的热稳定性和热响应来评价其稳定性。
此外，蛋白质的稳定性也可以通过生物物理学、生物化学和生物学等多种方法进行研究。
例如，通过利用软X射线晶体学技术研究蛋白质的分子结构，可以了解蛋白质的构象变化机制；还可以通过核磁共振技术、分子动力学模拟等方法揭示蛋白质分子间相互作用的变化和不同结构状态下的动力学性质。
最近，一种叫做聚合酶链式反应（PCR）的技术被广泛应用于评估蛋白质的稳定性。
蛋白质不稳定性分解
蛋白质的不稳定性及对策
刘耀玺
河南科技大学林业职业学院 生物技术教研室
一、蛋白质失活的机制
根据蛋白质的结构层次不同，经常将蛋白质 的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四 级结构。 蛋白质的一级结构就是共价主链的氨基酸序 列，有时也称化学结构。二、三、四级结构又称 空间结构（即三维结构）或高级结构。 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高 级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的。而氨 基酸序列是由遗传物质 DNA 的核苷酸序列决定的。 肽键（ CO-NH ）是连接多肽链主链中氨基酸残基 的共价键，二硫键（ -S-S- ）是使多肽链之间交 联或使多肽链内成环的共价键。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（一）氢键： 氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的 作用，多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成的氢 键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力，另外， 氢键还可以在侧链与侧链、侧链与介质水、主链 肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。 大多数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主 链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α螺 旋、β折叠），与此同时保持大多数能成氢键的 侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合。
Байду номын сангаас
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
蛋白质的天然折叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
第二章 蛋白质不稳定性
叠结构决定于3个因素： 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用； 2、溶剂的pH和离子组成； 3、蛋白质的氨基酸序列。 前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸 序列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于 序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便 于相隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白 质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排 列，然而其结构中无例外地有多种力处于精细的 平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
（二）范德华力（范德华相互作用）： 广义的范德华力包括3种较弱的作用力，即： 定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永 久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范 德华力； 诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是 永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相 互作用； 分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力， 它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭 义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作 用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时 变化的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一 些所谓的弱的相互作用或称非共价键或 次级键，包括：氢键、范德华力、疏水 作用和盐键（离子键）。此外，共价二 硫键在稳定某些蛋白质的构象方面也起 着重要作用。 这几种作用力的键能（断裂该键所需的 能量）都是较低的。
二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素
主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉 淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如 温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子 （分子伴侣）的作用。
五、包含体的形成与性质
现代研究表明：在大多数情况下，包含体 的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋 白质的种类和表达系统无关，即包含体的 形成与其相对分子质量、疏水性以及折叠 途径等内在性质没有必然的联系。换句话 说，对于任何蛋白质和任何表达系统，在 过量表达的情况下都可能形成包含体。 蛋白质的折叠复性和包含体的形成为动力 学竞争的结果。
分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策
。
在许多情况下 , 天然蛋白质仅受到蛋白酶的缓慢水 解, 而部分变性的解折叠蛋白质则增大了蛋白水解 酶水解的可能性。微生物的污染极有可能给分离纯 化系统带入蛋白酶。蛋白酶除了造成对肽键的破坏
, Asn 脱酰胺形成的五元琥珀酰亚胺中间产物更
68
外, 在高温水溶液条件下 还会造成 Asp 的肽水解、 Gln 和 Asn 侧链的脱氨基、 Cys 侧链的 去除及二硫 键交 换 , 从 而 对 肽 链 再 折 叠 产 生 极 其 严 重 的 影 响
5) Asn 和 Gln 脱酰胺作用
2 如果一级结构没有变化, 三级或四级结构变化也
热酶复杂结构中具有更多的盐桥。但是对一个球蛋 白来说, 平均 150 个氨基酸残基中只有一个盐桥处 于内部, 其它都在分子表面。因此 , 参与稳定蛋白质 的可能是处于分子表面的那些离子键 的稳定性
[ 8, 9] [ 10]
5) 不正确的折叠形式或形成错配的二硫键 从动力学上讲 , 蛋白质在提纯过程中活性的丧 失可能是由天然状态 N 经过一系列相对稳定的中 间态 U 1 , U 2 . . . 而最终达到变性状态 D[ 3] : N U1 U2 D 一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性, 是一个可逆过程, 而成为变性态则有的是可逆的 , 有 的是不可逆的。 1 1 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要 的乃至决定性的作用[ 4] 。Yatani 等人证实蛋白质的 稳定性与疏水性之间在一定的关系。而疏水性取决 于蛋 白 质 分 子 内 部 疏 水 性 氨 基 酸 的 个 数[ 5] 。 Mozhave 等分析了嗜热酶的稳定性为什么比中温酶 稳定性高的原因 , 结果表明 [ 6] , 嗜热酶分子内 部疏 水性氨基酸含量高 , 具有更紧密的疏水核。 氢键和离子键对 稳定性也有作 用。 Pace 等人 发现 [ 7] , 氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同 的甚至更 高的稳定作用 [ 8] 。许多研究者证 实[ 9] 嗜 67
蛋白质的不稳定性及其对策分解
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、与溶质及表面间的反 应
蛋白质分子与小分子物质稳定性比较
蛋白质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长 小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度 1.抗微生物保藏剂 2.可溶性增强剂 3.冻干产品填充剂 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化） Β-消除反应 转肽作用 可能的解决方案 控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导 致低物理稳定性。 • 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• • • •
1.水解和脱氨反应 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺 影响因素：极端PH、温度和离子强度 最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋 白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率 • 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速 率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
影响植物蛋白饮料稳定性的因素及其控制措施[参照材料]
![影响植物蛋白饮料稳定性的因素及其控制措施[参照材料]](https://img.taocdn.com/s3/m/414d0c0cb90d6c85ec3ac69f.png)
影响植物蛋白饮料稳定性的因素及其控制措施用来生产植物蛋白的原料中，除含丰富的蛋白质外，一般都还含有很多的油脂，如大豆中蛋白质的含量一般在40%左右，而其油脂含量一般在25%左右；花生中蛋白质的含量一般为25%左右，而油脂含量高达40%左右；核桃、松子的油脂含量更高达60%以上；杏仁中的油脂含量也高达50%左右。
事实上，在生产植物蛋白饮料时，蛋白质变性、沉淀和油脂上浮是最常见，也是最难解决的问题。
此外，植物蛋白原料中一般都还含淀粉、纤维素等物质，其榨出来的汁（或打出来的浆）是一个十分复杂而又十分不稳定的体系。
影响植物蛋白饮料稳定性的因素很多，但总体而言，可以从以下几个方面进行控制。
一、原料质量的影响要生产出高质量的植物蛋白饮料，原料的质量是至关重要，一定要保证选用优质原料，（优质原料的标准以新鲜、子粒饱满均匀、无虫蛀、无霉变为好）否则对产品的质量有很大的影响。
因为劣质的原料，有的因贮藏时间过长脂肪部分氧化，易产生哈败味，同时影响其乳化性能；有的部分蛋白质变性，经高温处理后易完全变性而呈豆腐花状；若有霉变的则可能产生黄曲霉毒素，影响消费者健康。
总而言之，使用劣质原料生产产品，不但产品的口味差，而且稳定性很差，蛋白质易变性，油脂易析出。
二、原料用量的影响原料的添加量对产品的稳定性影响很大。
以花生奶为例，实验表明，当花生的添加量在8%以上时，无论添加多少乳化剂，采用怎样的生产工艺，都很难生产出长时间保存（3个月以上）既无油层，又无沉淀的产品。
若需生产添加花生量在8%以上的产品，则该类产品应以鲜销（保存2-3天）为好，或对花生做适当的处理如脱油脂后，再生产长时保存的花生奶。
因而，在生产植物蛋白饮料时，应首先根据产品的定位，结合国家相关标准，及工艺可行性确定原料添加量，不能一味追求口味而多加原料，否则一方面产品成本太高，在市场上没有竞争力，另一方面产品质量不稳定，易出现质量问题。
三、乳化稳定剂的影响可以十分肯定的说，若不使用乳化稳定剂，不可能生产出长期保存而始终保持均匀一致、无油层、无沉淀的植物蛋白饮料。
蛋白质不稳定性
对于以包含体形式表达的蛋白质，需要在分离回 收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在 合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和 生物活性，这一过程称为蛋白质的体外再折叠或 复性。
五、包含体的形成与性质
(一)包含体的形成 目前，关于包含体的形成机理尚不完全 清楚，一般认为包含体的形成是部分折叠的 中间态之间疏水性相互作用的结果。
第二章
蛋白质的不稳定性及对策
刘耀玺
河南科技大学林业职业学院 生物技术教研室
一、蛋白质失活的机制
根据蛋白质的结构层次不同，经常将蛋白质 的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四 级结构。 蛋白质的一级结构就是共价主链的氨基酸序 列，有时也称化学结构。二、三、四级结构又称 空间结构（即三维结构）或高级结构。 蛋白质的生物功能决定于它的高级结构，高 级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的。而氨 基酸序列是由遗传物质 DNA 的核苷酸序列决定的。 肽键（ CO-NH ）是连接多肽链主链中氨基酸残基 的共价键，二硫键（ -S-S- ）是使多肽链之间交 联或使多肽链内成环的共价键。
微生物因素：微生物分解利用蛋白质进行生长 繁殖
三、环境因素对蛋白质稳定性的影响
值得注意的是：蛋白质的变性是一个协 同过程，它是在所加变性剂的很窄浓度 范围内或很窄pH或温度间隔内突然发生 的。
四、分离纯化中保持蛋白质稳定的方法
1、尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行 分离纯化操作； 2、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操 作； 3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行 详细的试验，确定最佳添加量和条件；
三、环境因素对蛋白质稳定性的影响
物理因素：温度、紫外线照射、高压和表面张 力等； 化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸、碱等；如 尿素和盐酸胍，一方面能与多肽主链竞争氢键， 破坏蛋白质的二级结构；更重要的是它们可以 增加非极性侧链在水中的溶解度，因而降低了 维持蛋白质三级结构的疏水相互作用。 酶的作用：一些蛋白质分解酶类的作用。
蛋白质不稳定性与抗体异质的影响因素-txz
•
•
最常见的是异天冬氨酸形式。不仅来源于Asp的直接异构化，还来源于琥 珀酰亚胺的水解。琥珀酰亚胺中间体依赖pH形成，由Asn脱酰胺或Asp脱 水。中性和碱性下，isoAsp和Asp产物大概比例3：1。 CDR区 H102的Asp 异构化活性将至9-21%。L32的Asp降低Fab2相对活性至42%，两条链都异 构化时降至15%。琥珀酰亚胺形成不需要水的参与，因此在冻干状态也会 发生。无论在Tg温度上下，升高保存温度都会增加异构化。 空间效应也强烈影响异构化速率。CDRs内两个Asp-Gly序列，只有一个位 点发现对异构化易感，另一个则不会发生，可能跟氢键有关。
C-端赖氨酸加工
• 最常见的修饰之一 • 重链C端编码有Lys，但是由于碱性羧肽酶的 活性使其部分或完全移除 • 移除后分子量减小128Da，正电基团减1 • 部分移除时，产生分别含0,1,2个C端Lys的重 链，电荷差异使IEF上可区分多条带，或者 离子交换多个峰。HIC或RP也有分离作用。 • 羧肽酶B处理可减少这方面的异质性。
– 出现88kD条带，L46-52 and H99-121 之间。氧化作用的抑制可以延迟这种 交联。 – a nonreducible thioether bond can be formed between C223 of the heavy chain and the C-terminal Cys residue of the light chain in humanized IgG1 antibodies。质谱75kD，PAGE胶是92kD。冻干的固体剂型中也会发生，at 568C for 18 days led to forma-tion of 100-kDa band under reduced conditions by SDS–PAGE
影响植物蛋白饮料稳定性的因素及其控制措施!230
影响植物蛋白饮料稳定性的因素及其控制措施用来生产植物蛋白的原料中，除含丰富的蛋白质外，一般都还含有很多的油脂，如大豆中蛋白质的含量一般在40%左右，而其油脂含量一般在25%左右；花生中蛋白质的含量一般为25%左右，而油脂含量高达40%左右；核桃、松子的油脂含量更高达60%以上；杏仁中的油脂含量也高达50%左右。
事实上，在生产植物蛋白饮料时，蛋白质变性、沉淀和油脂上浮是最常见，也是最难解决的问题。
此外，植物蛋白原料中一般都还含淀粉、纤维素等物质，其榨出来的汁（或打出来的浆）是一个十分复杂而又十分不稳定的体系。
影响植物蛋白饮料稳定性的因素很多，但总体而言，可以从以下几个方面进行控制。
一、原料质量的影响要生产出高质量的植物蛋白饮料，原料的质量是至关重要，一定要保证选用优质原料，（优质原料的标准以新鲜、子粒饱满均匀、无虫蛀、无霉变为好）否则对产品的质量有很大的影响。
因为劣质的原料，有的因贮藏时间过长脂肪部分氧化，易产生哈败味，同时影响其乳化性能；有的部分蛋白质变性，经高温处理后易完全变性而呈豆腐花状；若有霉变的则可能产生黄曲霉毒素，影响消费者健康。
总而言之，使用劣质原料生产产品，不但产品的口味差，而且稳定性很差，蛋白质易变性，油脂易析出。
二、原料用量的影响原料的添加量对产品的稳定性影响很大。
以花生奶为例，实验表明，当花生的添加量在8%以上时，无论添加多少乳化剂，采用怎样的生产工艺，都很难生产出长时间保存（3个月以上）既无油层，又无沉淀的产品。
若需生产添加花生量在8%以上的产品，则该类产品应以鲜销（保存2-3天）为好，或对花生做适当的处理如脱油脂后，再生产长时保存的花生奶。
因而，在生产植物蛋白饮料时，应首先根据产品的定位，结合国家相关标准，及工艺可行性确定原料添加量，不能一味追求口味而多加原料，否则一方面产品成本太高，在市场上没有竞争力，另一方面产品质量不稳定，易出现质量问题。
三、乳化稳定剂的影响可以十分肯定的说，若不使用乳化稳定剂，不可能生产出长期保存而始终保持均匀一致、无油层、无沉淀的植物蛋白饮料。
蛋白质不稳定的原因
蛋白质不稳定的原因嘿，你们知道吗？我觉得蛋白质就像一个小机灵鬼，很容易受到影响呢。
蛋白质不稳定是有好多原因的。
一是温度啦。
就好像我们人一样，太热或者太冷都会觉得不舒服。
蛋白质也是这样，温度太高的时候，蛋白质就像被火烤着的小虫子，它的结构会被破坏掉。
比如说我们煮鸡蛋，生鸡蛋的蛋清里有蛋白质，当我们把鸡蛋放到热水里煮的时候，随着温度升高，蛋白质的结构就改变啦，蛋清就从透明的液体变成了白色的固体。
温度太低呢，也会让蛋白质不开心，有些蛋白质在低温的时候，它们的活性会降低，就像小动物冬眠一样，不能好好地工作啦。
还有酸碱度的问题。
你可以把蛋白质想象成一个很挑剔的小朋友，它只喜欢在合适的酸碱度环境里玩耍。
如果环境太酸或者太碱，就像给这个小朋友放到了一个很刺激的地方，它的结构会发生变化。
就像我们的胃里有胃酸，它的酸性比较强，胃里有一种叫胃蛋白酶的蛋白质，它可以在胃酸的环境里工作，但是其他很多蛋白质如果跑到胃里这种酸性环境，就会被破坏啦。
另外呢，蛋白质还很害怕一些化学物质。
有些化学物质就像是小恶魔，会和蛋白质打架。
比如说重金属离子，像汞离子、铅离子这些，它们一旦碰到蛋白质，就会和蛋白质紧紧地结合在一起，让蛋白质的结构变形，这样蛋白质就没办法正常工作啦。
而且，蛋白质如果放太久也会不稳定。
就像我们的食物一样，要是放了很长时间，食物里的蛋白质就会慢慢变质。
比如一块肉，放了好多天，它的颜色会变，味道也会变，这就是因为蛋白质不稳定，发生变化啦。
蛋白质的浓度也会影响它的稳定性。
如果蛋白质的浓度太高，就像好多小朋友挤在一个小房间里，它们很容易碰撞在一起，然后结构就可能会被破坏啦。
所以呀，蛋白质真的是很需要我们好好照顾的小家伙呢，要给它合适的温度、酸碱度，还要保护它不受坏东西的干扰，这样它才能好好地为我们的身体工作啦。
蛋白质稳定性与优化设计
蛋白质稳定性与优化设计在细胞、组织和器官的生理过程中，蛋白质是其中最重要的分子类别之一。
蛋白质最主要的生物学功能是催化化学反应、传递信号、以及支持细胞的结构和组织。
然而，在药物开发和生物技术领域中，蛋白质的稳定性却成为了一个越来越大的瓶颈。
蛋白质稳定性的优化设计已经成为药物开发和生物技术领域中的热门话题之一。
蛋白质稳定性的重要性在药物开发过程中，药物的稳定性是一项至关重要的性能。
在药物的使用过程中，药物分子必须能够保持其化学结构的稳定性，以确保其作用的准确性和持续性。
蛋白质药物的稳定性通常比小分子药物更加复杂。
因为蛋白质分子具有非常复杂的三维结构，并且容易受到各种因素的影响。
这些因素包括但不限于温度、氧化、酸碱度、离子强度、有机溶剂、气体和机械刺激等。
在生物技术领域中，蛋白质的稳定性也是一个非常重要的问题。
蛋白质作为一种重要的生物工具，其在生物分子识别、细胞信号传递及分子合成、酶催化、分子运输等方面发挥着重要作用。
但是，由于蛋白质的化学结构是非常复杂的，并且不同的蛋白质分子之间也存在很大差异，所以为了在实验中充分利用和发挥蛋白质的作用，需要对其稳定性进行优化设计。
引起蛋白质不稳定的因素温度：高温是导致大多数蛋白质失活和不稳定的主要原因。
当温度达到一定程度，蛋白质会发生变性，即失去其原有的生物活性，并成为一种不可逆的状态。
酸碱度：不同的蛋白质其最适pH值各不相同，在不同酸碱环境下，蛋白质会发生结构变化，从而影响其生物活性和稳定性。
氧化：氧化剂能够引起蛋白质的氧化反应，使蛋白质失去活性。
可加入抗氧化剂进行保护。
离子强度：不同离子强度对蛋白质的稳定性有不同的影响。
高离子强度会对蛋白质的稳定性产生负面影响。
有机溶剂：有机溶剂对蛋白质的稳定性也有很大影响。
蛋白质稳定性的优化设计在药物开发和生物技术领域中的蛋白质稳定性问题已成为一个热门的研究方向。
同时，也涌现出许多有效的方法和工具，以帮助生物科学家进行蛋白质稳定性的优化设计。
蛋白质稳态技术中的操作常见错误及纠正方法
蛋白质稳态技术中的操作常见错误及纠正方法蛋白质稳态技术是研究蛋白质结构、功能以及相互作用的重要方法，广泛应用于生物医学研究和药物研发领域。
然而，在进行蛋白质稳态技术实验时，很容易出现一些常见错误，这些错误可能会影响研究结果的准确性和可靠性。
本文将介绍几种常见的操作错误，并提供纠正方法，以帮助研究人员避免这些错误。
错误一：样品处理不当在进行蛋白质稳态实验之前，对样品的处理是至关重要的。
常见的错误包括样品的过度冻融循环、pH值调整不当以及样品的稀释和浓缩值错误等。
这些错误可能导致蛋白质分子的构象变化、降解或聚集，进而影响实验结果。
纠正方法：要避免样品处理错误，首先，要确保样品经过适当的冻融循环次数，避免过度冻融，以保持蛋白质的稳定性。
其次，在进行样品的pH调整时，应根据具体实验要求和蛋白质的特性选择适当的缓冲液，并严格控制pH值。
此外，在样品的稀释和浓缩过程中，应根据实验目的和要求进行合适的处理，以避免过度稀释或浓缩。
错误二：试剂选择错误在蛋白质稳态技术中，试剂的选择对实验结果至关重要。
错误的试剂选择可能导致试剂与样品的不兼容性、背景噪音的增加以及数据的不可靠性。
纠正方法：为了避免试剂选择错误，首先，要根据实验要求和蛋白质的特性选择合适的试剂。
例如，对于某些蛋白质，如果需要维持其原始构象或抑制其聚集，可以选择特定的稳态缓冲液或添加剂。
其次，要确保试剂的质量优良，避免使用已经过期或质量不佳的试剂。
最后，在使用试剂之前，应先进行试验验证其与样品的兼容性和效果。
错误三：操作条件不合适在进行蛋白质稳态实验时，操作条件的选择和控制对实验结果具有重要影响。
常见的错误包括温度、pH值、反应时间和混匀速度等操作条件的选择不合适，导致实验结果的可靠性下降。
纠正方法：为了确保操作条件的合适性，首先要根据研究目的和蛋白质的特性，选择适当的操作温度和pH范围，以确保蛋白质的稳定性。
其次，在进行反应或混匀的过程中，要根据实验要求和样品的特性选择合适的时间和速度，以确保实验结果的有效性和可重复性。
生物分离工程2(生物分离中蛋白质的不稳定性及其对策)
四、分离纯化中保持蛋白质稳定的方法
㈠ 添加蛋白质稳定剂 添加蛋白质稳定剂 ㈡ 优化操作条件 优化操作条件 ㈢ 减少纯化步骤 减少纯化步骤 ㈣ 进行纯化的过程集成 进行纯化的过程集成
㈠添加蛋白质稳定剂
1. 2. 3. 4. 5. 6.
添加共溶剂 添加共溶剂 添加抗氧化剂和还原剂 添加抗氧化剂和还原剂底物 抗氧化剂和还原剂底物 添加底物、 添加底物、辅酶和辅基 底物 添加金属离子 添加金属离子 添加蛋白酶抑制剂 添加蛋白酶抑制剂 添加蛋白质、 添加蛋白质、磷脂和脂肪酸 蛋白质
1、添加共溶剂
①优先排阻作用的含义 优先排阻作用的 常用的共溶剂②常用的共溶剂-糖类 ③常用的共溶剂-甘油和醇 常用的共溶剂-
①优先排阻作用的含义 优先排阻作用的含义
共溶剂的加入可以改变溶液的热力学性质, 共溶剂的加入可以改变溶液的热力学性质,在 蛋白质表面完全水化和共溶剂完全结合之间建立 了一种平衡,使得天然蛋白质的稳定性增强, 了一种平衡,使得天然蛋白质的稳定性增强,理论 上称为优先排阻作用 上称为优先排阻作用。 优先排阻作用。 常常使用(1～4)mol/L高浓度共溶剂来稳定蛋 常常使用(1～4)mol/L高浓度共溶剂来稳定蛋 白质和细胞器。
4、添加金属离子 添加金属离子
作为酶分子的一部分, 作为酶分子的一部分, 作为酶分子的活化剂, 作为酶分子的活化剂, 金属离子对结构的稳定作用 金属离子对结构的稳定作用 金属离子的抑制作用及变性作用 常用的金属螯合剂 常用的金属螯合剂
金属离子对结构的稳定作用
枯草杆菌蛋白酶 灰色链丝菌蛋白酶 胰蛋白酶等。 胰蛋白酶等。
生物分离工程
第 二章 生化分离制备 中 蛋白质的不 稳定性及其 对策
第二章 生化分离制备中 蛋白质的不稳定性及其对策
蛋白质的不稳定性及其对策
小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度效应是连续的
精品PPT
蛋白质药品(yàopǐn)中添加剂的作 用
• 1.抗微生物保藏剂 • 2.可溶性增强剂 • 3.冻干产品填充(tiánchōng)剂 • 4.等渗溶液添加剂
精品PPT
亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 0.1-0.5 亚硫酸钠）
硫甘油
0.1-0.5
巯基乙酸
0.05-0.2
半胱氨酸盐酸盐
0.1-0.5
螯合剂（所有水溶液）
乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1
柠檬酸/柠檬酸盐
0.02-1
精品PPT
制剂中使用抗氧化剂常出现(chūxiàn) 的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比(xiānɡ bǐ)（Tris、HEPES、
MOPS ），磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨 酸氧化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度依赖性， 多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸氢盐加速 胰岛素破坏
下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 • 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化，使用螯合
剂
精品PPT
其它蛋白质化学(huàxué)不稳定性及 制剂方法
• 1.β消除：发生(fāshēng)在低温和高PH，碱 性条件下显著加速；
• 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和赖 氨酸
• 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且可能导 致其它降解反应，如烷基化、双链加成作用和与重金 属发生配位作用。
蛋白质稳态丧失的原因
蛋白质稳态丧失的原因蛋白质是生物体内重要的组成部分，对于维持生命活动具有至关重要的作用。
然而，在某些情况下，蛋白质的稳态会丧失，导致其功能和结构发生改变，甚至失去原本的功能。
蛋白质稳态丧失的原因可以归结为以下几个方面。
突变是导致蛋白质稳态丧失的常见原因之一。
突变是指基因序列发生变异，导致蛋白质中的氨基酸序列发生改变。
这种改变可能会影响蛋白质的结构和功能。
例如，一些突变可能导致蛋白质折叠不正确，或者改变蛋白质与其他分子的相互作用，从而影响其正常功能。
环境因素也可以影响蛋白质的稳态。
蛋白质的稳态受到温度、pH值、离子浓度等环境因素的调控。
当环境条件发生改变时，蛋白质的稳态可能会丧失。
例如，高温或酸碱性环境可能导致蛋白质的构象发生改变，使其失去原有的功能。
蛋白质的翻译后修饰也可以影响其稳态。
翻译后修饰是指蛋白质合成完成后，通过化学修饰改变其结构和功能。
常见的翻译后修饰包括磷酸化、甲基化、乙酰化等。
这些修饰可能会导致蛋白质的稳态发生改变，从而影响其功能。
蛋白质的降解也是导致稳态丧失的原因之一。
蛋白质的稳态不仅受到合成的调控，还受到降解的调控。
当蛋白质的降解速率超过合成速率时，蛋白质的稳态就会丧失。
这可能是由于蛋白质的降解途径异常活跃，或者合成过程发生障碍导致的。
蛋白质的聚集也会导致其稳态丧失。
蛋白质在细胞内通常以单体形式存在，但在某些情况下，蛋白质可能会发生异常聚集，形成聚集体。
这些聚集体可能具有毒性，导致细胞功能受损，甚至导致细胞死亡。
蛋白质稳态丧失的原因可以是突变、环境因素、翻译后修饰、降解和聚集等。
了解这些原因对于研究蛋白质稳态的变化以及开发相关疾病的治疗方法具有重要意义。
未来的研究应该进一步探索蛋白质稳态丧失的机制，以及寻找相应的干预策略，以维持蛋白质的正常功能和稳态。
生物体内的蛋白质结构稳定性
生物体内的蛋白质结构稳定性蛋白质是生物体内广泛存在的重要组分，其结构的稳定性对于维持生物体正常的生理功能至关重要。
本文将从蛋白质结构的组成及稳定性的影响因素等角度进行探讨。
1. 蛋白质结构的组成蛋白质是由一串氨基酸残基组成的多肽链，根据其氨基酸残基的种类和序列不同，蛋白质的结构和功能也会有所差异。
常见的氨基酸包括20种天然氨基酸，它们分别是甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天门冬氨酸、天门冬氨酸、天量酸和亮氨酸。
在这20种氨基酸中，赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、组氨酸和天量酸的侧链富含电荷，它们在蛋白质结构的稳定性中起到重要的作用。
2. 蛋白质结构的稳定性因素蛋白质的结构稳定性受多种因素的影响，包括温度、pH值、离子浓度、溶剂条件、氧化还原环境等。
（1）温度：温度的升高会导致蛋白质的变性。
当温度超过蛋白质的临界温度时，蛋白质会失去其原有的结构而变得不稳定。
这是因为高温会破坏氢键、范德华力和疏水相互作用等。
相反，低温有助于维持蛋白质的结构稳定性。
（2）pH值：不同的蛋白质对pH值的敏感程度各不相同。
大多数蛋白质在特定的pH范围内具有最佳的结构稳定性。
当pH值偏离这个范围时，蛋白质可能会发生变性。
这是因为蛋白质的氨基酸残基在不同的pH值下具有不同的电离状态，进而影响到它们之间的相互作用。
（3）离子浓度：适当的离子浓度对于蛋白质结构的稳定性至关重要。
离子在生物体内可以提供屏蔽作用，减少蛋白质之间的静电相互作用，从而维持蛋白质的折叠状态。
（4）溶剂条件：溶剂的性质和浓度也会影响蛋白质的结构稳定性。
溶剂中可能存在对蛋白质的有利或不利的相互作用，例如水分子可以促进蛋白质的的氢键形成，而有机溶剂则可能导致蛋白质的变性。
（5）氧化还原环境：生物体内的细胞通常存在复杂的氧化还原系统。
氧化还原环境的不平衡会导致蛋白质结构的破坏。
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制剂中使用抗氧化剂常出现的问题
• 1.Fe3+和氧存在时，抗坏血酸诱导蛋氨酸氧化 • 2.与其它缓冲液相比（Tris、HEPES、MOPS ）， 磷酸盐缓冲液在有抗坏血酸存在时加速蛋氨酸氧 化 • 3.抗坏血酸-蛋氨酸氧化的氧化强化剂作用具浓度 依赖性，多数发生在PH6-7 • 4.亚硫氨酸氢盐导致的蛋白稳定性问题：亚硫酸 氢盐加速胰岛素破坏
缓冲液
• 目的：用于防止溶液中小的PH值改变，这些改变 影响着蛋白质可溶性和稳定性。 • 注意的问题： • 1.放大及生产规模中找到满足要求的缓冲系统可 能困难，需要借助于酸碱调节。它们可能改变缓 冲系统的缓冲能力，离子强度。 • 2.为更好的控制PH，增强缓冲能力将显著提高离 子强度。 • 3.普通的酸和/或碱催化可能加速蛋白质的降解。 • 4.冷冻干燥过程中缓冲液的结晶化可能改变溶液 冷冻浓缩时的PH，影响药物稳定性。
2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法
• 1.甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨 酸和酪氨酸对氧化和光解敏感，与蛋白质构型及 氨基酸最终溶剂和环境条件相关，如氧、光、热、 金属离子及各种自由基激活剂。 • 2.巯基氨基酸的氧化（蛋氨酸和半胱氨酸）可能 导致二硫键的形成和生物活性的丧失。 • 3.游离巯基可能氧化形成不正确的二硫键，而且 可能导致其它降解反应，如烷基化、双链加成作 用和与重金属发生配位作用。 • 4.空气中的氧会引发蛋氨酸残基的氧化反应。
其它蛋白质化学不稳定性及制剂方 法
• 1.β消除：发生在低温和高PH，碱性条件下 显著加速； • 氨基酸包括半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和 赖氨酸 • 对策：降低PH • 2.二硫键断裂 • 原因：温度过高 • 对策：降低温度
• 3.巯基与二硫键 • 在蛋白质的三级结构中，二者起主导作用， 当二硫键交换并导致三维结构发生变化时， 生物活性可能丧失 • 原因：亲核、亲电试剂导致的可逆破坏； • 高温、极端的PH • 二硫键的交换
蛋白质制剂中的抗氧化剂和螯合剂
试剂 抗氧化剂（所以水溶液） 抗坏血酸（异抗坏血酸、抗坏血酸钠） 亚硫酸盐（亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 亚硫酸钠） 硫甘油 巯基乙酸 半胱氨酸盐酸盐 螯合剂（所有水溶液） 乙二胺四乙酸（EDTA）（通常为钠盐） 0.05-0.1 柠檬酸/柠檬酸盐 0.02-1 0.1-1.0 0.1-0.5 0.1-0.5 0.05-0.2 0.1-0.5 制剂中的使用浓度/%
防止氧化降解的措施
• • • • • • 1.低温下制备与储藏 2.使用螯合剂消除金属催化反应 3.提高离子强度，减少二硫键的形成 4.消除过氧化物和金属污染物 5.避光 6.注意光反应和磷酸盐缓冲液条件下可能形成游离基的反 应 • 7.生产过程中用氮或氩代替氧 • 8.当需维持所需蛋白质的可溶性和抗水解稳定性时，尽可 能在低PH下进行，因为抗氧化稳定性与PH呈负相关。 • 9.为抑制游离基形成和微量金属离子所导致的蛋白氧化， 使用螯合剂
蛋白质的不稳定性
1、物理不稳定性 变性、聚集、吸附、大分子的可溶性 2、化学不稳定性 水解、氧化、消旋、质 大量潜在的反应位点 大量离子化位点 缓冲作用通常是唯一的酸/碱催化 有二级、三级、四级高级结构 分散（胶体）水相 温度效应是间断的（变性） 易支持微生物生长 小分子 很少反应位点 很少离子化位点 缓冲作用通常是广泛的酸/碱催化 没有高级结构 溶液中为单一相和连续相 温度效应是连续的
1.PH、水解和缓冲液
• 稳定性、可溶性和PH遵循一个规律： • 高溶解度导致低化学稳定性；低溶解度导 致低物理稳定性。 • 例子：胰岛素溶解度与脱氨反应
• • • •
1.水解和脱氨反应 氨基酸：天冬酰胺和谷氨酰胺 影响因素：极端PH、温度和离子强度 最明显的例子：中性和碱性条件下提高蛋 白质的脱氨速度（主要是Asn--Gly），脱氨 速率高于水解速率 • 改善方法：降低PH。酸性PH条件下脱氨速 率低于中性和碱性PH，但是PH的降低可能 导致Asp-X（小分子侧链，甘氨酸或丝氨酸） 残基处的裂解或环化。
外消旋作用
二硫键交换 冷冻干燥过程中的变性 凝集、沉淀 表面吸附
控制PH、缓冲液
硫醇的消除（如半胱氨酸） 防冻剂/防失水剂 控制PH、表面活性剂、减低机械压 力 表面活性剂、白蛋白、预饱和
化学稳定性
• 1.PH、水解和缓冲液 • 2.氧化、抗氧化剂和其他抗氧化方法 • 3.其它化学不稳定性及制剂方法
蛋白质药品中添加剂的作用
• • • • 1.抗微生物保藏剂 2.可溶性增强剂 3.冻干产品填充剂 4.等渗溶液添加剂
蛋白质中常见的稳定性与相容性问 题及解决方法
稳定性问题 水解、脱氨（如天冬酰胺） 氧化（如甲硫氨酸氧化） Β-消除反应 转肽作用 可能的解决方案 控制PH、缓冲液、低离子强度 抗氧化剂、螯合剂、低PH、无氧加 工与包装过程 低PH、螯合剂 控制PH、低浓度