973项目、国家自然科学基金项目申请书_干细胞分化表观遗传学调控及其治疗糖尿病应用基础研究

项目名称：干细胞分化表观遗传学调控及其治疗糖尿病应用基础研究

首席科学家：赵春华中国医学科学院基础医学研究

所

起止年限：2011.1 至2015.8

依托部门：卫生部

二、预期目标

1.学术思路

本项目理论依据是按胰和肾的胚胎发育程序诱生胰和肾的器官特异性干/祖细胞。受精卵形成人体最原始的干细胞，后进入器官发育阶段是连续的。但胚胎发育过程中细胞基因表达编程显示阶段特征，从而形成了细胞发育的等级分化概念。器官特异性干细胞作为一个发育阶段其基因表达程序又受控于细胞内外关键信号分子的调控，因此有可能按器官的胚胎发育程序诱导器官特异性干细胞。

干细胞定向分化由复杂的调控网络控制，涉及多个功能基因开启与关闭，转录因子在决定基因是否表达及转录效率起重要作用。而参与其转录调控的组蛋白修饰及核小体重塑尤其是组蛋白甲基化占据核心位置。课题将围绕在ESC/MSC 向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化过程中起关键作用的特异转录因子这个核心，从转录水平和转录后水平阐明基因表达变化、分子间相互作用和正负反馈调节规律和机制，建立以控制定向分化特异转录因子为核心多维动态表观遗传学修饰调控网络。

在此基础上，为干细胞治疗研究领域提供有价值的原始资料和科学依据，为糖尿病、肾病的细胞治疗提供新思路、新材料和新技术。

2.技术途径

图3：项目实施技术路线图

A. 采用人ESC 和人早期中胚层细胞作为种子细胞，按照胰和肾的胚胎发育程序选择诱导因子。

B. 通过sRNA/microRNA 分离和富集关键技术、组合芯片和已商业化的Solexa 测序技术系统解析人内源性sRNA 在干细胞定向分化过程中特征表达谱，阐明内源性sRNA、DNA 甲基化、组蛋白修饰与转录因子等关键靶基因表观遗传学多维网络调控。

C. 采用分子影像示踪技术分析移植细胞体内分化和功能定位，评价动物模

型病损器官中移植细胞的体内组织修复和功能重建。

D. 完成干细胞技术产品的安全性、有效性和稳定性的临床前研究。

3.创新点与特色

A. 建立并获得用于临床移植的胰脏和肾脏干/祖细胞诱导分化体系；明确干细胞治疗体内疗效的影像学评价标准规范；

B. 建立多潜能干细胞向胰岛祖细胞或肾祖细胞定向分化过程中决定分化关

键转录因子与sRNA/microRNA、DNA 甲基化差异图谱及组蛋白修饰的多维动态图谱；

C. 针对糖尿病肾病在国际上首次从种子干细胞诱导分化、体内有效性机制、临床应用安全性等方面进行系统科学设计和验证，具有国际竞争优势，也是本项目特色。

4.可行性分析

A.选择多潜能干细胞诱导成胰肾干/祖细胞作为理想种子细胞研究的可行

性分析

在胚胎干细胞研究方面，本项目团队于2001 年率先在国内建立了人类ESC 系，2007 年建立了国际上第一个基因组完全纯合的人类孤雌ESC 系。目前，利用人类辅助生殖治疗中废弃胚胎已建成国际上最大库容量的人ESC 库，含有245 株的hESC 系，所具有的丰富的遗传背景，为研究ESC 系之间的差异提供了丰富的材料，并能够为人ESC 向胰腺内分泌干/祖细胞诱导分化的研究提供合适的hESC 系。已完成对库中180 株ESC 系的鉴定（Cell Stem Cell，2009），团队也积累了丰富的评价干细胞多能性的技术基础。

在成体干细胞研究方面，本项目团队在国际最早开展了成体干细胞基础研究、应用技术开发和临床应用，将成体干细胞体外规模化制备及其技术应用作为核心目标，重点开展了成体干细胞基础生物学特性及功能评价技术研究，经过

10 年研发首次从人成体组织中分离到多能成体干细胞亚群，并在体内外成功诱

导该类细胞向三胚层多系分化；建立了成体干细胞体外规模化制备工艺及技术体系。以上工作成果为从事ESC 和成体干细胞分离鉴定、细胞生物学特征及分化

机制研究奠定了良好基础。

ESC 及成体干细胞诱导为胰腺及肾组织特异性干细胞，是其调控机制研究及应用于治疗糖尿病及其并发症糖尿病肾病的治疗的关键步骤。基于体外模拟胰腺体内发育规律的思路，本项目已采用改良的四步法，诱导人类孤雌ESC 分化为

有功能的胰岛样细胞团。为研究人ESC 向胰腺干/祖细胞以及胰岛素分泌细胞的诱导分化的相关研究提供基础平台。

Ⅰ. 本项目团队目前已初步建立了人ESC 向胰岛素分泌细胞诱导分化体系。

Ⅱ：本项目已初步建立的成体干细胞向肾组织细胞的体外诱导分化体系。体内移植试验也已经初步提示成体干细胞在治疗肾脏疾病的可行性（Stem Cells Dev.

2010）。

B.开展干细胞分化表观遗传学调控机制研究的可行性分析

大量的试验证据表明：与终末分化的体细胞不同，干细胞和组织前体细胞内

组蛋白修饰和核小体重塑占核心地位，最新研究组蛋白H3 第 4 位和第27 位赖氨酸的三甲基化修饰并存，推测这种bivalent 修饰可能使基因处于一种易于被转录的状态。本项目团队已经鉴定早期中胚层干细胞关键的多胚层转录因子具bivalent 修饰，为开展多系分化诱导研究奠定了基础。

Ⅰ.已发现组蛋白修饰对胰/肾祖细胞分化过程的生物学效应机制

Ⅱ.发现了新的染色质调控因子

基于本项目团队以前鉴定过 3 个新的组蛋白去甲基化酶的工作经历（Nature. 2007. 447(7144):601-5.），在发现和寻找新的染色质调控因子方面已经积累了经验。因此，本项目将继续在发现和寻找如下未知的组蛋白/染色质调控因子方面

开展工作。以期丰富对表观遗传学调控的全貌认识，为找到并鉴定出胰/肾祖细

胞分化过程中发挥重要作用的染色质调控因子打下了良好基础。

C.干细胞体内功能分析评价技术的可行性分析

分析评价干细胞移植治疗糖尿病后在受体内的生物学功能，必须结合干细胞

的标记和示踪。目前本项目团队已经利用分子影像方法进行了干细胞治疗功能评

价的初步研究。

Ⅰ.生物荧光与GFP融合基因的分子影像技术（PLoS ONE, 2009; Stem Cells, 2008; J Mol Cell Cardiol, 2007）。

Ⅱ.报告基因的PET成像技术（J Mol Cell Cardiol, 2007; Cloning Stem Cells, 2007）。

Ⅲ.纳米铁粒子标记干细胞技术（Stem Cells，2008；）。