生物指示剂GMP

17.9 生物指示剂的管理

《中国药典》附录XVⅡ灭菌法中对生物指示剂有较详细的描述。生物指示剂，简称BI，是一类特殊的活微生物制品，是对特定灭菌工艺有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。

17.9.1制备生物指示剂用微生物的基本要求

不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性：菌种的耐受性应大于需灭菌物品中所用可能污染的耐受性；

菌种应无致病性；

菌株应稳定，存活期长，易于保存；

易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。

17.9.2生物指示剂的制备

生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，需先确定所用微生物的特性，如D值等。菌株应用适宜的培养基进行培养。培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应战优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。

生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式。通常是将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也了密封于安瓶中；有的生物指示剂还配有培养基系统。D值与灭菌条件相关外，还与微生物存在的坏境有关。因此，一定形式的生物指示剂制备完成后，应测定D值和孢子总数。生物指示剂应选用合适的材料包装，并设定有效期。载体和包装材料在保护生物指示剂不致污染的同时，还应保证灭菌剂穿透并能与生物指示剂充分接触，载体和包装的设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。

有些生物是指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。

17.9.3生物指示剂的应用

在灭菌程序的验证中，尽管克通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。克使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的耐受性最强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的D值，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。在最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。

过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择微生物指示剂的菌种和把瓶子数量、耐受性和灭菌程序验证羧获得的数据进行评估。

17.9.4常用生物指示剂

湿热灭菌法

湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。D值为1.5~3.0分钟，每片活孢子数5×105~5×106个，在121℃、19分钟下应被完全杀灭。此外，还可使用生胞梭菌孢子，D值为0.4~0.8分钟。

干热灭菌法

干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子。D值大于1.5分钟，每片活孢子数5×105~5×106个。取热原验证时大肠埃希菌内毒素，加量不小于1000细菌内毒素单位。

辐射灭菌法

辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子。每片活孢子数107~108个，置于放射剂

量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌物品中所负载的微生物可能比较短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力，因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量建立的依据。

气体灭菌法

环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子。气态过氧化氢最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。每片活孢子数1×106~5×106个。环氧乙烷灭菌中，枯草芽孢杆菌孢子D 值大于2.5分钟，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿度为60%，温度为54℃下灭菌，60分钟应被杀灭。

过滤除菌法

过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌，用于滤膜孔径为0.22um的滤器；黏质沙雷菌用于滤膜孔径为0.45um的滤器。

17.9.5生物指示剂的实验室管理

生物指示剂作为一种特殊的物料，为了安全、合理地使用，一般应对生物指示剂进行控制管理。

购买的生物指示剂应附有相应的质量报告，内容包括微生物种类、含量、D值、有效期等，实验室在使用前要对BI进行质量复核，进行微生物数量的确认。进行登记并按说明存放。

进行微生物数量确认时，将原BI的所有含有微生物的部分转移到生理盐水中，稀释后进行计数，与质量报告中的数量进行比较。常用的生物指示剂以纸条、不锈钢片等作为载体。对于纸条式生物指示剂，因其不易打碎，可在液体中加入无菌的玻璃珠，然后再震荡打碎，制成纸浆悬液进行计数。

文件要求：典型的微生物数量复核报告包含以下内容。NI含菌确认、生产商、菌名、批号、标示含菌量、D值、效期、稀释过程、稀释倍数、计数结果、每个BI含菌量、是否合格等。可用将BI 的产品质量报告或其复印件与上述文件一起存放。检验合格的BI要经过批准和发放后才可使用。领用时要登记领用人、日期、数量等。