细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
细胞株的复苏、冻存、培养及其基本操作
目录1.目的 (2)2.范围 (2)3.引言、定义和缩略语 (2)4.程序 (2)4.1细胞培养的基本操作 (2)4.2细胞复苏 (3)4.3培养 (3)4.4细胞株冻存 (4)4.5防护 (5)5.登记和归档 (5)5.1登记 (5)5.2归档 (5)6.职责 (5)7.培训 (5)1. 目的本条SOP的目的是规范在体外哺乳动物染色体畸变和基因突变试验的CHL和L5178Y细胞株的冻存、复苏、培养及其相关基本操作规程。
2. 范围本条SOP适用于所有进行该项操作的人员。
3. 引言、定义和缩略语细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物。
4. 程序4.1 细胞培养的基本操作4.1.1 细胞计数体外哺乳动物细胞染色体畸变或基因突变试验中，都需要采用血球计数板进行细胞计数并且该计数结果记录在相应的原始记录中。
4.1.2 细胞清洗4.1.2.1 贴壁细胞的清洗贴壁细胞的清洗是吸出细胞培养物中的原有培养基，加入适当体积（覆盖细胞表层）的Hank`s缓冲液清洗，吸出Hank`s缓冲液。
4.1.2.2 悬浮细胞的清洗悬浮细胞的清洗过程是1000 rpm/min离心细胞培养物5-10mins，弃上清，加入适当体积的Hank`s缓冲液，重悬细胞，1000 rpm/min离心5-10mins，弃上清。
4.1.3 贴壁细胞的消化吸出原有细胞培养液，使用Hank`s清洗细胞1-3次，加入适量的0.25%胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察细胞层直到细胞层发生分散（通常用时5-15分钟），加入含有血清的全培养液，轻轻吹打制备细胞悬液。
备注：在观察细胞消化的过程中，为了避免细胞团块的凝集，不要用力摇晃细胞瓶。
当细胞较难消化时，可将细胞放置在37°C条件下加速消化分离的过程。
4.2 细胞复苏首先将细胞培养基放置在37℃条件预热半小时以上。
将液氮中取出冻存有CHL或L5178Y 细胞株的冻存管迅速放置在37℃水浴锅中。
细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在—70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中,温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容(操作步骤）：一、材料（一)仪器1。
净化工作台2. 离心机3。
恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、—20℃、—70℃）5。
倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：http://www.ebioe。
com/yp/product—list-42。
html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1。
吸头2. 枪头3。
胶塞4。
移液管(10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml)（四)其他物品1。
微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5。
移液枪（五)试剂1。
D—Hanks液2. 小牛血清3。
培养液4。
双抗（青霉素、链霉素）5。
胰蛋白酶(0。
08%）6. 1NHCl7。
7.4%NaHCO38。
DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：http：//www。
ebioe。
com/yp/product-list—43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1。
配制含10%DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液;2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6。
细胞活化与复苏标准操作规程
细胞活化与复苏标准操作规程一、细胞复苏的原则－快速融化必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
二、具体操作1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（使用烧杯盛装37度水也可）（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.迅速解冻（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.平衡离心（将冻存管中的液体倒入离心管中，加入4ml培养基，离心——除去DMSO）用托盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min。
5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
7. 培养培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，37℃和5％CO2换液的时间由细胞情况而定。
易犯错误：1. 水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2. 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3. 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4. 一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
注意事项：对大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。
唯对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5～10ml培养基中，离心300g(约1000rpm)，5分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，培养箱培养。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。
紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。
1.细胞培养液的配制：配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。
将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。
然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。
在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。
1000rpm, 离心3分钟。
弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。
此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
）3.细胞换液：复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。
贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
细胞冷冻及复苏操作流程
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干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。
(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。
2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。
3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。
(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。
(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。
4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。
(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。
(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。
5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。
细胞冻存与复苏 步骤
细胞冻存一、实验用品：二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%含EDTA 的胰蛋白酶、移液器、枪头、玻璃离心管、冻存管二、实验方法1、配细胞冻存液（培养液+保护剂）：DMEM培养基：胎牛血清：DMSO=7:2:1，配成1ml2、过程（1）对数生长期细胞，弃去旧培养液；（2）PBS洗清2-3次细胞（3）0.25%含EDTA胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液，1000r/min 离心5min，弃上清液；（4）加入冻存液，轻轻吹吸均匀（5）按每管1.0ml的量，分装入冻存管，拧紧管盖；（6）在冻存管上做标记，包括细胞代号及冻存日期；（7）分级冷冻：4℃冰箱内30-40min，转入-20℃冰箱60min，放入-80℃冰箱，将冻存管放入-196℃液氮罐中保存。
细胞复苏一、实验用品离心管、培养瓶、尖吸管、无菌试管，胎牛血清，DMEM培养基、大镊子、无菌纱布、二、细胞复苏1、准备工作：（1）将恒温水浴箱中的水温调至37℃（2）离心管、培养瓶，瓶口均过火（3）尖吸管，过火处理后插入无菌试管中（4）配培养液，放入超净台，瓶口过火，盖拧松，待用。
2、复苏和培养：迅速取出冻存管（1）大镊子夹其盖部，在37℃温水中快速摇动，待有残留小冰核时，快速用含有消毒水的纱布擦拭，放入超净台（2）冻存管迅速过火开盖，手持无菌尖吸管将其底部的细胞轻轻吹打起来，转移至刻度离心管中，用过的尖吸管插回原试管中（3）培养瓶盖子打开过火，用另一尖吸管往离心管中加入培养液，拧上盖子，过火（4）1000r/min离心5min（5）离心管管口过火，拧开，过火，液体倒入废液缸，再过火，加入适度含20%的FBS的DMEM新鲜培养液，轻轻吹打离心管底部的细胞，随后将其转移至培养瓶中（6）观察细胞状态，放入5%CO2培养箱中培养。
细胞冻存及复苏步骤
细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。
（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。
2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。
注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。
加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。
3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。
4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。
5.离心800r每分钟，4min。
在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏高博，苏州大学医学部药学院药理学系冻存（1）传统方法：冷存管置于4℃，10 min→ -20℃，30 min→ -80℃ 16～18 h（或隔夜）→液氮罐长期储存。
-20℃不可超过1 h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/min之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮罐中长期储存。
适用于悬浮型细胞与杂交瘤之保存。
一、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，终浓度为10 %，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞传代培养操作，收集培养细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1 ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
二、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（对数生长期，logphase）且存活率高之状态，约为80～90%致密度。
（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（3）注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22 micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
甘油（Glycerol）亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
复苏1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并不断搅动。
使冻存管中的冻存物在1 min之内融化。
2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
细胞冻存和复苏标准操作规程
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：一、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管（10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml）（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. 培养液4. 双抗（青霉素、链霉素）5. 胰蛋白酶（0.08%）6. 1NHCl7. 7.4%NaHCO38. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油四、操作步骤（一）细胞冻存1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
细胞冻存与复苏方法
细胞冻存与复苏方法细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
一、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
二、慢冻程序1、标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25 ℃以上时，1~2 ℃/min；当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。
3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。
三、低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法1、预先配制冻存液10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
液氮长期保存五、保存细胞的复苏方法1、快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
传代细胞的冻存与复苏SOP
1. 目的规范细胞的保存与复苏方法。
2. 范围各种细胞的保存与复苏3. 职责3.1.质量管理部：负责本程序的起草。
3.2.质量管理部QC人员：负责本程序的操作。
3.3.总经理：负责本程序的审批。
4. 定义无5. 引用标准无。
6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1. DMEM培养基6.1.2. 细胞消化液6.1.3. 二甲基亚砜6.2. 仪器设备低速离心机、液氮罐6.3. 器械、用具细胞冻存管、小试管7. 流程图无8. 内容8.1. 细胞保存8.1.1. 将细胞按常规进行消化。
8.1.2. 将消化好的细胞加入小试管中。
8.1.3. 500～1000rpm离心10分钟资料整理8.1.4. 倒掉上清，加入已配制好的细胞保存液中（含10%二甲基亚砜的细胞生长液）8.1.5. 轻轻吹打将细胞悬起，倒入细胞冻存管中。
8.1.6. 做好标记（包括细胞名称、细胞代数、冻存日期）。
将冻存管放入带绳的纱布袋中。
8.1.7. 将纱布袋放入4℃冰箱中预冷2小时。
8.1.8. 再放入-20℃冷冻柜中预冻2小时。
8.1.9. 然后放入液氮中。
做好记录。
在绳上做好标记。
8.2. 细胞的复苏8.2.1．配制细胞生长液8.2.2．准备一杯40℃左右的温水8.2.3．将准备复苏的细胞管从液氮中取出快速放入40℃左右的温水，使其以最短的时间融化。
8.2.4．500～1000rpm低速离心10分钟。
8.2.5. 倒掉上清，用已配制好的细胞生长液将细胞悬起。
8.2.6．转入细胞培养瓶中。
37℃培养。
8.2.7．于次日细胞贴壁后，换掉液体。
9. 注意事项9.1．随时注意观察液氮罐中液氮液面，少于三分之一时及时添加。
9.2．从液氮中取出细胞时，注意不要冻伤。
9.3．把握细胞慢冻快融的原则，细胞复苏后的存活率比较高。
10. 附录及派生记录10.1. 无11. 相关文件无12. 修订记录。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤细胞冻存和复苏听起来像是高深的科学术语，其实说白了，就像把细胞装进冰箱里暂时“冷藏”，然后再拿出来“解冻”一样。
这样做的目的，是为了保存细胞的活性和功能，方便未来的研究或治疗。
那具体怎么操作呢？来，我给你一步步拆解这门科学。
1. 细胞冻存1.1 准备工作首先，你得确保你手头有一切所需的材料。
想象一下，你要出门旅行，得先把行李打包好对吧？冻存细胞也是一样，你需要准备冻存管、冻存液（通常是含有二甲基亚砜（DMSO）的冻存液）、冷冻设备等。
1.2 细胞收集接下来就是收集细胞了。
像是在收集宝贵的珍珠一样，你要小心翼翼地操作。
取出细胞时，要确保培养基是温暖的，细胞在里面像小鱼在水中一样舒适。
把细胞离心后，用吸管轻轻地取出细胞沉淀物，别弄成一团糟。
此时，你的细胞就像小小的珍宝，正准备“打包”进冻存管。
1.3 冻存液准备冻存液的准备很重要。
通常，冻存液里含有二甲基亚砜（DMSO），它能帮助保护细胞免受冷冻过程中冰晶形成的伤害。
用时，一般是按照比例混合好，倒入已经准备好的细胞悬液中，搅拌均匀。
这就像是给你的细胞穿上一件防寒大衣，确保它们在寒冷的“冰箱”里不会感冒。
1.4 冻存过程好了，液体准备好了，接下来就要将细胞放入冻存管中，然后开始冷冻过程了。
细胞冻存管要放进预冷的冰箱里，逐渐降温。
这时候，温度得降得非常缓慢，不能急功近利。
通常，我们会在80°C的冰箱里慢慢降温，直到彻底冻住。
记住，冷冻过程就像等待一锅慢炖汤，急不得。
2. 细胞复苏2.1 取出冻存管当你需要使用冻存的细胞时，首先要把冻存管从冷冻设备里拿出来。
这个步骤就像你从冰箱里拿出刚冷藏好的冰淇淋。
速度要快，不然细胞受热时间过长，可能会损失活性。
拿出来后，立刻放入37°C的水浴中，快速解冻。
2.2 解冻解冻的时候，就像把冰淇淋从冰箱里拿出来放在桌上，过一会儿就开始变得柔软。
细胞的冻存管要在水浴中不断摇晃，确保液体均匀加热。
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
细胞冻存（缓存）
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可
吹打脱落。
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。
（冻存细胞程
序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为
宜。
）
细胞复苏（速溶）
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。
根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
计算存活率
取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％。
标准操作规程(SOP)——细胞的保存和复苏
一、目的细胞的冻存和复苏是细胞培养的基本技术之一。
利用冻存技术可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行细胞的保存和复苏。
三、程序（一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-2，详见生物安全个人防护SOP 。
（二）材料1．生长成片的MDCK 细胞：80%～90%成片，细胞生长良好，存活率高2．二甲基亚砜（DMSO ）(Singma CatNo D-5879)3．胎牛血清（GIBCO CatNo 16000）4．EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na ）（GIBCO CatNo 25300）5．D-MEM 培养液（含有L-谷氨酰胺）（GIBCO CatNo 11965）6．无菌移液管：1mL ，10mL7．37 ℃恒温水浴箱8．细胞生长液（见MDCK 细胞培养SOP ）9．70%～75%的酒精（三）实验步骤1．细胞冻存（1）冻存液的配制：9mL 胎牛血清，1mL 二甲基亚砜。
（2）细胞消化：用EDTA-胰酶消化细胞，具体步骤参见MDCK细胞培养标准操作规程（SOP ）——SOP中的细胞消化过程。
（3）细胞消化后，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。
（4）细胞冻存浓度为1×106/mL。
℃，-70℃过夜，放入液氮长期保存。
℃，-20 2h（5）细胞冻存过程：4 0.5h2．细胞的复苏冻存细胞复苏原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，而导致细胞死亡。
细胞活化后，需要数日或继续传一至二代，其细胞特性才会恢复正常。
（1）将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70%～75%的酒精擦拭外壁后放入生物安全柜内。
（2）配戴防护面罩、防冻手套，从液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧。
（3）立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，用70%～75%酒精擦拭冻存管外部，移入生物安全柜内。
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细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理：
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容（操作步骤）：
一、材料
（一）仪器
1. 净化工作台
2. 离心机
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差显微镜
6. 培养箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
2. 培养瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 废液缸
（三）塑料器皿
1. 吸头
2. 枪头
3. 胶塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
3. 记号笔
4. 医用橡皮膏
5. 移液枪
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培养液
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
四、操作步骤
（一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
3. 离心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二）细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
五、注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。
在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。