二乙烯亚胺对水貂肠炎细小病毒灭活效果的研究

二乙烯亚胺对水貂肠炎细小病毒灭活效果的研究

罗国良;王振军;冯二凯;易立;郭利;叶明;张淼;程悦宁

【摘要】为研究二乙烯亚胺(BEI)对水貂肠炎细小病毒的灭活效果,采用BEI终浓度为0.003mol/L、0.002mol/L、0.001mol/L、0.000 5mol/L,灭活温度为30℃,灭活时间为24h、48h、72h条件下,对水貂肠炎细小病毒进行灭活试验.通过F81细胞传代观察细胞病变和血凝试验检测灭活效果;用水貂检验BEI灭活水貂肠炎细小病毒所制疫苗的安全性,通过检测接种水貂的血凝抑制抗体,评价BEI灭活细小病毒所制疫苗的免疫效果,同时与甲醛灭活的疫苗进行免疫效果比较.结果表明,BEI终浓度0.002mol/L、30℃24h是灭活水貂肠炎细小病毒的适宜参数,BEI灭活工艺制备的水貂肠炎细小病毒灭活疫苗具有良好的安全性,BEI灭活工艺与甲醛灭活工艺的免疫抗体水平差异不显著(P＞0.05).本研究为水貂肠炎细小病毒灭活工艺的研究提供了理论依据.

【期刊名称】《特产研究》

【年(卷),期】2018(040)003

【总页数】4页(P23-26)

【关键词】水貂肠炎细小病毒;二乙烯亚胺;灭活效果

【作者】罗国良;王振军;冯二凯;易立;郭利;叶明;张淼;程悦宁

【作者单位】中国农业科学院特产研究所,长春130112;中国农业科学院特产研究所,长春130112;中国农业科学院特产研究所,长春130112;中国农业科学院特产研究所,长春130112;中国农业科学院特产研究所,长春130112;吉林特研生物技术有

限责任公司,长春 130122;吉林特研生物技术有限责任公司,长春 130122;中国农业科学院特产研究所,长春130112

【正文语种】中文

【中图分类】S852.65+5

水貂病毒性肠炎又称水貂细小病毒性肠炎，是由水貂肠炎细小病毒（Mink enteritis virus，MEV）引起的以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性和高度接触性传染病。在自然条件下，不同品种和不同年龄的水貂均有感染性，但幼貂的感染性极强。水貂病毒性肠炎没有特异性的治疗药物，疫苗接种是控制该病流行的有效手段。

目前，用于水貂肠炎细小病毒免疫预防的常规疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗常用的传统灭活剂为甲醛，甲醛灭活工艺虽能取得较好的灭活效果，但甲醛易破坏病毒的免疫原性，且其残留易引起机体应激反应。二乙烯亚胺是烷化剂的一种，作为另一类良好的病毒灭活剂，仅破坏病毒的核酸，而不影响蛋白成分结构，能最大程度保持病毒的抗原性[1]，近年来已应用于猪细小病毒[2]、猫杯状病毒[3]、伪狂犬病毒[4]、口蹄疫病毒[5]等多种病毒的灭活，并取得良好的免疫效果。本试

验通过使用不同终浓度的二乙烯亚胺（Binary ethylenimine，BEI）对 MEV 进行不同时间的灭活，确定BEI灭活参数，并对BEI灭活和甲醛灭活的水貂肠炎细小病毒灭活疫苗进行了免疫效果对比。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞水貂肠炎细小病毒MEVB株（中国农业科学院特产研究所保存）；F81细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供）。

1.1.2 主要试剂 MEM培养基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning公司），2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）（Sigma-Aldrich公司），甲醛（国药集团），其它试剂为国产分析纯。

1.1.3 实验动物水貂，购自农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站。

1.2 方法

1.2.1 BEI的配制用0.2N NaOH溶液配制0.1mol/L的BEA溶液，在37℃下作用，其间每隔10min～15min振摇1次，作用60min即成0.1mol/L的BEI溶液，然后0.22µm滤器过滤除菌。

1.2.2 MEVB灭活试验随机取MEVB病毒液5瓶，500mL/瓶，4瓶病毒液按终浓度为 0.003mol/L、0.002mol/L、0.001mol/L、0.000 5mol/L分别加入BEI溶液，另1瓶病毒液按终浓度为0.15%加入甲醛溶液。以上5瓶病毒液与灭活剂充分混匀，于30℃灭活，分别于24h、48h、72h取样进行灭活检验，用BEI灭活的病

毒液于72h取完样后加入 BEI使用量的10%的1mol/L硫代硫酸钠中和BEI。

1.2.3 灭活检验取灭活病毒液，用无血清MEM 1∶5稀释后分别同步接种F81细

胞4瓶，每瓶0.5mL，置37℃下培养，24h后换维持液，继续培养3日后再传1代，观察有无细胞病变，收获培养液进行血凝试验，检测其对猪红细胞的血凝价。

1.2.4 灭活疫苗的制备取经灭活检验合格的病毒液（BEI灭活浓度为0.002mol/L、灭活时间24h），按病毒液∶氢氧化铝胶＝9∶1的比例制成水貂肠炎细小病毒灭

活疫苗，按现行《中国兽药典》附录进行性状和无菌检验。

1.2.5 灭活疫苗安全试验取制备的疫苗肌肉注射健康易感水貂〔水貂肠炎细小病毒血凝抑制抗体（HI）≤1∶4〕5只，每只水貂 5mL，分4点注射，观察10d，观

测精神、食欲、体温、粪便与接种部有无异常反应。

1.2.6 灭活疫苗效力试验用2月龄～10月龄健康易感水貂 5只（水貂肠炎细小病

毒 HI抗体效价≤1∶4），分别肌肉接种BEI疫苗1mL；另设甲醛灭活疫苗组水貂

5只，肌肉接种1mL/只，作为平行对照，21d后，连同阴性对照水貂5只，分别采血，测定HI抗体效价。

2 结果

2.1 不同浓度BEI灭活效果

BEI灭活浓度＞0.002mol/L时，灭活24h以后的样品均未出现CPE，传代后未出现CPE，亦没有检测出血凝价。BEI灭活浓度为0.001mol/L时，灭活24h可检出CPE，传代后亦出现CPE，且均检测出血凝价；灭活48h以上时，样品均未出CPE，传代后未出现CPE，亦没有检测出血凝价。BEI灭活浓度为0.000 5mol/L 时，灭活时间为24h和48h时均可检出CPE，传代后亦出现CPE，且均检测出血凝价。为了确保疫苗制备过程的灭活效果，同时提高制备效率，确定水貂肠炎细小病毒的灭活条件为BEI终浓度为0.002mol/L、灭活时间24h、灭活温度30℃，灭活完毕加入BEI使用量10%的1mol/L硫代硫酸钠中和BEI。结果见表1。

2.2 疫苗的制备结果

制备的疫苗呈粉红色均匀混悬液，静置后，上层为粉红色澄清液体，下层为淡粉红色沉淀，摇匀后呈均匀混悬液。经无菌检验，符合规定。

表1 BEI灭活MEVB试验灭活检验结果Table 1 The inactivation effect of binary ethylenimine on mink enteritis virus组别Group灭活剂Inactivator浓度Concentration代次Generation检测项目Test item灭活作用时间（h）Inactivation time 24 48 72 1 2 3 BEI 0.003mol/L 0.002mol/L 0.001mol/L 1 2 1 2 1 2 CPE―――HA 0 0 0 CPE―――HA 0 0 0 CPE―――HA 0 0 0 CPE―――HA 0 0 0 CPE+――HA 1∶8 0 0 CPE+――HA 1∶32 0 0 4 0.000 5mol/L 1 2 CPE ++ + ―HA 1∶64 1:8 0 CPE +++ + ―HA 1∶128 1:16 0 1 CPE―――HA 0 0 0 5甲醛Formaldehyde 0.15%2 CPE―――HA 0 0 0

2.3 疫苗安全试验结果