生物化学实验 实验五 脂质的提取及薄层层析
薄层色谱层析操作规程
薄层色谱层析操作规程1. 引言薄层色谱（TLC）是一种常用的分离和分析技术，适用于有机物和天然产物的检测、纯化和鉴定。
本操作规程旨在提供一种标准化的TLC操作步骤，以确保结果的准确性和可重复性。
2. 实验材料和仪器设备•薄层色谱板：选择合适的固定相和基底材料的薄层色谱板。
•检测溶剂：根据需要选择合适的溶剂，常用的有乙醚、醋酸乙酯、甲醇、正己烷等。
•样品：准备待测物的溶液或提取液。
•试剂：例如显色剂、定位剂等。
•色谱槽：用于放置色谱板的槽状容器。
•喷雾开发箱：用于显色和可视化样品。
3. 操作步骤3.1 准备工作1.检查薄层色谱板是否完整，如有损坏需更换。
2.在色谱板上使用铅笔标记出样品和参比物的位置。
3.2 样品处理1.准备待测物的溶液或提取液，并将其过滤以去除杂质。
2.如需测定混合物中的成分，可先进行分离提取。
3.3 上样1.使用微量锥或玻璃管在标记位置上均匀地涂抹样品。
2.上样后务必避免接触色谱板其他区域。
3.4 开发1.将色谱板放置在色谱槽中，加入适当的检测溶剂。
注意溶剂的选择应根据待测物的性质和溶解性来确定。
2.等待溶剂上升至足够高度，将色谱板取出并迅速标记并扫描涂点位置。
3.5 显色和观察1.将色谱板放入喷雾开发箱中，并加入适当的显色剂。
2.等待显色剂完全插入后，将色谱板取出并进行观察。
3.6 数据处理1.使用适当的测量工具，如图像分析软件，测量色谱带的迁移距离和Rf值。
2.进行定性和定量分析，根据需要绘制色谱图。
4. 安全注意事项1.使用化学品和有机溶剂时必须戴上防护手套和防护眼镜，以防止溅入眼睛或与皮肤接触。
2.所有操作需在通风良好的实验室中进行，避免吸入有害气体。
3.注意操作时避免产生火源，如禁止吸烟和使用明火。
4.做好废弃物的处理工作，避免对环境造成污染。
5. 结论本操作规程提供了一套标准化的薄层色谱层析操作步骤，涵盖了样品准备、上样、开发、显色和观察、数据处理等关键步骤。
通过遵守操作规程和安全注意事项，可以准确、高效地进行薄层色谱层析实验，并获得可靠的结果。
有机化学实验实验五 菠菜色素的提取和薄层色谱
片载玻片用肥皂水和水洗涤干净，再用碎滤纸吸干玻片上的水
分，然后将其重叠在一起，用手夹住片的上端，慢慢浸入已调
好的浆液浸涂2s左右（上端留一些不浸涂），然后缓慢地将载 玻片从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用 抹布轻轻地擦去，小心将两片分开，放在磁盘中。待浆料自然 干燥后放入烘箱，在105～110℃下活化，约30min就制成了薄层
见下图所示。 第二块板重复做一次，选择较好的一块板进行测量Rf值。
溶剂前沿 斑点 d溶剂 d斑点 点样线 原斑点
影响Rf值的因素很多，如样品的结构、吸附剂和展开剂的性 质、温度以及薄层板的质量等。当这些条件都固定时，化合物
的比移值Rf是一个特性常数。但由于实验条件容易改变而不易
固定，因此在鉴定一个具体化合物，经常采用与已知标准样 品对照的方法。
剂）、硅胶G（含黏合剂）和硅胶HF（含荧光物质，可在 紫外光下观察）等。氧化铝同样也可分为以上几种类型。
展开剂（流动相）：也称洗脱剂，在色谱过程中起到将吸附
在固定相上的样品洗脱的作用。 选择展开剂时应考虑样品的极性、溶解度和吸附剂的活性 等因素。展开剂的极性越大，对化合物的解吸附（洗脱）能力 就越大，即Rf值就越大。如选用一种溶剂（展开剂）后发现其
样品成分的Rf值都比较大，则可换用一种极性较小的展开剂，
也可在原展开剂中加入一种极性较小的溶剂。展开剂的洗脱能 力按下列次序递增：已烷，四氯化碳，甲苯，苯，二氯甲烷， 氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，丙醇，乙醇，甲醇，水。
2、比移值的计算 Rf值计算如下：
Rf＝d斑/d剂＝物质所移动的距离/溶剂前沿移动的距离
（4）展开 将展开剂倒入展开瓶或合适的广口瓶中，使液面 在样点的下方，不要接触到样点，否则样点会被溶入展开剂中无 法进行展开。 将薄层板小心斜放在展开瓶中盖好盖，观察展开剂通过毛细管 作用沿板上行。此时溶剂上行很快，必须留心观察。当展开剂上 行至距离涂层顶端约5mm时，将板小心取出，用铅笔做好溶剂前 沿的位置记号。样点各组分随展开剂上行同时被展开在各个部位 而形成各个有色斑点，取斑点的中心位置做好记号。如果斑点没 有颜色就用显色法使斑点显示出来。一种是在色谱缸中或密闭的 容器中放入几粒碘，把展开后的薄层板放入，待斑点明显时取出 做好记号。另一种是带有荧光的硅胶可用紫外灯照射观察斑点。
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃）8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
薄层层析实验报告
薄层层析实验报告1. 引言薄层层析是一种常用于分离和鉴定化合物的分析方法。
其原理是利用化合物在固定相（薄层）上的分配系数不同，通过流动相的上升或下降来实现化合物的分离。
本实验旨在通过薄层层析法对给定的混合物进行分离和鉴定。
2. 实验材料和方法2.1 实验材料•给定的混合物样品•薄层层析板•层析溶剂：苯-乙酸乙酯（4:1）2.2 实验步骤1.将薄层层析板在气流或加热座上预热10分钟，使其温度稳定在室温。
2.在薄层层析板上使用铅笔或作记号笔标记线条。
通常使用2 cm和4cm的两条线作为上样线和运动相前进距离的参考线。
3.在上样线上将混合物样品均匀地涂抹在薄层层析板上。
4.将涂抹好的薄层层析板放入含有层析溶剂的玻璃层析槽中，使样品的底部轻轻浸入溶剂中。
5.等待溶剂上升或下降，直到达到预定的距离。
然后，从槽中取出薄层层析板并快速用热风吹干。
6.使用紫外灯或显色剂观察薄层层析板上的色带，并记录相应的Rf值。
3. 结果和讨论根据实验步骤中描述的方法，我们成功地进行了薄层层析实验。
观察到在薄层层析板上出现了多个色带，在紫外灯下或者使用显色剂后，这些色带更加清晰可见。
通过测量色带的迁移距离和计算Rf值，我们可以对混合物样品进行初步的分离和鉴定。
Rf值是层析分离中的一个重要参数，定义为色带中与运动相前进距离之比。
通过比较所得色带的Rf值和已知化合物的Rf值，我们可以初步推测混合物样品中的化合物成分。
值得注意的是，在薄层层析实验中，选择适当的层析溶剂非常重要。
溶剂的选择应考虑到样品的性质和分离目标，以便提高分离效果和色带的清晰度。
在本实验中，我们使用了苯-乙酸乙酯（4:1）作为层析溶剂，该溶剂对于一些极性和非极性化合物具有较好的分离效果。
薄层层析作为一种简便、快速的分析方法，在实际应用中具有广泛的用途。
它可以作为化学实验室中常规的分离和鉴定方法，并且可以用于大量样品的高通量分析。
4. 结论通过薄层层析实验，我们成功地对给定的混合物样品进行了分离和鉴定。
生物化学实验-层析实验
结果解释
实验结论
根据实验结果分析，得出实验的结论，如各组分的含量、比例以及 分离效果等。
结果解释
对实验结果进行合理解释，包括组分性质、分离原理等方面的解释。
误差分析
对实验结果进行误差分析，找出可能影响实验结果的因素，提高实 验的准确性和可靠性。
05
层析实验注意事项
安全注意事项
避免使用过期试剂
过期的试剂可能含有有害物质或产生 不稳定的结果，应避免使用。
要点二
检测程序
设置检测程序，控制检测器的参数，进行实时监测和记录 数据。
04
层析实验结果分析
数据记录
实验数据
在层析实验中，需要详细记录实 验过程中的各项数据，包括洗脱 液的体积、流速、检测波长等。
图像记录
层析实验通常伴随着色谱图的生 成，需要准确记录色谱图，包括 峰高、峰面积等关键信息。
异常情况记录
生物化学实验-层析实验
目录
• 层析实验简介 • 层析实验的种类 • 层析实验操作流程 • 层析实验结果分析 • 层析实验注意事项
01
层析实验简介
层析实验的定义
层析实验是一种分离和纯化混合物中 各组分的方法，利用不同物质在固定 相和流动相之间的分配差异进行分离。
它是一种常用的生物化学实验技术， 广泛应用于生物、医学、药学等领域。
使用高质量的试剂可以减少实验误差，提高 实验结果的准确性。
重复实验
对实验结果进行重复验证，以减少误差并提 高结果的可靠性。
标准化操作
按照标准化的操作步骤进行实验，避免因操 作不当导致误差。
数据处理
对实验数据进行正确的处理和分析，以减少 误差并得出准确的结论。
实验结果可靠性评估
薄层层析实验报告
一、实验目的1. 掌握薄层层析的基本原理和操作方法。
2. 了解薄层层析在有机化合物分离和鉴定中的应用。
3. 通过实验，学会如何根据Rf值对化合物进行鉴定。
二、实验原理薄层层析是一种常用的色谱分离技术，其基本原理是利用混合物中各组分在固定相和流动相之间的相互作用力差异，通过展开剂在固定相上的流动，使各组分在薄层板上发生不同的迁移，从而达到分离的目的。
Rf值（比移值）是衡量化合物在薄层板上迁移距离与展开剂迁移距离的比值，用于鉴定化合物。
三、实验仪器与药品1. 仪器：薄层层析板、点样器、层析缸、展开剂、显色剂、烘箱、天平等。
2. 药品：待分离的混合物、硅胶、溶剂、显色剂等。
四、实验步骤1. 薄层层析板的制备（1）称取适量硅胶，加入适量的水，搅拌均匀，待石膏开始固化时，再加入少许水，调成匀浆。
（2）将匀浆均匀地涂布在薄层板上，轻轻敲打使其平整。
（3）将涂布好的薄层板放入烘箱中，105℃烘烤活化0.5小时。
2. 点样（1）在薄层板下端2.0cm处，用铅笔轻轻划一条起始线，并在点样处用铅笔作一标记为原点。
（2）用点样器蘸取待分离的混合物，点于原点上，注意点样量不宜过多。
3. 展开剂的选择与准备（1）根据待分离化合物的性质选择合适的展开剂。
（2）将展开剂倒入层析缸中，液面略低于薄层板下端。
4. 展开与显色（1）将点好样的薄层板放入层析缸中，密封。
（2）待展开剂上升至薄层板上端后，取出薄层板，晾干。
（3）用显色剂对薄层板进行显色，观察各化合物的斑点。
5. 结果分析（1）记录各化合物的Rf值。
（2）根据Rf值对化合物进行鉴定。
五、实验结果与分析1. 实验结果根据实验数据，得到以下化合物的Rf值：- 化合物A：Rf = 0.5- 化合物B：Rf = 0.7- 化合物C：Rf = 0.92. 结果分析根据Rf值，可以初步判断各化合物的性质。
在本实验中，化合物A、B、C的Rf值依次增大，说明它们在薄层板上的迁移速度依次变快，可能为不同极性的化合物。
实验五 类胡萝卜素的提取和薄层色谱
图2 β－胡萝卜素分子结构
薄层色谱
薄层色谱又称为薄层层析,属于固-液吸附色谱。其基本原理是 利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不 同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复 的吸附或分配作用，从而使各组分分离。它的优点是：所需样品 少；展开时间短；分离效率高；而且不需特殊仪器，操作方便。 薄层色谱是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技 术，也用于跟踪反应进程。
展开剂（流动相）：也称洗脱剂，在色谱过程中起到将吸附 在固定相上的样品洗脱的作用。
选择展开剂时应考虑样品的极性、溶解度和吸附剂的活性 等因素。展开剂的极性越大，对化合物的解吸附（洗脱）能力 就越大，即Rf值就越大。如选用一种溶剂（展开剂）后发现其 样品成分的Rf值都比较大，则可换用一种极性较小的展开剂， 也可在原展开剂中加入一种极性较小的溶剂。展开剂的洗脱能 力按下列次序递增：已烷，四氯化碳，甲苯，苯，二氯甲烷， 氯仿，乙醚，乙酸乙酯，丙酮，丙醇，乙醇，甲醇，水。
三、基本操作
1、薄层色谱的操作步骤：
（1）制浆 浆液的制备可分为干法和湿法。干法是将选好的 硅胶G慢慢倒入溶剂中调成糊状备用。湿法是将水和硅胶G按1 ：4的比例在搅拌下将硅胶G慢慢地倒入水中调成糊状，不要反 过来加，防止形成团块。湿法制浆要在使用前调制，否则浆料 容易凝固结块。
(2)涂片 大量使用可用涂布器涂布。简单的涂布方法是将两片 载玻片用肥皂水和水洗涤干净，再用碎滤纸吸干玻片上的水分， 然后将其重叠在一起，用手夹住片的上端，慢慢浸入已调好的 浆液浸涂2s左右（上端留一些不浸涂），然后缓慢地将载玻片 从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用抹布 轻轻地擦去，小心将两片分开，放在磁盘中。待浆料自然干燥 后放入烘箱，在105～110℃下活化，约30min就制成了薄层板， 取出来进行点样。
脂类薄层层析法及其应用
脂类薄层层析法及其应用
脂类薄层层析法是一种常用的分离和鉴定脂类的方法。
它是一种基于分子大小、极性和亲水性的分离技术，可以用于分离和鉴定各种脂类，如脂肪酸、甘油三酯、磷脂等。
脂类薄层层析法的原理是将待分离的脂类样品溶解在合适的溶剂中，然后将其涂抹在薄层层析板上，再将薄层层析板放入层析槽中，加入适当的层析剂，使样品在薄层层析板上进行分离。
分离后，可以通过显色或紫外线照射等方法进行检测和鉴定。
脂类薄层层析法具有操作简便、分离效果好、分离时间短等优点，因此被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。
例如，在食品领域中，脂类薄层层析法可以用于检测食品中的脂肪酸、甘油三酯等成分，以保证食品的质量和安全性。
在医药领域中，脂类薄层层析法可以用于分离和鉴定药物中的脂类成分，以确定药物的纯度和质量。
脂类薄层层析法是一种简便、有效的分离和鉴定脂类的方法，具有广泛的应用前景。
在未来的研究中，我们可以进一步探索其在不同领域的应用，以推动其在实践中的发展和应用。
薄层层析实验报告
薄层层析实验报告篇一：薄层色谱法实验报告有机化学第二课堂实验报告一，基本信息姓名：年级：XX级专业层次：队别：日期：XX年5月23日实验室：有机化学实验室二二、实验报告正文实验题目：薄层板的制作及薄层色谱的应用实验目的掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用。
实验原理1.有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同，当展开剂流经吸附剂时，有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前，而吸附力弱的组分则滞后，由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。
物质被分离后在图谱上的位置，常用比移值Rf表示。
Rf?原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离实验仪器与药品实验仪器：硅胶层析板两块，卧式层析槽一个，点样用毛细管，紫外荧光灯，铅笔暖风机、载玻片、钢勺、镊子等药品：碱性湖蓝与荧光黄混合样品、咖啡因与阿司匹林混合样品、阿司匹林纯样品二氯乙烷层析液、95%的乙醇溶液，硅胶粉、5%的羧甲基纤维素钠（CMC）的水溶液等仪器装置图“浸有层析板的层析槽”图1-层析缸（广口瓶），2-薄层板，4-层析液实验步骤（1）薄层板的制备：(本文来自： 小草范文网:薄层层析实验报告)取3g 硅胶G粉于研钵中，加相当于8ml左右的用5%的羧甲基纤维素钠（CMC）的水溶液，用力研磨1-2分钟，至成糊状后立即倒在准备好的薄层板中心线上，快速左右倾斜，使糊状物均匀地分布在整个板面上，厚度约为0.25mm,然后平放于平的桌面上干燥15分钟，再放入100℃的烘箱内活化2小时，取出放入干燥器内保存备用。
（2）点样。
在层析板下端1.0cm处，（用铅笔轻化一起始线，并在点样出用铅笔作一记号为原点。
）取拉好的毛细点样管，分别蘸取咖啡因与阿司匹林混合样品、阿司匹林纯样品，点于原点上（注意点样用的毛细管不能混用，毛细管不能将薄层板表面弄破，样品斑点直径在1到2mm为宜！斑点间距稍大一点。
点样次数5到7次）另取一块薄层板，点碱性湖蓝与荧光黄混合样品。
实验五 层析实验
分子量适用范围为1，500～30，000。
血红蛋白本身有红色，鱼精蛋白无色，故将黄色的DNP（2，4–二 硝基氟苯）偶联于鱼精蛋白，使其着色，便于观察。
【操作步骤】 1．凝胶的准备 称取l g Sephadex G–50，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml， 沸水浴中放置1小时，冷至室温备用。 2．装柱 取直径0.8～1.2cm，长25～30cm的层析柱一支，垂直安装于铁 架台上。底部填少许玻璃纤维，下部装一“再”形夹以调节流速（见 图4-1）。首先关闭“再”形夹，自顶部缓缓加入上述备用的 Sephadex G–50 悬液，待底部凝胶沉积1～2cm时，打开“再”形夹， 并边缓加Sephadex G–50悬液，边调整适当流速，至凝胶层积集约 18cm高，停止加Sephadex G–50悬液，连通洗脱液，进行平衡（调整 流速）。操作过程中，应防止气泡进入和凝胶分层现象。 3．样品制备 临上样前，将0.3ml血红蛋白溶液和0.5ml DNP–鱼精蛋白溶 液混匀即可。 4．加样与洗脱 切断洗脱液，当层析柱中液面下降与凝胶表层平齐时， 即用滴管将样品液缓缓沿柱壁加入，不使凝胶表层扰动，待样品液面 与凝胶表层平齐时，再加少许蒸馏水，开始洗脱。注意观察层析柱中 红色的血红蛋白与黄色的DNP–鱼精蛋白分离的情况，记录现象。
【操作步骤】
1．填料的预处理：在一只100ml烧杯中，置约10g树脂，加2M HCl 25ml，
搅匀，放置2小时，倾弃上层酸液，蒸馏水洗3次，再加2 M NaOH 25ml， 搅匀，放置2小时，倾弃上层碱液，用蒸馏水洗至中性（pH试纸检查）。 将树脂悬浮于大约50ml pH 2.2的0.1M柠檬酸缓冲液中备用。
影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或 一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。
生化实验思考题参考答案解析[1]
![生化实验思考题参考答案解析[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/1ee73bc248649b6648d7c1c708a1284ac8500524.png)
⽣化实验思考题参考答案解析[1]⽣化实验讲义思考题参考答案实验⼀淀粉的提取和⽔解1、实验材料的选择依据是什么？答：⽣化实验的材料选择原则是含量⾼、来源丰富、制备⼯艺简单、成本低。
从科研⼯作的⾓度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和⽣长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和⽣理状态等，微⽣物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差异等。
2、材料的破碎⽅法有哪些？答：(1) 机械的⽅法：包括研磨法、组织捣碎法；(2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等；(3) 化学与⽣物化学⽅法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。
实验⼆总糖与还原糖的测定1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定⽅法各有何优缺点？答: 我们采⽤的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。
间接法的优点是操作简便、反应条件温和，缺点是在⽣成单质碘和转移反应产物的过程中容易引⼊误差；直接法的优点是反应原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。
实验五粗脂肪的定量测定─索⽒提取法（1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单⼀组分的脂类成分，可⽤什么⽅法进⼀步处理？答：硅胶柱层析，⾼效液相⾊谱，⽓相⾊谱等。
（2）本实验样品制备时烘⼲为什么要避免过热?答：防⽌脂质被氧化。
实验六蛋⽩质等电点测定1、在等电点时蛋⽩质溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋⽩质的胶体性质加以说明。
蛋⽩质是两性电解质，在等电点时分⼦所带净电荷为零，分⼦间因碰撞⽽聚沉倾向增加，溶液的粘度、渗透压减到最低，溶解度最低。
结果中pH约为4.9时，溶液最浑浊，达到等电点。
答：2、在分离蛋⽩质的时候，等电点有何实际应⽤价值？答: 在等电点时，蛋⽩质分⼦与分⼦间因碰撞⽽引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋⽩质最容易沉淀。
在分离蛋⽩质的时候，可以根据待分离的蛋⽩质的等电点，有⽬的地调节溶液的pH使该蛋⽩质沉淀下来，从⽽与其他处于溶液状态的杂质蛋⽩质分离。
00 生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-层析技术
层析技术层析法又称色谱法或色层法，开始由分离植物色素而得名，后来不仅用于分离有色物质，而且在多数情况是用于分离无色物质。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，此种方法可以分离和鉴定性质极为相似，而且用一般化学方法难以分离的多种化合物，如氨基酸、蛋白质、糖、脂类、核苷酸、核酸等。
一、层析的基本原理层析法是利用混合物各组分物理化学性质（溶解度、吸附能力、电荷、分子大小与形状及分子亲和力等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相即流过此固定相的液体或气体称流动相，从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。
在层析过程中，溶质在固定相和流动相中差速迁移，它既可进入固定相，又可进入流动相，这个过程叫分配过程，不论层析机理属于哪一种，分配过程都存在。
分配过程进行的速度，可用分配系数K 表示：K ＝比值K 在低浓度时是个常数，只受温度影响。
不同的层析机理，K 的含义不同。
在吸附层析中， K 为吸附平衡常数；在分配层析中，K 为分配系数；在离子交换层析中，K 为交换常数；在亲和层析中，K 为亲和系数。
混合物中各组分的分配系数往往是不同的，即保留在固定相中的特性是不同的。
常用保留时间，即被分析样品从进样开始到流出液中出现浓度极大点的时间；或保留体积，即被分析样品从进样开始到流出液中出现浓度极大点时，所通过流动相的体积来衡量。
分配系数K 值大，说明该物质在柱中被吸附得牢，移动速度慢，在固定相中停留的时间长，将最后出现在洗脱液中亦既保留体积大，保留时间长。
反之，如K 值小，即这种物质在柱中被吸附得弱，移动速度快，将首先出现在洗脱液中。
亦既保留体积小，保留时间短。
可见混合物中各组分之间分配系数K 值相差愈大，各物质愈容易彼此分开。
如果K ＝ 0, 就意味这溶质不能进入固定相，而始终保留在流动相里，并随着流动相迅速的流出。
显然，这种固定相和流动相体系是不能实现分离的。
因此，应当根据被分离物质的化学结构和性质（极性）适当的选择固定相和流动相，并且使各组分的分配系数尽可能大一些，就可以使混合物中各组分分离完全。
脂质的提取、分离与分析
脂质存在于细胞、细胞器和细胞外的体液如血浆、胆汁、乳和肠液中。
欲研究某一特定部分（例如红细胞、脂蛋白或线粒体）的脂质，首先须将这部分组织或细胞分离出来。
由于脂质不溶于水，从组织中提取和随后的分级分离都要求使用有机溶剂和某些特殊技术，这与纯化水溶性分子如蛋白质和糖是很不相同的。
一般说，脂质混合物的分离是根据它们的极性差别或在非极性溶剂中的溶解度差别进行的。
含酯键连接或酰胺键连接的脂肪酸可用酸或碱处理，水解成可用于分析的成分。
（一）脂质的有机溶剂提取非极性脂质（三酰甘油、蜡和色素等）用乙醚、氯仿或苯等很容易从组织中提取出来，在这些溶剂中不会发生因疏水作用引起的脂质聚集。
膜脂（磷脂、糖脂、固醇等）要用极性有机溶剂如乙醇或甲醇提取，这种溶剂既能降低脂质分子间的疏水作用，又能减弱膜脂与膜蛋白之间的氢键结合和静电相互作用。
常用的提取剂是氯仿、甲醇和水（1:2:0.8，V/V/V）的混合液。
此比例的混合液是混溶的，形成一个相。
组织（例如肝）在此混合液中被匀浆以提取所有脂质，匀浆后形成的不溶物包括蛋白质、核酸和多糖用离心或过滤方法除去。
向所得的提取液加入过量的水使之分成两个相，上相是甲醇/水，下相是氯仿。
脂质留在氯仿相，极性大的分子如蛋白质、多糖进入极性相。
取出氯仿相并蒸发浓缩，取一部分干燥，称重。
（二）脂质的色谱分离被提取的脂质混合物可采用色谱方法进行分级分离。
例如硅胶柱吸附层析可把脂质分成非极性、极性和荷电的多个组分。
硅胶是硅酸的一种形式，一种极性的不溶物。
当脂质混合物通过硅胶柱时，由于极性的荷电的脂质与硅胶结合紧密被留在柱上，非极性脂质则直接通过柱子，出现在最先的氯仿流出液中，不荷电的极性脂质（例如脑苷脂）可用丙酮洗脱，极性大的或荷电的脂质（如磷脂）可用甲醇洗脱。
分别收集各个组分，再在不同系统中层析，以分离单个脂质组分。
例如磷脂可分离成磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺等。
此外可采用更快速，分辨率更高的高效液相色谱HPLC和薄层层析TLC进行脂质分离。
生物化学实验层析技术和原理
生物化学实验层析技术和原理层析技术的原理是，流动相沿固定相或凝胶材料均匀流动，并与样品中的成分发生相互作用。
在这个过程中，不同成分的分布系数不同，一部分样品成分将分配到固定相上，而其他成分将留在流动相中。
随着流动剂的稳定流动，样品成分会相对稳定地分布在固定相和流动相之间，从而实现分离。
层析实验中最常用的固定相是硅胶或氨基硅胶。
这两种固定相具有相亲性和分离成分的能力。
流动相（也称为溶剂）的选择取决于样品性质和需要分离的成分。
流动相可以是有机溶剂或水溶液，通常会根据不同的系统进行优化。
层析技术主要有几种类型：薄层层析、柱层析、凝胶层析和高效液相层析（HPLC）。
薄层层析是最简单和最常见的层析方法之一、它使用涂覆在玻璃或塑料板上的薄层介质，如硅胶或氯化铝，将样品分离成各个成分。
样品在薄层介质上展开，然后通过浸泡或喷涂内外的化学试剂来显色，以使成分显示为不同的带状。
可以使用紫外线或其他光源进行检测和定量。
柱层析也是常用的分离技术之一、它通常使用石英柱或玻璃柱作为固定相，流动相通过柱子进行分离。
样品在柱子上负荷后，使用适当流动相进行洗脱。
根据样品的性质和需要，可以选择不同类型的柱子和流动相。
例如，在反相层析中，疏水性柱子配合有机溶剂流动相可分离疏水性成分。
凝胶层析使用凝胶作为固定相，通常使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
在凝胶层析中，样品分子通过固定凝胶孔隙之间的透明度差异进行分离。
根据样品的大小和需要进行选择凝胶孔隙的大小，以实现目标成分的分离。
HPLC是一种高效、自动化和精确的层析技术。
它使用高压泵将流动相推入柱子中，并使用检测器实时监测和记录分离的成分。
HPLC通常选择高分辨率的固定相，如硅胶、氨基硅胶或C18柱。
HPLC可以根据需要使用各种流动相和检测器，例如紫外光检测器或质谱检测器。
层析技术在生物化学领域中具有广泛的应用。
它可以用于从生物样品中纯化蛋白质、核酸、酶和药物等目标物质。
层析技术的选择取决于样品的特性、目标物的大小和属性，还有需要分离和纯化的成分的数量。
脂质的提取、分离与分析
脂质存在于细胞、细胞器和细胞外的体液如血浆、胆汁、乳和肠液中。
欲研究某一特定部分（例如红细胞、脂蛋白或线粒体）的脂质，首先须将这部分组织或细胞分离出来。
由于脂质不溶于水，从组织中提取和随后的分级分离都要求使用有机溶剂和某些特殊技术，这与纯化水溶性分子如蛋白质和糖是很不相同的。
一般说，脂质混合物的分离是根据它们的极性差别或在非极性溶剂中的溶解度差别进行的。
含酯键连接或酰胺键连接的脂肪酸可用酸或碱处理，水解成可用于分析的成分。
（一）脂质的有机溶剂提取非极性脂质（三酰甘油、蜡和色素等）用乙醚、氯仿或苯等很容易从组织中提取出来，在这些溶剂中不会发生因疏水作用引起的脂质聚集。
膜脂（磷脂、糖脂、固醇等）要用极性有机溶剂如乙醇或甲醇提取，这种溶剂既能降低脂质分子间的疏水作用，又能减弱膜脂与膜蛋白之间的氢键结合和静电相互作用。
常用的提取剂是氯仿、甲醇和水（1:2:0.8，V/V/V）的混合液。
此比例的混合液是混溶的，形成一个相。
组织（例如肝）在此混合液中被匀浆以提取所有脂质，匀浆后形成的不溶物包括蛋白质、核酸和多糖用离心或过滤方法除去。
向所得的提取液加入过量的水使之分成两个相，上相是甲醇/水，下相是氯仿。
脂质留在氯仿相，极性大的分子如蛋白质、多糖进入极性相。
取出氯仿相并蒸发浓缩，取一部分干燥，称重。
（二）脂质的色谱分离被提取的脂质混合物可采用色谱方法进行分级分离。
例如硅胶柱吸附层析可把脂质分成非极性、极性和荷电的多个组分。
硅胶是硅酸的一种形式，一种极性的不溶物。
当脂质混合物通过硅胶柱时，由于极性的荷电的脂质与硅胶结合紧密被留在柱上，非极性脂质则直接通过柱子，出现在最先的氯仿流出液中，不荷电的极性脂质（例如脑苷脂）可用丙酮洗脱，极性大的或荷电的脂质（如磷脂）可用甲醇洗脱。
分别收集各个组分，再在不同系统中层析，以分离单个脂质组分。
例如磷脂可分离成磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺等。
此外可采用更快速，分辨率更高的高效液相色谱HPLC和薄层层析TLC进行脂质分离。
实验五-薄层色谱实验
六、思考题
1.如何利用Rf值来鉴定化合物？ 2.薄层色谱法点样应注意些什么？ 3.常用的薄层色谱的显色剂是什么？
性顺序为： 乙烷<二硫化碳<苯<四氯化碳<二氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<甲 醇<水
6、显色
•被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈 现出有色斑点。 •如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色。还 可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。 •对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有 机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。
5、展开
薄层色谱的展开，需要在密闭 容器中进行。在层析缸中加入 配好的展开溶剂，使其高度不 超过1cm。将点好的薄层板小心 放入层析缸中，点样一端朝下， 浸入展开剂中。盖好瓶盖，观 察展开剂前沿上升到一定高度 时取出，尽快在板上标上展开 剂前沿位置。
晾干，观察斑点位置，计算Rf值。 在特定的色谱系统中，化合物 的Rf值是一定的，比较未知物 和标准物的Rf值能够作为鉴定 未知物的依据。
活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。
4、点样
•先用铅笔在距薄层板一端 1cm处轻轻划一横线作为 起始线，然后用毛细管吸 取样品，在起始线上小心点样， 斑点直径一般不超过2mm。
•若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶 剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散 等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点 间距离应为1。 •点样要轻，不可刺破薄层。
实验五 薄层色谱实验
一、实验目的
• 1、掌握薄层色谱的操作技术。 • 2、了解薄层色谱的基本原理和应用。
二、实验原理：
1、原理 薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用 T 的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之间进行分离。 由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时 ，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。
动物生物化学实验
球重力的倍数，单位是重力加速度“g” （980cm/sec2），
相对离心力RCF可用下式计算：
RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r
( rpm — revolutions per minute每分钟转数，r/min )
采用修正法消除系统误差
预先将仪器的系统误差检定出来或计算出来，做出误差
表或误差曲线，然后取与误差数值大小相同、符号相反的 值作为修正值，进行误差修正。
即：x真=x测+x修
动物生物化学实验
动物生物化学实验
实验一 实验室基本知识 实验二 氨基酸纸层析 实验三 血清蛋白含量测定 实验四 影响酶活性的因素 实验五 脂质的薄层层析 实验六 凝胶层析法基本练习 实验七 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 实验八 动物组织中DNA提取
实验一 实验室基本知识
一、实验室规则 二、实验室常用量器及仪器设备介绍 三、试剂配制 四、实验误差与克服 五、实验室安全知识简介 六、实验记录及实验报告
由上式可见，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间 可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离 心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不 一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径“ra v”代 替：
ra v=( r min＋rmax) / 2
Rmin
r的测量
旋转轴
Rave Rmax
系统误差的特点：
和偶然误差不同，它不具有抵偿性，即在相同条件下重 复多次测量，系统误差无法相互抵消。
产生系统误差的诸因素是可以被发现和加以克服的。
系统误差的减小和消除
实验五 类胡萝卜素的提取和薄层色谱
三、基本操作
1、薄层色谱的操作步骤：
（1）制浆 浆液的制备可分为干法和湿法。干法是将选好的 硅胶G慢慢倒入溶剂中调成糊状备用。湿法是将水和硅胶G按1 ：4的比例在搅拌下将硅胶G慢慢地倒入水中调成糊状，不要反 过来加，防止形成团块。湿法制浆要在使用前调制，否则浆料 容易凝固结块。
(2)涂片 大量使用可用涂布器涂布。简单的涂布方法是将两 片载玻片用肥皂水和水洗涤干净，再用碎滤纸吸干玻片上的水 分，然后将其重叠在一起，用手夹住片的上端，慢慢浸入已调 好的浆液浸涂2s左右（上端留一些不浸涂），然后缓慢地将载 玻片从浆液中取出，要求版面均匀平滑，载片边缘上的浆料用 抹布轻轻地擦去，小心将两片分开，放在磁盘中。待浆料自然 干燥后放入烘箱，在105～110℃下活化，约30min就制成了薄层 板，取出来进行点样。
七、课后习题
1. 展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？ 2. 如何利用Rf值来鉴定化合物？ 3. 为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？
（3）点样 在活化好的薄层板下约1cm处的边上轻轻地用 铅笔点一个标记作为起始线。用一根内径约一毫米的毛细 管吸取制备好的试样。吸取的试样不要太多，防止样点扩 散。在起始线的中央轻轻地接触薄层板，点样要迅速，接 触即刻移开。待样点溶剂挥发后再重复点样约3～4次。样 点直径不要超过2mm，太大会出现拖尾现象。如果在一 块薄层板上点两个以上的样点要分开距离。样点点好后就 可以展开。
实验五 类胡萝卜素的提取和 薄层色谱（7学时）
一、实验目的 二、实验原理 三、基本操作 四、实验装置 五、注意事项 六、成功关键 七、课后习题
一、实验目的
1、了解薄层色谱的一般原理和意义。 2、学习薄层色谱的操作方法。 3、掌握天然色素的提取方法。
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2. 层析薄板的制备
称取3-4g的200目硅胶G，加 0.02mol/L NaAC 10ml-12ml，磨匀， 铺板，然后令其自然干燥，再放入 烘箱中，在 110℃活化30min，保存 于干燥器中备用。
3. 点样：在烘干活化的硅胶G板上，于距底部2cm
处，用毛细管点上蛋黄提取液，点样直径不要大于 3cm，然后用冷风吹干。
通常使用硅胶G。
流动相：展层剂，通常为有机溶剂。
2. 脂类的薄层层析
将提取的脂类混合液点在薄板上，由于样品 各组分的分子结构不同，吸附剂对其的吸附力不 同，当展层剂流过时，吸附力小的成分移动的快， 吸附力大的成分移动的慢，由此将各组分分开。
吸附力的强弱，受分子本身极性影响。极性 强的分子，容易被吸附，移动慢，Rf小，反之， 亦然。
4. 展层：展层缸中装展层剂约1cm深，将已点样的
硅胶板放入展层缸中，展层，至展层液前沿到达薄层 顶端约2cm处时，即可取出硅胶板，记下展层剂前沿 线，用热风吹干。
5. 显色：把硅胶板立即放入预先装置有数粒碘片的
干净层析缸中，密闭几分钟，已经展层分开的脂质成 分将分别吸附碘蒸汽而显黄色斑点。
五、实验结果及分析
3. 生物组织中脂类物质的提取
生物组织中含有多种脂质成分，包括三酰甘油， 胆固醇，脑磷脂和卵磷脂等，多与蛋白质合成疏松的 复合物，要将这类脂质提取出来并与蛋白质分离，所 用抽提液必须包含亲水性成分和 具有形成氢键的能力。
氯仿-甲醇混合液，就符合生物组织中脂质提取的要求。
生物组织脂质提取液，经过多次水洗，弃去含蛋 白质的水层，留下溶有脂质的氯仿层，所提取的脂类 即可以在铺有硅胶G的玻璃板上进行薄层层析。
1. 计算各斑点Rf值 2. 指出各斑点分别应为何种脂质？
（注：蛋黄中有关脂质的Rf分别为： 三酰甘油0.932、胆固醇0.76、脑磷脂0.65、 卵磷脂0.35，据此可判断层析图谱中各斑点 分别应为何种脂质。 Rf值大小受多种因素的影响。）
三、 实验试剂
1. 硅胶G（200目）、氯仿、甲醇、乙酸钠、无 水Na2SO4等
2. 展层剂：正己烷：乙醚：冰醋酸=80：20：1
四、实验操作
1. 蛋黄中脂质的提取
称取煮熟蛋黄2g，在研钵中磨细，转入刻度试管中， 另缓慢加入１０ml的氯仿-甲醇（2：1，v/v）混合溶剂， 振摇混匀，提取10分钟。然后，经滤纸过滤到刻度试管 中，于滤液中加入1/2体积的水，振摇后静置，溶剂逐渐 分为两层，上层为水层，下层为氯仿层，弃去水层，留 下氯仿层，继续水洗三、四次，同样弃去水层，再加少 量的无水Na2SO4，吸取残留水分，直至溶液透明澄清， 此澄清液即可供脂质薄层层析点样用。
生物化学实验
实验五 脂质的提取及薄层层析
一、实验目的
1. 了解薄层层析的原理及操作方法
2. 掌握从蛋黄中提取脂类物质的方法，了解其 脂类物质的组析原理
薄层层析是吸附层析的一种，是利用被分离 混合物中各组分在两相中吸附能力的大小不同而 分离的。
固定相：玻璃薄板上均匀涂抹的吸附剂薄层，