HIV抗体检测试剂盒-工艺流程图

HIV（1+2型）抗体检测试剂盒(免疫印迹法)生产工艺流程1、HIV抗体检测试剂盒(免疫印迹法)工艺流程图检验电泳胶配制转膜HIV膜条制备HIV膜条分装HIV反应膜条检验强阳性对照配制强阳性对照分装检验弱阳性对照配制弱阳性对照分装质控品检验阴性对照配制阴性对照分装浓缩样品稀释缓冲液10×配制浓缩样品稀释缓冲液10×分装浓缩洗膜缓冲液10×配制浓缩洗膜缓冲液10×分装酶结合物检验酶结合物分装显色试剂底物液底物液分装封闭粉封闭粉分装HIV反应膜条质控品试剂盒组装成品入库显色试剂成品检验孵育板2、各工艺的步骤和要求目录2.1 HIV反应膜条的制备2.1.1 电泳胶的制备2.1.1.1 玻璃夹板固定2.1.1.2 2%琼脂糖封边2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶2.1.1.3.1 20ml 4%分离胶配制2.1.1.3.2 20ml 20%分离胶配制2.1.1.3.3 梯度分离胶灌胶2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备2.1.2 蛋白电泳分离2.1.2.1 样品的制备2.1.2.2 上样2.1.2.3 电泳2.1.3 半干转膜2.1.3.1 准备滤纸和NC膜2.1.3.2 装备转移三明治2.1.3.3 转膜2.1.4 封闭2.2 质控品2.2.1 强阳性对照的配制2.2.2 弱阳性对照的配制2.2.3 阴性对照的配制2.3 显色试剂的配制2.3.1 浓缩样品稀释缓冲液10×的配制2.3.2 浓缩洗膜缓冲液 20×的配制2.3.3 酶结合物的配制2.3.4 底物液2.3.5 封闭粉2.3.6显色具体操作步骤2.3.6.1 试剂准备2.3.6.1.1稀释洗膜缓冲液2.3.6.1.2封闭缓冲液2.3.6.1.3酶结合物工作溶液2.3.6.1.4 底物液（已配制好）2.3.6.2 具体步骤2.1 HIV反应膜条的制备2.1.1 电泳胶的制备2.1.1.1 玻璃夹板固定取洁净的透明玻璃板两块（一大一小），将两个相同的透明塑料片放在小玻璃板的长边沿的两边，再将大玻璃板附上，用4个黑色夹子固定比例夹板（如图所示）,放入烘箱80℃预热7min左右。

2.1.1.2 2%琼脂糖封边用电子天平取2g琼脂糖，于锥形瓶中，再加入1x电泳液100ml，用微波加热至完全溶解，用棉塞封好口，备用。

将上述琼脂糖倒入适量至小烧杯中,待玻璃板加热还剩1min时,将小烧杯放入微波炉中加热至沸腾,连续沸腾2次。

（注意：待琼脂糖液体刚沸腾冒气泡时，要及时按微波炉的暂停键，以免使液体溢出烧杯流到微波炉上。

）待计时器响后，从烘箱中拿出玻璃板，再将小烧杯中的琼脂糖加热至沸腾1次，用注射器迅速吸取5ml熔化的琼脂糖沿玻璃夹板左边注入2ml，待琼脂糖液体流至底部中间位置时，再沿夹板右边注入2ml，使两边的琼脂糖液流汇合在一起，底部有0.5至1cm左右的平整琼脂凝胶即可（此时因玻璃板是热的，所以会有凝胶漏出，保证胶有一定的高度即可，），静置10min，凝固。

（注意：注入时应使注射器针头中的琼脂糖液流垂直流下，成一条直线，不可堆积且不可产生气泡。

换边封胶时要注意不要不凝胶滴到玻璃内部。

判断封边是否合格：①底部凝胶是否能流成一条直线. ②底部凝胶是否具有一定的厚度（0.5cm—1cm）。

如果上述标准没有达到，请再重新封边，以免影响后续实验。

）2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶2.1.1.3.1 20ml 4%分离胶配制配方试剂体积（ml）水11.930%丙烯酰胺 2.71.5M Tris-Hcl5(PH8.8)10% SDS0.210%过硫酸铵0.2TEMED0.012用移液枪（量程5ml）分别量取11.9ml水、2.7m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl过硫酸胺（AP）加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器混匀。

（注：请低速搅拌，避免起泡）最后用移液枪（量程20ul）取12ul TEMED加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器搅拌数秒混匀。

用镊子取出搅拌子。

（注：最后加入TEMED，以防凝胶快速凝固）2.1.1.3.2 20ml 20%分离胶配制配方试剂体积（ml）水 1.330%丙烯酰胺13.31.5M Tris-Hcl5(PH8.8)10% SDS0.210%过硫酸铵0.2TEMED0.008用移液枪（量程5ml）分别量取1.3水、13.3m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl（PH=8.8）于同一烧杯中，再用移液枪（量程200ul）依次量取200ul 10%SDS和200ul 10%过硫酸胺（AP）加入烧杯中放入搅拌子，用搅拌器混匀。

最后用移液枪（量程20ul）取8ul TEMED加入烧杯中，用搅拌器搅拌数秒混匀。

2.1.1.3.3 梯度分离胶灌胶先将混合器开关关了，将配制好的 4%分离胶倒入梯度胶混合器A，将配制好的20%分离胶倒入梯度胶混合器B，梯度胶混合器B搅拌子继续搅拌，打开混合器开关，在蠕动泵上按开始键，将导管从玻璃夹板中间放入底部，并导管口随液面升高而升高（保持导管口在液面上方并接触液面），直到泵停止灌胶，用移液枪从玻璃夹板中间缓慢加入2ml乙醇（或水）。

静置10min,待胶凝固。

注意：混合器的清洗：待灌完胶，往混合器里加入灌水，清洗导管，2-3次，按快速键将导管里的液体排干，将混合器倒过来，晾干，方便下次使用。

2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备配方试剂体积（ml）水10.230%丙烯酰胺 2.551M Tris-Hcl1.875(PH6.8)10% SDS0.1510%过硫酸铵0.15TEMED0.015用移液枪（量程5ml）分别量取10.2水、2.55m 30%丙烯酰胺和1.875ml 1M Tris-Hcl过硫酸胺（AP）加入烧杯中。

最后，用移液枪（量程20ul）取15ul TEMED加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器搅拌数秒混匀。

用一次性移液管（量程10ml）量取10ml 5%积层胶混匀夜，从中央灌满，插入梳子。

静置30min，凝固。

注：凝胶不能有气泡。

如不马上用，请用保鲜膜包裹，加适量缓冲液，4℃保存。

Ps:为实验方便，4%、20%分离胶和5%积层胶可以一起配制，但是未正式用前，请不要加入TEMED.2.1.2 蛋白电泳分离2.1.2.1 样品的制备将样品和5x Loading buffer按照体积比为4:1的比例混合560ul，煮沸5min，13000rpm/min离心2min。

2.1.2.2 上样将玻璃夹板（短玻璃内侧）用黑色夹子固定在电泳仪上，另一边也固定一块洁净的大玻璃板，用1x电泳液灌满电泳仪上面的水槽至液面高于短玻璃板2.5cm，检查不漏液，再灌下面水槽至超过玻璃板底部1cm以上即可，缓慢取出梳子。

用移液枪取5ul 的marker点到两边的小上样孔，用移液枪将560ul的蛋白样品点到中间的大上样孔。

2.1.2.3 电泳将电泳盖盖上，正极接正极，负极接负极，设置参数：电压120V，电流：99mA，时间：300min，恒压电泳开始。

（注：电泳正常启动时，电极丝会有大量小气泡往上升，若没有，请检查电源是否插好。

）2.1.3 半干转膜2.1.3.1 准备滤纸和NC膜依据胶的大小剪好NC膜(高*宽：11.5-12cm*17cm)和16张滤纸（高*宽：11-11.5cm*16.5cm）；2.1.3.2 装备转移三明治装配转移三明治(○-8层滤纸®胶®膜®8层滤纸○+)：将电转液加入搪瓷盘，在最底层加入8层滤纸，赶走气泡；然后用镊子将玻璃板撬开，除去小玻璃板后，用塑料刀将积层胶和凝胶切下轻轻刮去，避免把分离胶刮破。

小心剥下地把分离胶覆盖于滤纸上，调整使其与滤纸对齐，轻轻用塑料刀擀去气泡；接着再将NC膜铺在上面，赶走气泡；最后再将8层滤纸覆盖上。

（PS：必要时可倒些电转液将胶湿润，使其更好地移出。

NC膜要注意正反面做好标记，粗糙的一面对着胶）2.1.3.3 转膜将装配好的三明治结构转至转膜仪，加入适量的转移缓冲液，设置参数，电压30V，电流495mA，时间：50min，恒流转膜开始；（注：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。

）2.1.4 封闭转膜结束后，切断电源，取出膜。

用5%的封闭液将膜封闭，37℃ 2h 或 4℃过夜。

2.2 质控品2.2.1 强阳性对照的配制灭活的高滴度人血清2.2.2 弱阳性对照的配制灭活的低滴度人血清2.2.3 阴性对照的配制灭活的正常人血清2.3 显色试剂的配制2.3.1 浓缩样品稀释缓冲液10×的配制名称KH2PO40.27gNa2HPO4 1.42gNaCl 8gKCl 0.2g纯水800ml2.3.2 浓缩洗膜缓冲液10×的配制名称1M40mlTris-HCl(pH7.4)NaCl 17.532gTween20 1ml纯水定容至200ml2.3.3 酶结合物的配制可用碱性磷酸酶山羊抗人IgG 酶结合物2.3.4 底物液可用BCIP/NBT底物液底物液2.3.5 封闭粉可用脱脂奶粉封闭粉2.3.6显色具体操作步骤2.3.6.1 试剂准备2.3.6.1.1稀释洗膜缓冲液a. 每次使用前新鲜配制洗膜缓冲液。

b. 将1体积的浓缩洗膜缓冲液（20*）加入到19体积的蒸馏水中，充分混匀。

2.3.6.1.2封闭缓冲液a. 每次使用前新鲜配制封闭缓冲液。

b. 将1体积的浓缩样品稀释缓冲液加入到9体积的蒸馏水中，充分混匀。

c. 在上步骤（2.b）中配制的稀释后的浓缩样品稀释缓冲液中，每20ml加入0.1g封闭粉，充分混匀，溶解。

2.3.6.1.3酶结合物工作溶液a. 用上述配好的封闭缓冲液按1:500比例稀释酶结合物。

例如：每4μL酶结合物加入2ml 封闭缓冲液。

酶结合物工作液必须在使用前配制。

（AutoBlot用户，则须在不超过1.5小时前配置。

）2.3.6.1.4 底物液（已配制好）a．可以直接使用。

请用洁净吸管直接从容器中吸取需要的液体，用后拧紧盖子。

2.3.6.2 具体步骤步骤内容6.2.2.1每槽内加入2ml的稀释洗试剂膜缓冲液。

2ml6.2.2.2用镊子小心取出需要的试剂膜条，有号码的一端向上，分别放入孵育板槽内。

包括一条强阳性对照、一条弱阳性对照和一条阴性对照。

-6.2.2.3在室温下（22-28℃）将孵育板置摇床（每分钟摇摆12至16次）上振荡孵育10分钟。

用吸引器吸出缓冲液。

再重复步骤6.2.2.1两次. 25℃±3℃10分钟6.2.2.4在每槽中加入2ml上述配好封闭缓冲液，随后分别加入20ul病人血清或强阳性，弱阳性，阴性对照。

2ml封闭缓冲液20ul强阳性6.2.2.5盖好孵育板，于室温下（22-28℃）在摇床上震荡孵育2小时。