HIV抗体检测试剂盒-工艺流程图

HIV（1+2型）抗体检测试剂盒(免疫印迹法)生产工艺流程

1、HIV抗体检测试剂盒(免疫印迹法)工艺流程图

检验

电泳胶配制转膜HIV膜条制备HIV膜条分装HIV反应膜条

检验

强阳性对照配制强阳性对照分装

检验

弱阳性对照配制弱阳性对照分装质控品

检验

阴性对照配制阴性对照分装

浓缩样品稀释缓冲液10×配制浓缩样品稀释缓冲液10×分装

浓缩洗膜缓冲液10×配制浓缩洗膜缓冲液10×分装

酶结合物检验酶结合物分装显色试剂底物液底物液分装

封闭粉封闭粉分装

HIV反应膜条

质控品试剂盒组装成品入库

显色试剂成品检验

孵育板

2、各工艺的步骤和要求

目录

2.1 HIV反应膜条的制备

2.1.1 电泳胶的制备

2.1.1.1 玻璃夹板固定

2.1.1.2 2%琼脂糖封边

2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶2.1.1.

3.1 20ml 4%分离胶配制

2.1.1.

3.2 20ml 20%分离胶配制

2.1.1.

3.3 梯度分离胶灌胶

2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备

2.1.2 蛋白电泳分离

2.1.2.1 样品的制备

2.1.2.2 上样

2.1.2.3 电泳

2.1.3 半干转膜

2.1.

3.1 准备滤纸和NC膜

2.1.

3.2 装备转移三明治

2.1.

3.3 转膜

2.1.4 封闭

2.2 质控品

2.2.1 强阳性对照的配制

2.2.2 弱阳性对照的配制

2.2.3 阴性对照的配制

2.3 显色试剂的配制

2.3.1 浓缩样品稀释缓冲液10×的配制

2.3.2 浓缩洗膜缓冲液 20×的配制

2.3.3 酶结合物的配制

2.3.4 底物液

2.3.5 封闭粉

2.3.6显色具体操作步骤

2.3.6.1 试剂准备

2.3.6.1.1稀释洗膜缓冲液

2.3.6.1.2封闭缓冲液

2.3.6.1.3酶结合物工作溶液

2.3.6.1.4 底物液（已配制好）

2.3.6.2 具体步骤

2.1 HIV反应膜条的制备

2.1.1 电泳胶的制备

2.1.1.1 玻璃夹板固定

取洁净的透明玻璃板两块（一大一小），将两个相同的透明塑料片放在小玻璃板的长边沿的两边，再将大玻璃板附上，用4个黑色夹子固定比例夹板（如图所示）,放入烘箱80℃预热7min左右。

2.1.1.2 2%琼脂糖封边

用电子天平取2g琼脂糖，于锥形瓶中，再加入1x电泳液100ml，用微波加热至完全溶解，用棉塞封好口，备用。

将上述琼脂糖倒入适量至小烧杯中,待玻璃板加热还剩1min时,将小烧杯放入微波炉中加热至沸腾,连续沸腾2次。（注意：待琼脂糖液体刚沸腾冒气泡时，要及时按微波炉的暂停键，以免使液体溢出烧杯流到微波炉上。）

待计时器响后，从烘箱中拿出玻璃板，再将小烧杯中的琼脂糖加热至沸腾1次，用注射器迅速吸取5ml熔化的琼脂糖沿玻璃夹板左边注入2ml，待琼脂糖液体流至底部中间位置时，再沿夹板右边注入2ml，使两边的琼脂糖液流汇合在一起，底部有0.5至1cm左右的平整琼脂凝胶即可（此时因玻璃板是热的，所以会有凝胶漏出，保证胶有一定的高度即可，），静置10min，凝固。（注意：注入时应使注射器针头中的琼脂糖液流垂直流下，成一条直线，不可堆积且不可产生气泡。换边封胶时要注意不要不凝胶滴到玻璃内部。判断封边是否合格：①底部凝胶是否能流成一条直线. ②底部凝胶是否具有一定的厚度（0.5cm—1cm）。如果上述标准没有达到，请再重新封边，以免影响后续实验。）

2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶

2.1.1.

3.1 20ml 4%分离胶配制

配方

试剂体积（ml）

水11.9

30%丙烯酰胺 2.7

1.5M Tris-Hcl

5

(PH8.8)

10% SDS0.2

10%过硫酸铵0.2

TEMED0.012

用移液枪（量程5ml）分别量取11.9ml水、2.7m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl

过硫酸胺（AP）加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器混匀。（注：请低速搅拌，避免起泡）最后用移液枪（量程20ul）取12ul TEMED加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器搅拌数秒混匀。用镊子取出搅拌子。（注：最后加入TEMED，以防凝胶快速凝固）

2.1.1.

3.2 20ml 20%分离胶配制

配方

试剂体积（ml）

水 1.3

30%丙烯酰胺13.3

1.5M Tris-Hcl

5

(PH8.8)

10% SDS0.2

10%过硫酸铵0.2

TEMED0.008

用移液枪（量程5ml）分别量取1.3水、13.3m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl（PH=8.8）于同一烧杯中，再用移液枪（量程200ul）依次量取200ul 10%SDS和200ul 10%过硫酸胺（AP）加入烧杯中放入搅拌子，用搅拌器混匀。最后用移液枪（量程20ul）取8ul TEMED加入烧杯中，用搅拌器搅拌数秒混匀。

2.1.1.

3.3 梯度分离胶灌胶

先将混合器开关关了，将配制好的 4%分离胶倒入梯度胶混合器A，将配制好的20%分离胶倒入梯度胶混合器B，梯度胶混合器B搅拌子继续搅拌，打开混合器开关，在蠕动泵上按开始键，将导管从玻璃夹板中间放入底部，并导管口随液面升高而升高（保持导管口在液面上方并接触液面），直到泵停止灌胶，用移液枪从玻璃夹板中间缓慢加入2ml乙醇（或水）。静置10min,待胶凝固。

注意：混合器的清洗：待灌完胶，往混合器里加入灌水，清洗导管，2-3次，按快速键将导管里的液体排干，将混合器倒过来，晾干，方便下次使用。

2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备

配方

试剂体积（ml）

水10.2

30%丙烯酰胺 2.55

1M Tris-Hcl

1.875

(PH6.8)

10% SDS0.15

10%过硫酸铵0.15

TEMED0.015

用移液枪（量程5ml）分别量取10.2水、2.55m 30%丙烯酰胺和1.875ml 1M Tris-Hcl