实验七稀释平板计数法及土壤中真菌的分离纯化
微生物实验-平板菌落计数与菌种分离纯化技术
培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个 平板上的菌落，并按下列公式进行计算：
每克土样中细菌数＝同一稀释度三次重复的平均菌 落数×稀释倍数
3、 平板划线分离法
（1）倒平板 按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称， 土样编号和实验日期；
（2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述 的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用 那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使 之形成单个菌落；
每克土样中细菌数＝同一稀释度三次重复 的平均菌落数×稀释倍数
（2）、倾注平板法
①样品制备（土样稀释）同上 ②取样 用三支1ml无菌吸管分别吸取10-6、10-7和 10-8的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平 皿，每个稀释度放3个平皿。
③倒平板
向上述平皿中倒入45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养 基约15毫升/平皿，水平迅速旋动平皿，使培养基与菌 液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培 养。注意：要有无菌水的对照（CK）
实验内容
实验一、显微镜的使用与单染色法 实验二、革兰氏染色与荚膜染色 实验三、放线菌形态观察与芽孢染色 实验四、霉菌形态观察与各大类微生物菌落特征 实验五、酵母菌形态观察、显微计数与显微测量技术 实验六、培养基的制备 实验七、菌种分离纯化技术与平板菌落计数 实验八、水质微生物学检测 实验九、消毒与灭菌技术
实验七、菌种分离纯化与平板菌落计数
一、实验目的
1、 学习并掌握平板菌落计数的技术方法 。 2、学习并掌握微生物分离纯化技术方法。 3、 了解土壤微生物区系的组成。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大 量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各 类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类 群进行数量测定。基本原理是通过稀释使菌体 细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落。 可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可 通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含 有微生物的数量。
土壤中微生物分离纯化电子版实验报告
土壤中微生物分离纯化电子版实验报告微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。
（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。
所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。
（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。
划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。
通过划线将样品在平板上稀释，培养后能形成单独的菌落。
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数关键词：微生物分离纯化计数实验原理稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。
为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。
土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。
其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。
本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。
分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。
分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。
在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。
土壤微生物的分离和纯化
土壤微生物的分离和纯化土壤微生物的分离和纯化一、实验目的1、掌握从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学会根据微生物培养特征初步判断未知菌的类别。
3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。
二、实验原理土壤是微生物生长和栖息的良好基地。
土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。
因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，可用于培养细菌。
链霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，对酵母菌和霉菌不起作用。
加入一定量链霉素的培养基可以从混杂的微生物群体中分离出酵母菌和霉菌。
重铬酸钾或苯酚对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，可用于选择分离放线菌。
三、实验器材1、材料：10cm左右深层土壤。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基3、其他物品：试管、三角瓶、烧杯、量筒、电子天平、精密pH 试纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、枪头、接种环、酒精灯、链霉素(1万单位/ml) 、10%苯酚、无菌水。
四、实验步骤1、土样采集：取10cm左右深层土壤10g备用。
2、制备土壤稀释液：称取土壤1g，放入有99mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀，即为稀释10－2的土壤悬液。
然后进行十倍梯度稀释，依次制备10－3、10－4、10－5、10－6、10－7 稀释度的土壤稀释液。
3、培养基平板制备：按培养基配方各配置牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基、高氏Ⅰ号培养基各100ml。
灭菌后分别倒3个平板。
（高氏Ⅰ号培养基灭菌前加入10滴10%苯酚；马丁氏培养基倒平板前加入2ml去氧胆酸钠(2%)和0.4ml 1万单位/ml链霉素）4、接种：用无菌吸管吸取0.1ml相应浓度土壤稀释液，以无菌操作技术接种在平板上，涂布均匀。
细菌选用10－4、10－5、10－6 三个稀释度接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，放线菌与霉菌选用10－2 、10－3、10－4三个稀释度，分别接种于高氏Ⅰ号培养基、马丁氏培养基。
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
实验七微生物的分离纯化与平板菌落计数一培养基的配制和灭菌
各组需要配置的培养基和需要灭 菌的玻璃器皿
1,干热灭菌
培养皿10付(1罐),1ml吸管6支至烘箱中进行 干热灭菌(1600C 2h);
2,制备培养基
(1) 每组制备普通营养琼脂培养基,每组 400ml分装于10支试管(灭菌后摆斜面)及2个 锥形瓶;
(2) 每组制备EMB培养基,每组400ml装于2 个锥形瓶,另10支9ml试管自来水(用10ml移 液管准确量取）
一、目的要求
1.了解培养基配制原理，掌握其制备过 程。
2．了解高压蒸汽灭菌器的原理，掌握使 用方法。
二、基本原理
1,培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产
物所需要的营养基质。 其中含有碳源、氮源、能源,无机盐、生长因子以及水分。 微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内
2.溶化：在量杯中加入所需水量（一般用自来水，特殊需 用蒸馏水），搅匀，加热溶解。
3.补水:按配方定容至所需体积。
4.调pH值：用pH试纸测pH，并用1mol/L NaOH或 1mol/L HCl调节至所需pH范围.
5.过滤：一般不过滤，特殊情况下需过滤，可用滤纸，纱 布或脱脂棉等。
6.分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装 入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。棉塞 的总长度的3/5应在口内，2/5口外。注意不要使培 养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。
（1）液体：分装高度以试管度的1/4左右
（2）固体：分装试管，其量为管高的1/5，灭菌后 制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积 之一半为宜。
（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜， 灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。
7.灭菌
培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸， 便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进 行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。
土壤微生物的分离纯化及鉴定
土壤微生物的分离纯化及鉴定一．摘要：通过稀释涂布、划线分离等微生物的基本实验操作和步骤，对土壤中的微生物进行分离与纯化，再根据实验中菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化试验等结果对所分离细菌和霉菌的分类进行鉴定。
二．关键词：土壤微生物，划线分离，纯化，芽孢染色，革兰氏染色，鞭毛染色，穿刺，生理生化鉴定三．前言：土壤微生物是构成土壤肥力的重要因素。
土壤中尤以细菌最多，约占土壤微生物总量的70-90%.土壤中不同类型的细菌有不同的作用。
有的能够固定空气中的氮元素，合成细胞中的蛋白质；有的能够分解农作物的秸杆，它们大多是异养菌。
除了细菌以外，土壤中数量较多的其它微生物是放线菌和真菌，而藻类和原生动物等较少。
土壤中的微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
要研究某种微生物的特性或要确定某些微生物菌株的分类地位，首先须使该微生物为纯培养。
也就是说培养物中所有的细胞只是微生物的某一个或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
从复杂的微生物群体中获得只含有一种或一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
单细胞挑取法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法和平板划线法是分离纯化微生物的常规方法。
通过稀释涂布平板法可以在平板上获得单菌落，再通过挑取单菌落进行平板划线分离可获得纯培养。
在稀释涂布平板法中还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。
对微生物分类的主要依据有形态特征、生理生化特征性等。
形态特征包括个体形态和培养形态。
细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位都是个体形态的特点。
培养形态指微生物在培养基（包括固体和液体培养）中生长的形态特征。
通过细菌的形态特征可以对微生物进行分类鉴定。
各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的终产物的不同，反应出它们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。
土壤中真菌纯化、分离和培养
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备 用“稀释平板计数法”中的方法
进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90mL无菌水）和4 管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依 次编号。在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸取 lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗 三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。
注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用 不同的吸管。
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种
方法。
混菌法和涂抹法。Βιβλιοθήκη 混 菌 法涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板倒 置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数 6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置 于冰籍中保存，必要时进行深入研究。
土壤中 真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得真 菌纯培养技能；了解基本接种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用 潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不 同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。本 次实验从土壤中分离真菌。
六、注意事项
1、混菌法接种时温度不能过高，应低于45℃， 如不用温度计，则以不烫脸、手为宜。
2、涂布法接种时一定要涂抹均匀，否则就会无 法记数。
实验七 土壤中微生物的分离纯化
④平板涂布分离法（Spread Plate）
简单易行，但易造成机械损伤
⑤选择性培养分离法
为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可 以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条 件等，采用选择培养的方法进行分离。 ＊利用选择培养基进行直接分离 ＊富集培养
⑥单细胞（单孢子）分离法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体 进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。
②平板划线分离法（Streak Plate）
An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
划线分离后平板上显示的菌落照片
①液体稀释法
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀 释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过 稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物 生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁 殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.
活菌计数—混合倒平板法
2．平板划线分离法 （1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标 明培养基名称。 （2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手 拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平 板上划线（图Ⅶ-5）。划线的方法很多，但无 论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品 在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
实验七 土壤中微生物的分离 及纯化（设计性实验）
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物 的基本操作技术。 学习平板菌落计数的基本原理和方法 。 初步观察来自土壤中的三大类群微生物的 菌落形态特征
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
交叉划线法
连续划线法
正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿
计算公式：
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
平均菌落数——某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数； CFU——菌落形成单位（colony-forming units，CFU）； 0.2mL——每个平皿加入的菌悬液体积； 100mL——10-1菌悬液的体积； 10g——称取的土壤重量。
平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的 菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌 落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释， 使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取一定量的稀 释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基 内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计 换算出样品的含菌数。
菌落计数原则（六条）
1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个 平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应 以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌 落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其 余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的 菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该 稀释度的平均菌落数。
计算菌落总数方法举例（加样量为1mL）
例次 １ 不同稀释度的平均菌落数 10-1 1365 10-2 164 10-3 20 两个稀释 度菌落数 之比 － 菌落总数 （个／mL） 1.64×104 备注
２ ３
４ ５
2760 2890
无法计数 27
295 271
1650 11
46 60
513 5
1.6 2.2
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
土壤细菌的分离、纯化及微生物作画展开
土壤细菌的分离、纯化及微生物作画展开
土壤细菌的分离、纯化以及微生物作图展开是微生物学研究中的重要步骤。
下面是这一过程的详细展开：
1. 样品采集：从土壤中采集样品，可以根据需要选择不同的采样点和深度，以获取不同类型的土壤细菌。
2. 稀释平板涂布法：将采集的土壤样品按照适当的比例进行稀释，并将稀释液均匀涂布在富养基平板上。
使细菌能够在平板上生长并形成菌落。
3. 菌落分离：根据菌落形态的差异和颜色特征，通过放大菌落直接进行分离。
如果菌落数目较多，可以使用无菌鉗子将不同菌落分离到不同的富养基平板上。
4. 单菌落的纯化：从菌落分离得到的单个细菌落上刺取一小部分，并在无菌条件下移植到新的富养基平板上进行培养。
重复此过程直到获得纯种菌落。
5. 结构观察：对已纯化的细菌进行形态和结构观察，包括使用显微镜观察细菌的形态、大小、颜色等特征。
6. 细菌培养：为了获取足够的细菌菌体用于后续实验，可将已纯化的细菌进行大规模培养。
常见的培养方法包括液体培养和固体培养。
7. 抗生素敏感性测试：可以通过纸片扩散法或微量稀释法测试细菌对不同抗生素的敏感性，以了解细菌的抗生素耐药性。
8. 微生物作图：通过对已纯化的细菌进行染色、染色观察和图像采集，制作出微生物作图。
常见的染色方法包括革兰氏染色和荧光染色等。
以上步骤可以帮助研究者分离和纯化土壤细菌，并对其进行形态观察和抗生素敏感性测试，最终制作出微生物作图。
这些步骤在微生物学研究和应用中具有重要的意义，可以帮助科学家更好地了解土壤中的微生物多样性和功能。
分离纯化和平板计数
分离纯化和平板计数一、实验目的：掌握平板制备和涂布技术、菌液的稀释、四分区划线法和平板菌落计数法。
二、实验原理：培养基融化方法有电炉上加热融化（注意：大火煮开，文火慢炖；化透，而不溢出。
）；微波炉融化；灭菌锅融化（溶解保温，参数100度30分钟）。
获得最佳分离效果时，菌落密度100个/平板较合适，而一般的起始菌液浓度可达到108-109个/ml，因此需要稀释105-106倍。
常用的系列稀释法：10倍系列稀释。
以稀释原理为基础，建立的固体培养基分离纯培养的基本方法：平板划线法、倾注平板法、涂布平板法。
平板划线法：稀释过程发生在固体平板的表面，既是稀释的过程，也是接种的过程，两步并做一步走。
涂布平板法是使用较多的常规方法，克服了倾注平板法的缺点，但有时涂布不均匀。
计数法适用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的孢子。
显微镜下的直接计数法包括血球计数板、细菌计数板，间接计数法——活菌计数法包括平板菌落计数法、膜过滤培养法。
微生物计数目的是测定微生物的生长、微生物检测等。
平板菌落计数法——活菌计数法原理：每一个单个的微生物细胞在合适的培养基和生长条件下，可以在平板上通过生长形成菌落。
通过菌落数量的计数，计算样品中的活菌数。
三、实验材料：LB固体培养基，酒精灯，培养皿，无菌水试管，菌液，移液管，涂布器，接种环。
四、实验步骤：LB平板制备：1、灭菌锅融化LB固体培养基，溶解保温，参数100度30分钟。
2、冷至55-60度左右（不烫手为宜）。
3、无菌操作，倒平板。
右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管口或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指（环指）夹住试管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。
如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次用完，试管塞或瓶塞则不必加在手中）。
左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
实验七稀释平板计数法及土壤中真菌的分离纯化
以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数
1、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌 落数乘以稀释倍数报告； 2、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落 数乘以稀释倍数报告；
பைடு நூலகம்
四、实验步骤---从土壤里分离真菌
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、捻碎土样，将土样溶解在90ml无菌水三角瓶中 4、梯度稀释法稀释土样
10g
10-1 90ml
10-2
10-3
10-4
10-5
4、涂平皿： 每个稀释度均需要涂布平皿，每皿取菌液0.1ml， 用玻璃刮铲涂布均匀。 5、28℃倒置培养3~7天 6、观察并描述真菌菌落特征
五、实验结果及分析
稀释平皿计数法： 稀释倍数 菌落数
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、梯度稀释法稀释原菌样品
四、实验步骤
4、涂平皿： 选取1/106,1/107,1/108三个稀释度计数，每皿取 菌液0.1ml，用玻璃刮铲涂布均匀，每个稀释度做一 个重复。 5、37℃倒置培养2天 6、计数：
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积 （ml）
二、实验原理---土壤中真菌的分离纯化
马丁孟加拉红---链霉素培养基
马丁培养基 孟加拉红 链霉素
三、实验器材
（一）培养基
1、牛肉膏蛋白胨培养基 2、马丁孟加拉红---链霉素培养基
（二）其他
1、无菌培养皿 2、无菌吸管 3、无菌水
（三）仪器
土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术
土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术一、目的和内容目的：学习从土壤中分离微生物的方法,学习无菌操作技术.内容：1．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌.2．用平板划线方法分离微生物.3．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术.二、材料和用具金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通变形菌(Proteusvulgaris)斜面菌种.牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶,无菌水(带玻璃珠)1瓶,无菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.无菌培养皿12套,1mL无菌移液管10支,土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.三、操作步骤(一)土壤稀释分离：1、取土壤：取表层以下5—10cm处的土样,放入无菌的袋中备用,或放在4℃冰箱中暂存.2、制备稀释液(要无菌操作)(1)制备土壤悬液：称土样,迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好),振荡5～10min,使土样充分打散,即成为10-2的土壤悬液.(2)稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液,放入无菌水中即为10-3稀释液,如此重复,可依次制成10-3～10-8的稀释液(图3-1).注意：操作时管尖不能接触液面,每一个稀释度换用一支移液管,每次吸入土液后,要将移液管插入液面,吹吸3次,每次吸上的液面要高于前一次,以减少稀释中的误差.3、混菌法测定菌落数的方法(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL,分别接人相应标号的平皿中,每个稀释度接两个平皿.然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基,分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高～2mm为宜),迅速轻轻摇动平皿,使菌液与培养基充分混匀,但不沾湿皿的边缘,待琼脂凝固即成细菌平板.倒平板时要注意无菌操作.(2)放线菌：取10-5、10-4两管稀释液,在每管中加入10%酚液5～6滴,摇匀,静置片刻,然后分别从两管中吸出1mL加入相应标号的平皿中,选用高氏1号培养基,用与细菌相同的方法倒入平皿中,便可制成放线菌平板.(3)霉菌：取10-2、10-3两管稀释各1mL,分别接入相应标号的平皿中,每个稀释度接两个平皿.在融化的土豆蔗糖培养基中,每100mL加入灭菌的乳酸1mL,轻轻摇匀,然后用与细菌相同的方法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板.4、培养：将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置,即皿盖朝下放置,于28～30℃中恒温培养,细菌培养1～2d,放线菌培养5～7d,霉菌培养3～5d.观察生长的菌落,用于进一步纯化分离或直接转接斜面.(二)平板制作及划线分离方法：1．倒平板：按无菌操作要求,在火焰旁操作,做法如3(1).2．划线分离：使用接种环,从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样,在相应培养基平板中划线分离,划线的方法多样,目的是获得单个菌落,.(三)斜面接种和穿刺接种：1．斜面接种(1)取新鲜固体斜面培养基,分别做好标记(写上菌名、接种日期、接种人等),然后用无菌操作方法,把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上.(2)接种的方法是,用接种环沾取少量待接菌种,然后在新鲜斜面上“之”字形划线,方向是从下部开始,一直划至上部(图3—4A).注意划线要轻,不可把培养基划破.(3)接种后30℃恒温培养,细菌培养48h,放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存.2．穿刺接种(1)取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基,做好标记(写上菌名)、接种日期,接种人等).(2)接种的方法是,用接种针沾取少量待接菌种,然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入路线抽出接种针,注意接种针不要移动.(3)接种后30℃恒温培养,24h后观察,比较两种菌的生长结果.四、注意事项1．一般土壤中,细菌最多,放线菌及霉菌次之,而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中,故从土壤中分离细菌时,要取较高的稀释度,否则菌落连成一片不能计数.2．在土壤稀释分离操作中,每稀释10倍,最好更换一次移液管,使计数准确.3．放线菌的培养时间较长,故制平板的培养基用量可适当增多.五、实验结果记录土壤稀释分离结果,并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量.计算方法：选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数,按以下公式：总菌数/g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数。
土壤稀释涂布平板法
实验概要分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。
实验原理土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。
以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。
菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。
在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。
最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。
拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。
主要试剂1. 培养基：高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基2. 其他试剂：银染液A液B液（细菌鞭毛染色） 40%KOH 5%α-萘酚（V.P.实验）主要设备培养皿试管锥型瓶接种环移液管震荡器电炉载玻片超净工作台恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅显微镜等实验材料土样：苏沪香粳1，2组杨稻6号93113，4组武运粳5，6组实验步骤1.稀释涂布平板法(Spread Plate Method)稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。
(1) 倒平板；(2) 制备土壤稀释溶液连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液；(3) 涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面；(4) 培养；(5) 划线分离，直到获得纯培养。
2. 平板菌落计数法平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。
计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。
这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。
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4、涂平皿： 每个稀释度均需要涂布平皿，每皿取菌液0.1ml，
用玻璃刮铲涂布均匀。
5、28℃倒置培养3~7天
6、观察并描述真菌菌落特征
10
可编辑版
五、实验结果及分析
稀释平皿计数法：
稀释倍数 106
107
108
菌落数
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积
（ml）
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描述酵母菌菌落特征： 描述霉菌菌落特征
12
可编辑版
5、37℃倒置培养2天
6、计数：
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积
（ml）
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菌落计数规则： （一）选择平均菌落数在30~300间的平板
1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告； 2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释 度的菌落数的值）：
2、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落
数乘以稀释倍数报告；
8
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四、实验步骤---从土壤里分离真菌
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、捻碎土样，将土样溶解在90ml无菌水三角瓶中 4、梯度稀释法稀释土样
10g 10-1
90ml
9
10-2
10-3
10-4
1可0-5 编辑版
实验七 稀释平板计数法及土壤中真菌的 分离纯化
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一、实验目的
掌握活菌计数的基本原理及方法 掌握从样品中分离目的微生物的原理及方法
2
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二、实验原理---稀释平皿计数法
将微生物细胞充分稀释到单个分散，把这些单个分散 的细胞均匀涂布在平皿培养基上，培养后长出的菌落 肉眼可见，每个菌落都由原液中单个细胞发育而来， 计算菌落数，通过公式可以求出单位原样品中的活菌 数。
1）若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报 告。
2）若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。
（二）所有菌落数均不在30~300间
以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数 1、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌
落数乘以稀释倍数报告；
（三）仪器
1、超净工作台 2、玻璃刮铲 3、酒精棉球
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四、实验步骤---稀释平板计数法
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、梯度稀释法稀释原菌样品
选取1/106,1/107,1/108三个稀释度计数，每皿取
菌液0.1ml，用玻璃刮铲涂布均匀，每个稀释度做一 个重复。
每ml(g)样品中的活菌数=（每皿菌落数平均值/取样体 积）×稀释倍数
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二、实验原理---土壤中真菌的分离纯化
马丁孟加拉红---链霉素培养基
马丁培养基 孟加拉红 链霉素
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三、实验器材
（一）培养基
1、牛肉膏蛋白胨培养基 2、马丁孟加拉红---链霉素培养基
（二）其他
1、无菌培养皿 2、无菌吸管 3、无菌水