生物防腐剂乳酸链球菌素在食品中的应用

生物防腐剂乳酸链球菌素在食品中的应用
乳酸链球菌素（Nisin）
Nisin是通过现代生物技术，从乳酸乳球菌发酵产物中提取的、具有抗菌活性的多肽物质。

Nisin的主要特点：
◤ Nisin进入人体即被体内蛋白酶分解为多种氨基酸，无残留，安全可靠。

◤ 可降低食品灭菌温度，缩短灭菌时间，减少食品营养破坏。

◤ 对引起食物腐败的阳性菌，尤其是耐热芽孢有强烈的抑制作用。

乳酸链球菌素是一种世界公认的、安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂，主要用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鲜。

乳酸链球菌素的发现要追溯到上世纪20年代，1928年，
LA.Rogers等美国研究人员首先报道了乳酸链球菌代谢产物能抑制其他乳酸菌的生长。

1947年，A.T.R.Mattick等人发现血清学N群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质，并从乳酸链球菌发酵液中制备出了这种多肽物质，由于是N群中的乳酸菌所产生的抑菌物质，故命名为N- inhibitory Substance，即N群抑菌物质，简称为Nisin。

Nisin是乳酸链球菌的一种天然产物，对远超过食品应用量的乳酸链球菌素的毒性研究表明，它是无毒的。

由于其对蛋白水解酶(α-胰蛋白酶)特别敏感，因此食用后在消化道内即可很快被蛋白水解酶水解成氨基酸。

1953年，乳酸链球菌素的第一批商业产品Nisaplin在英国面市;1969年，FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准乳酸链球菌素可作为一种食品添加剂;1988年，美国食品和药物管理局(FDA)也正式批准将乳酸链球菌素应用于食品中;1990年，我国卫生部食品监督部门签发了乳酸链球菌素在中国的使用合格证明书。

目前已有50多个国家批注允许使用乳酸链球菌素。

法规安全
作为一种世界公认的安全的食品防腐剂，很多国家对Nisin 在食品中的添加量都不作任何限制。

拟增加使用范围和用量：
▷ 04.02.02.03腌渍蔬菜、04.02.02.04蔬菜罐头、04.03.02加工食用菌和藻类，最大用量为
800mg/kg；
▷ 07.01面包、07.02糕点，最大用量为500mg/kg。

GB2760-2014规定Nisin 在食品中的最大使用量如下：
▷ 01.0 乳及乳制品（巴氏杀菌乳、灭菌乳除外）、08.02 预制肉制品、08.03 熟肉制品、09.04熟制水产品中，最大用量为500mg/kg；
▷ 06.04.02.02 其他杂粮制品、06.07 方便米面制品、10.03 蛋制品（改变其物理性状）中，最大用量为250mg/kg；
▷ 04.03.02.04 食用菌和藻类罐头、06.04.02.01 杂粮罐头、12.04 酱油、12.05 酱及酱制品、12.10 复合调味料、14.0 饮料（包装饮用水除外）中，最大使用量为200mg/kg；
▷ 12.03 醋中最大使用量为150mg/kg。

乳酸链球菌素的特性
1.溶解性
Nisin是一种白色或灰白色的固体粉末，使用时需溶于水或液体中，它的溶解度主要取决于溶液的pH值，在水中的溶解度随pH的下降而升高。

即pH在5.0时溶解度为4g/100ml,pH在2.5时溶解度为12g/100ml，pH等于或大于7.0时溶解度约为0，几乎不溶解，产品中由于含有乳蛋白，其水溶液呈轻微的混浊。

所以在应用时，一般先用盐酸溶解后再加入到食品中。

2.稳定性
Nisin的稳定性主要取决于温度，pH值，基质等因素，Nisin在酸性条件下呈现最大的稳定性，其热稳定性随着pH的增加而减弱[ 2 ]。

当Nisin溶于pH=3的稀盐酸中，经121℃、15min高压灭菌，仍能保持100％的活性。

当pH超过4时，特别是加热条件下，它在水溶液中的分解速度加快，活力降低；在pH等于5.0时，灭菌后丧失40％活力；pH等于6.8时，灭菌后丧失90％活力。

但在乳酸链球菌素加入食品后，由于受到牛奶、肉汤等中的蛋白质大分子的保护，其稳定性将大大的提高。

乳酸链球菌素的优越性
1.高效抑菌
Nisin不抑制革兰氏阴性菌、酵母和霉菌，专抑制革兰氏阳性菌，特别是细菌芽孢。

如对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒梭菌、嗜热脂肪芽孢杆菌以及利斯特氏菌等多种腐败菌和食物病原菌有强烈的抑制作用。

只要在食品中添加Nisin就可对革兰氏阳性菌具有强烈的抗菌活性，它与其他防腐剂联合使用能增强其抑菌作用，获得较宽的抑菌谱，如乳酸和Nisin合用能抑制肉中的金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

Nisin和螯合剂合用时能有效地减少革兰氏阴性菌的数量，如Nisin与柠檬酸盐、磷酸盐合用也能提高其对革兰氏阴性菌的抑菌效果。

2.安全性高
Nisin是乳中存在的一种天然成分，千百年来被人们食用未见毒性问题，其生产菌种从奶中分离，采用发酵方法获得产物，物理方法提取，没有化学反应过程。

乳酸链球菌素对蛋白酶特别敏感，进入人体后可被消化道α?胰凝聚蛋白酶降解为多种氨基酸，可吸收，无残留，不产生抗药性，不影响人体益生菌，与其它抗生素不产生交叉抗性。

研究证明Nisin是安全的，LD50为7000mg属实际无毒级。

1992年3月，我国卫生部在批准实施的文件中就明确指出：“可以科学的认为乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的。

”
乳酸链球菌素的抑菌范围
乳酸链球菌素能够有效抑制或杀死引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，浓度为100ppm时就可以杀死大多数的革兰氏阳性菌，能抑制葡萄球菌属、链球菌属、乳杆菌属及微球菌属的某些菌种; 对大部分的梭菌属和芽孢杆菌属及其芽孢也有明显的抑制作用。

Hitchins，A.D等研究表明，杆菌属中的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢对Nisin最为敏感，极少量的Nisin即能够杀死其芽孢，Nisin对芽孢的作用是在孢子膨胀起始阶段抑制其萌发，而不是杀死。

由于Nisin抗菌谱窄，仅能杀死或抑制革兰氏阳性菌，而对于革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌则无明显作用，故使其应用受到限制，将Nisin与其他防腐剂配合使用可以弥补这一缺点，进而发挥广谱抑菌作用。

有研究表明，Nisin与其他防腐剂联合使用能增强自身的抑菌作用，可获得较宽的抑菌谱。

Nisin和乳酸合用能抑制肉中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

Nisin与螯合剂(如EDTA)联合使用，对沙门氏菌具有一定的抑制作用，并能够有效减少其他G-菌的数量。

此外，Nisin与磷酸盐、柠檬酸盐合用也能提高其对G-菌的抑制效果。

乳酸链球菌素的抑菌机理
研究表明，Nisin是一个疏水、带正电荷的小肽，它能够吸附在革兰氏阳性敏感菌的细胞膜上，与细胞壁中带负电荷的物质(如磷壁酸、糖醛酸、酸性多糖或磷脂)作用，能够通过C末端的作用侵入到细胞膜中形成通透孔洞，抑制革兰氏阳性菌细胞壁的合成，改变细胞膜的通透性，引起细胞
中的小分子物质流出，同时，细胞外水分子流入，最后导致细胞自溶死亡。

Nisin对许多G+菌有抗菌活性，但对G-菌、酵母菌和霉菌没有作用。

对比G+细菌和G-细菌的细胞壁，可以发现G+菌的肽聚糖层明显比G-菌厚得多，而G-菌的细胞壁组成比较复杂，主要包括蛋白质、磷脂和脂多糖等，十分致密，仅能允许分子量在600Da以下的小分子通过，而Nisin分子量约为3510Da，所以无法通过致密的细胞壁，因此，Nisin就不能到达细胞膜进而发挥杀菌作用。

为了进一步证实这一说法，Steven及Kordel等研究报道，经过处理改变G-菌的外壁的透过性质之后，G-菌也对Nisin变得敏感，也可以被抑制或杀死。

这就有力证明了G-菌对Nisin不敏感是因为细胞壁太厚，Nisin分子进不去。

在Nisin杀菌过程中，其分子中所含的稀有氨基酸对Nisin的作用方式很大，对这一问题的研究进行得相当活跃，主要是通过蛋白质工程的手段，定向改变Nisin分子中一个或一段氨基酸的组成，以对其功能进行研究。

对这一领域的研究将使人们进一步了解Nisin的作用机制，以便扩大应用范围或增强作用效果。

乳酸链球菌素的安全性
乳酸链球菌素是一种天然的多肽物质，食用后可被人体内的蛋白酶(如胰蛋白酶、胰酶、唾液酶等)消化分解成氨基酸，无微生物毒性或致病作用，因此其安全性较高。

1956年，英国食品防腐剂委员会证实了在牛奶和干酪中自然存在有不同数量的乳酸链球菌素;1962年日本的Hara等证实乳酸链球菌素对小白鼠的半致死量LD50约为7g/kg bw，与普通盐的LD50值相近;英国和前苏联的商业部门对其生产的乳酸链球菌素进行了广泛的毒性和生物学研究，包括致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、脑功能、应激反应及动物器官病理学等诸多方面研究证明，Nisin是安全的。

通过毒理学试验证明，乳酸链球菌素小鼠经口急性毒性：雌性小鼠LD50为6.81g/kg bw，雄性小鼠LD50为9.26g/kg bw，属于实际无毒性。

乳酸链球菌素大鼠经口急性毒性：雌性大鼠LD50为6.81g/kg bw，雄性大鼠LD50为14.70g/kg bw，属于实际无毒性。

结果表明：乳酸链球菌素是安全的。

美国联邦法规规定已将乳酸链球菌素列为“一般公认为安全的(GRAS)”范围。

1992年3月，我国卫生部在批准实施的文件中就明确指出：“可以科学地认为乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的”。

目前全世界已有近50个国家制定了法律规定乳酸链球菌素作为食品防腐剂的使用范围和极限使用量，而英国、法国、澳大利亚等20多个国家则没有限量使用的规定。

乳酸链球菌素的应用举例
1.Nisin在肉制品中的应用
Nisin很早就已在国外应用于肉制品中，并广泛应用于肉类、鱼类的防腐保鲜。

据研究，在不影响香肠、火腿色泽和防腐效果的情况下加入乳酸链球菌素，可使亚硝酸盐含量明显降低。

在鱼类防腐方面，乳酸链球菌素还具有延迟熏制鱼中存在的肉毒梭菌芽孢毒素形成的作用。

Rayman(1981) 发现亚硝酸盐同乳酸链球菌素结合使用具有协同作用，Nisin可作为一种有效的替代物，减少火腿中发色剂的用量。

Nisin能有效控制肉制品中微生物的生长，尤其是抑制产生毒素的肉毒梭状芽孢杆菌的活性，并且Nisin本身呈酸性，能降低周围介质的pH值，因而能降低残留的亚硝酸盐含量，减少亚硝胺的形成。

另外，在加工过程中，过分的热处理会明显改变肉制品的质地及外观，加入Nisin后仅需45％的热处理即可延长其贮存期。

Nisin在我国肉制品的应用仅限于研究阶段。

2.在香肠中应用
在传统的香肠生产中，普遍使用亚硝酸盐等发色剂进行发色并抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，随后亚硝酸盐与肉毒素反应产生腌制红色和腌制风味。

当人们食用香肠的同时，也食用一定量的亚硝酸盐，与体内的胺类物质作用生成一种强烈的致癌物质——亚硝胺化合物，若添加Nisin到香肠中可降低亚硝酸盐的用量，又能有效地延长香肠的保质期。

据袁秋萍的试验表明，按传统工艺制作的香肠，亚硝酸盐的添加量为0.15g/kg,经检测菌落总数为12000个/g,若添加0.2g/kgNisin，亚硝酸盐的添加量减少到0.04g/kg,则香肠中的菌落总数降低到3200个/g，抑菌效果明显，而且香肠的色、香、味与传统的比较，没有明显的区别。

3.在猪肉丝中的应用
目前，在猪肉丝等肉干制品的生产中，普遍使用山梨酸钾作为防腐剂，由于山梨酸钾适用于pH5.5 以下的食品防腐，而肉类制品是中性食品，因此山梨酸钾对肉类制品的防腐效果不甚理想。

袁秋萍采用乳酸链球菌素代替山梨酸钾进行试验，添加量为0.4 g/kg时，所有稀释度均无菌落生长[ 6
]，这说明革兰氏阴性菌在煮制、加料烧干及烘培等工序中已被完全杀灭，受到热损伤的耐热芽孢杆菌此时也基本上完全被控制，其抑菌效果明显优于山梨酸钾，在口感上，添加Nisin的样品口味纯正，有利于提高产品的质量。

4.在烤肉中的应用
焦晓霞为了适当的延长烤肉的货架期，考虑在烤肉中添加适量的Nisin，进行了大量试验。

在其方案一中，Nisin的抑菌效果并不理想，样品在28℃恒温保存5-6d,就发生了质变酸败；在方案二中，另加入了0.04％的山梨酸，效果比空白实验的保质期延长了一星期之久；在方案三中，找出了一种更有效便捷的添加方式，保质期得到了大大的延长。

因此，从她的实验来看，在烤肉中添加适量的Nisin对抑制细菌生长繁殖，延长产品的保质期确实起到了一定作用，产品的保质期可以从28℃ 的4﹣5d延长到了20d[ 7 ]。

5.在冷却牛肉中的应用
山东农大的罗欣[8 ]（2000）将Nisin首次添加于牛肉冷却肉中，用于牛肉的保鲜。

探讨了不同浓度的乳酸链球菌素对高档牛肉的保鲜效果，以及与其他类型的防腐保鲜剂之间的相互作用。

罗欣将鲜牛肉在2℃条件下经24h预冷，用不同浓度的Nisin溶液浸渍30s，沥干，真空包装，80℃热水浸渍2s，4℃下贮存观察。

结果表明，75mg/L的Nisin在牛肉冷却肉的保鲜中起到明显的抑菌作用，细菌总数明显降低，且保鲜效果随质量分数的增加而增强。

Nisin与食品常用保鲜剂丙酸钙间无交互作用，与乳酸钠具有协同作用，与山梨酸钾具有拮抗作用。

6.在扒鸡中的应用
为了提高扒鸡的质量，延长货架期，还连栋[ 9 ]（2000）等将Nisin添加于扒鸡生产中，这样可以降低杀菌温度，使扒鸡的食用品质得到改善，保质期达半年以上。

银象生物化工厂提供的肉用型Nisin，用量为0.1 g/kg，软包装扒鸡从原杀菌温度121℃降为105℃，其他工艺条件不变，货架期也可以达到半年以上，口感与散装扒鸡接近，被消费者认可。

7.在西式切片火腿中的应用
火腿切片，一般是先熟化后再切片包装。

为防止二次污染，研究人员在切片中添加Nisin，在无菌化包装条件下，延长火腿切片的保质期。

孙京新在试验中添加Nisin300IU/g，延长货架期达到28 天，若与1.5％乳酸钠联合使用则能达到70天，并且降低了亚硝酸盐的含量[ 10 ]。

8.在其他的肉制品中的应用
孔保华应用Nisin进行红肠保鲜，显著地降低了细菌总数，在一定程度上能延长红肠的保质期，但单独使用效果不是很理想，最好能与其他办法结合使用[ 11 ]。

杨瑞得出即食腊肉制品中Nisin的最佳用法为：1g/L溶液浸渍，加热至80℃，时间8分钟[ 12 ]。

武运通过试验表明，在冷藏条件下的真空包装鲜羊肉中加入Nisin能够有效地抑制鲜羊肉中细菌总数和pH值的上升，从而达到保鲜的目的，但也发现，经Nisin处理的样品存在液汁流失过多和口味偏酸等特点，有待进一步研究解决。

天然食品防腐剂取代化学合成防腐剂是一种必然的趋势，乳酸链球菌素作为一种天然、高效、安全、无毒副作用的食品防腐剂，应用前景十分广阔。