DNA第2代测序技术

• Solexa技术在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好 地解决了同聚物长度的准确测量问题。
Hale Waihona Puke Baidu
图3. SOLiD测序技术流程
• SOLiD技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也 比较复杂。 • SOLiD技术每个循环的数据产出量为10-15 Gb，耗时约 为6-7天。 • SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达 2×50bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能 达到99.94 %以上。
1.6 第2代测序技术的前景
• 大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的 芯片测序技术。 • 新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。 • 但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封 闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变 异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系 统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上 高于芯片技术。
DNA第2代测序技术与遗传学发展
• 一. DNA第2代测序技术 • 二. 遗传学的发展 • 三.第2代测序技术对遗传学发展的影响
一. DNA第2代测序技术
1.1 什么是DNA第2代测序技术
• 第2代测序技术（next-generation sequencing）是对传 统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十 万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技 术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进 行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (deep sequencing)。
图1. 454测序技术流程
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A) 的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数 目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。 也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷 酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达 谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
• 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行 了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据 显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息 通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’ 端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。 而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无 法被发现的。
• 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞 生。 • 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组 到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本 高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经 过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的 454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的 SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。
1.2 为什么要发展第2代测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
图2. Solexa测序技术流程
• Solexa技术的读取长度可以达到2×75bp，相比454技术， 其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加。 Solexa技术主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插 入或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5 %之间。 • Solexa技术每个循环能获得20.5-25 Gb的测序结果，耗 时约9.5天。
1.5 第2代测序技术的应用
高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避 免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学 分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量 测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence) 。
• 2007年Van Orsouw等人结合改进的AFLP 技术和454 测 序技术对玉米基因组进行了重测序，所发现的超过75%的 SNP位点能够用SNPWave技术验证，提供了一条对复杂 基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性 分析的技术路线。 • 2008年Hillier对线虫CB4858 品系进行Solexa重测序，寻 找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。
• 高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非 编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技 术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度， 使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新 的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑 猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中 获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分 子和一类全新的小分子RNA。
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。