DNA第2代测序技术
第二代测序技术ppt课件
454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
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454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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二代测序法
二代测序法二代测序法是指第二代DNA测序技术，相对于第一代测序技术，它具有更高的通量、更快的速度、更低的成本和更高的准确性。
目前常用的二代测序技术主要包括Illumina、Ion Torrent和PacBio等。
一、Illumina二代测序技术Illumina公司是目前最为流行的二代测序平台之一，其基于桥式扩增（bridge amplification）和碱基荧光检测（base-by-base sequencing）原理进行DNA测序。
具体步骤如下：1.文库制备：将待测样本DNA片段通过随机引物PCR扩增得到文库。
2.芯片制备：将文库DNA片段固定在玻璃芯片上，并分成数百万个小区域。
3.桥式扩增：在每个小区域内进行PCR扩增，得到成千上万个同源重复DNA片段。
4.碱基荧光检测：通过加入不同颜色的荧光标记来区分四种碱基，并使用激光照射激发其发出荧光信号。
5.数据分析：将荧光信号转化为电信号并记录下来，通过计算机程序进行数据处理和分析，最终得到DNA序列。
Illumina二代测序技术具有高通量、高准确性和低成本等优点，适用于基因组、转录组和表观基因组等不同领域的研究。
二、Ion Torrent二代测序技术Ion Torrent公司是一家专门从事基于半导体芯片技术的DNA测序平台研发的公司。
其原理是通过碱基加入时产生的质子释放来检测DNA 序列。
具体步骤如下：1.文库制备：将待测样本DNA片段通过随机引物PCR扩增得到文库。
2.芯片制备：将文库DNA片段固定在半导体芯片上，并分成数百万个小区域。
3.碱基加入：在每个小区域内加入一种碱基，并检测质子释放信号。
4.数据分析：将质子释放信号转化为电信号并记录下来，通过计算机程序进行数据处理和分析，最终得到DNA序列。
Ion Torrent二代测序技术具有快速、简便和低成本等优点，适用于小规模的基因组和转录组测序研究。
三、PacBio二代测序技术PacBio公司是一家专门从事基于单分子实时测序技术的DNA测序平台研发的公司。
第二代DNA测序技术
焦磷酸测序法原理及步骤
• 第一步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱 基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，发生以下反应 • 第二步：上一步中生成的PP i和APS在硫酸化酶的催化下生成ATP，ATP可使荧 光素酶催化荧光素向氧化荧光素转化，同时产生可见光， 光信号强弱与ATP含量成正比， 又n（ATP）=n（PP i）=n（加入的dNTP），因此可根据光 信号强弱推知加入的dNTP的个数 •第三步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在 双磷酸酶的作用下降解 •第四步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可 读取准确的DNA序列信息
• （3）测序：加入测序试剂，在合成连结合一个碱基后，洗脱掉 游离的dNTP，然后在检测荧光信号后加入化学试剂淬灭荧光信 号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以此为一个循环，重复这个循 环即可测出该片段序列。
• Solid测序技术是第二代基因分析技术中准确度最高的。 • 测序原理：基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测 序。
磁珠乳化PCR（磁珠直 径约28um）
焦磷酸测序法
Solid技术
桥式PCR 磁珠乳化PCR（磁珠直 径约1um）
连接法测序
可逆终止物测序（类似 Sanger测序法） 100-150bp
400-600bp
50-75bp
谢谢倾听！
演示结束！
THANK YOU FOR WATCHING!
感谢聆听！
Sol直径约1um，在扩增的同时对扩 增产物的3’端进行修饰（为后面测序做准备） • （3）磁珠富集转至测序玻片 • （4）连原理 读长差异
454测序流程• （1）DNA制备：将待测DNA打断成300-800bp长的小片段， 末端修复后在片段两端加上不同的接头，变性处理回收单链DNA。
二代测序技术简介
二代测序技术简介一、什么是二代测序技术？二代测序技术，也被称为高通量测序技术，是一种快速、高效的DNA 或RNA序列测定方法。
相比传统的Sanger测序技术，二代测序技术具有较高的测序效率和容量，能够同时测序数百万到数十亿个碱基对，大大提高了测序的速度和数据产量。
常用的二代测序技术包括Illumina 测序技术、Ion Torrent PGM 测序技术等。
二、Illumina二代测序技术的原理与过程1. 原理Illumina二代测序技术基于桥式扩增和碱基扩增的原理。
DNA样本经过打断、连接和PCR扩增等处理后，将单链DNA固定于特定表面上，并在每个DNA分子之间形成成千上万个桥式扩增复合物。
在模板DNA的存在下，通过逐个反复封闭、复制和荧光标记的方式，进行碱基的逐渐扩增，并利用荧光信号记录测序结果。
2. 过程（1）样本制备：包括DNA或RNA的提取、打断、连接和PCR扩增等步骤，以获得特定长度的DNA片段。
（2）文库构建：将DNA片段连接到Illumina测序芯片上的适配器上，并进行PCR扩增，形成DNA桥式扩增复合物。
（3）测序芯片加载：将DNA桥式扩增复合物置于测序芯片上，使得每个DNA分子都与芯片上的特定区域相结合。
（4）桥式扩增：通过逐个反复封闭、复制和荧光标记的方式进行碱基的逐步扩增，形成簇团。
（5）图像获取：利用高分辨率成像系统拍摄簇团的荧光信号。
（6）数据分析：将图像数据转化为碱基序列，通过比对和组装等算法，得到原始测序数据。
三、Illumina二代测序技术的优势和应用领域1. 优势（1）高通量：能够在较短时间内产生大规模的测序数据。
（2）高准确性：其错误率低于其他二代测序技术，能够提供高质量的测序结果。
（3）可扩展性：适用于不同规模的测序项目，从几个目标区域到整个基因组的测序，具有较高的灵活性。
（4）低成本：相对于传统的Sanger测序技术，具有更低的测序成本。
2. 应用领域（1）基因组学研究：能够对物种的基因组进行全面测序和变异分析，有助于揭示基因组结构和功能。
简述一、二、三代测序技术
简述一、二、三代测序技术
一代测序技术
一代测序技术是一种拼接式测序技术，它可以将DNA片段进行拼接，从而得到DNA序列。
它是一种基于Sanger方法的技术，通过热板和冷板将DNA片段分别固定在支架上，再使用DNA聚合酶对支架上的DNA片段进行复制，最后通过测序仪来获取DNA序列信息。
一代测序技术已经被广泛应用于基因组学研究中，但是它仍然有很多缺点，比如时间短，费用较高，最大的问题是在测序过程中可能出现错误，这种错误很难被确认。
二代测序技术
二代测序技术是一种新的技术，它不需要DNA片段的拼接，而是使用DNA分子组装的方法来提取DNA序列信息。
该技术使用高通量测序技术，可以一次性同时测序大量的DNA片段，因此大大提高了测序效率，并减少了出错的几率，同时也降低了测序成本。
三代测序技术
三代测序技术是一种后续的测序技术，它能够更加精确地提取DNA序列信息，使用特殊的测序仪可以同时测定全基因组的DNA序列。
该技术采用短片段拼接的方法，可以实现更高精度的DNA序列测序，可以更好地发掘基因组中的变异位点，从而更好地研究遗传病和肿瘤的发生机制。
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
第二代测序数据分析原理
第二代测序数据分析原理第二代测序技术是近年来迅速发展起来的高通量测序技术，能够产生大量的DNA序列数据。
与第一代测序技术相比，第二代测序技术具有更高的产量、更快的速度和更低的成本，成为当前基因组学研究和医学诊断的重要工具之一第二代测序数据分析原理是指对产生的高通量测序数据进行处理和解读的过程。
该过程涉及到数据的质控、序列比对、变异检测和功能注释等多个步骤，以获取对生物学问题回答所需的信息。
下面将详细介绍第二代测序数据分析的原理。
1.数据质控数据质控是第二代测序数据分析的第一步，其目的是剔除低质量的序列，保证后续分析得到的结果的准确性。
主要的质控步骤包括去除低质量碱基、去除接头序列和过滤冗余数据。
这些步骤可以通过使用不同的软件工具来实现，如Trimmomatic、FastQC等。
2.序列比对序列比对是将测序数据与参考基因组进行比对的过程。
参考基因组可以是已知的基因组序列，也可以是人工合成的探针序列。
序列比对主要采用两种方法：短序列比对和长序列比对。
短序列比对常用的算法有Bowtie、BWA等，长序列比对常用的算法有BLAST、GSNAP等。
3.变异检测变异检测是根据测序数据中的变异信息来鉴定样本中存在的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（indel）等变异类型。
变异检测的过程主要包括变异鉴定、变异筛选和变异注释。
变异鉴定的方法包括泛素缺失、泛素纯化和下一代序列法。
变异筛选使用一系列的过滤条件来减少假阳性的产生，如频率过滤、质量过滤和功能过滤等。
变异注释是将检测到的变异与已有的数据库进行比对，以获取变异的生物学功能信息，如GEMINI、ANNOVAR等。
4.功能注释功能注释是将检测到的变异与基因、通路等功能元件进行关联，从而了解变异对生物学功能的影响。
功能注释的方法包括基因本体论（GO）、通路分析、蛋白质相互作用网络分析等。
这些方法可以帮助研究者理解变异的生物学意义以及变异在特定疾病中的作用机制。
综上所述，第二代测序数据分析原理包括数据质控、序列比对、变异检测和功能注释等多个步骤。
DNA第2代测序技术
从1910年到现在，遗传学的发展大致可以分为三个时期： 细胞遗传学时期、微生物遗传学时期和分子遗传学时期。 细胞遗传学时期 • 大致是1910～1940年， 这一时期通过对遗传学规律和染 色体行为的研究确立了遗传的染色体学说。这一时期中虽 然由美国遗传学家马勒和斯塔德勒分别在动植物中发现 了 X射线的诱变作用，可是对于基因突变机制的研究并没 有进展。基因作用机制研究的重要成果则几乎只限于动植 物色素的遗传研究方面。
• 20世纪90年代初美国率先实施的“人类基因组计划”， 旨在测定人类基因组全部约32亿个核苷酸对的排列顺序， 构建控制人类生长发育的约3.5万个基因的遗传和物理图 谱，确定人类基因组编码的遗传信息。 • 21世纪，遗传学的发展进入“后基因组时代”。
三. 第2代测序技术对遗传学发展的影响
• DNA测序技术是遗传学研究中发展起来的一个最基本的 技术，它使得研究者可以确定DNA片段的核苷酸序列 。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非 编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技 术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度， 使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新 的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑 猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中 获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分 子和一类全新的小分子RNA。
第二代基因测序技术的优劣比较
第二代基因测序技术的优劣比较一、简介随着科技的发展，基因测序技术也得到了快速的发展。
虽然第一代测序技术在科研领域具有重要的地位，但是由于其效率低、测序误差大等缺点，逐渐被第二代基因测序技术所代替。
本文将比较第一代基因测序技术和第二代基因测序技术的优劣，以帮助读者更好地了解两种技术。
二、第一代基因测序技术的优势和缺陷第一代基因测序技术是自1977年推出以来的第一种基因测序技术。
其优势在于，测序结果准确，通常需要对DNA进行纯化、分离和克隆等过程。
然而，第一代基因测序技术在效率、通量和经济性方面存在一些不足。
它需要大量的人力物力支持，测序成本非常高。
同时，由于它只能测序一小段DNA，因此样品的分析数量非常有限。
此外，第一代测序技术也无法对一些难以放大的DNA片段进行快速检测。
三、第二代基因测序技术的优势和缺陷第二代基因测序技术是一种高通量、高效率、高通过量的测序技术。
它克服了第一代技术一些缺陷，并且采用克隆无损伤的方法，可对整个基因组进行测序，具有广泛的应用前景。
与第一代基因测序技术相比，第二代技术具有更高的效率和可扩展性。
它可以同时测序多个DNA样品，并且不需要对样品进行太多的处理。
此外，这种技术的清晰度更高，通量更大，测序成本也更低。
但是，第二代基因测序技术在准确性方面存在些许缺点。
随着测序速度和通量的提高，测序质量也逐渐降低，存在一些误差和不完整的测序结果。
因此，使用第二代基因测序技术进行研究时，需要对结果进行仔细的检查和分析。
四、结论总之，在科研领域中，第二代基因测序技术采用极具优势，在效率、通量和成本等方面远远超越第一代技术。
尽管第二代技术存在一定的缺点，但是通过严谨的数据分析和测序结果检查，可以从中提取出可靠的信息。
未来，随着技术的进一步发展，第二代基因测序技术将会变得更加完善，为我们的研究工作提供更加可靠和强大的工具。
二代测序概念
二代测序概念二代测序概念一、引言随着生物学研究的不断深入，对于DNA序列的解读和分析需求越来越大。
传统的Sanger测序技术虽然被广泛应用，但由于其低通量、高成本等缺点，不能满足现代生物学研究的需求。
因此，二代测序技术应运而生。
二、二代测序技术简介二代测序技术是指将DNA分子通过PCR扩增或文库构建等方法转化为大量的片段，并在高通量平台上进行并行测序。
与传统Sanger测序技术相比，二代测序技术具有高通量、高准确性、低成本等优势，因此被广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
三、二代测序技术原理1. PCR扩增法PCR扩增法是将DNA模板通过PCR反应扩增成短片段，并在高通量平台上进行并行测序。
PCR反应过程中需要引物和酶的参与，其中引物是指能够特异性结合到待扩增区域的两个小分子，酶则是指能够催化DNA链的合成。
2. 文库构建法文库构建法是将DNA分子通过酶切或化学方法转化为小片段，并将这些片段连接到适当的载体上，形成文库。
在高通量平台上进行并行测序时，需要将文库中的DNA片段解离，使其单独存在，并进行测序。
四、二代测序技术流程二代测序技术流程包括样品准备、DNA提取、文库构建或PCR扩增、高通量测序和数据分析等步骤。
其中，样品准备是指从生物体中提取出所需的组织或细胞；DNA提取是指将样品中的DNA分子提取出来；文库构建或PCR扩增是将DNA分子转化为小片段，并连接到载体上；高通量测序是对文库或PCR产物进行并行测序；数据分析则是对测序结果进行处理和分析。
五、二代测序技术应用二代测序技术已经广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域。
其中，基因组学研究主要关注染色体结构和功能；转录组学研究主要关注基因表达水平和调控机制；表观基因组学研究主要关注DNA甲基化和组蛋白修饰等影响基因表达的因素。
六、二代测序技术发展趋势随着二代测序技术的不断发展，其应用领域也在不断扩大。
未来，二代测序技术有望应用于个性化医疗、环境监测、食品安全等领域，为人类健康和社会发展做出更大的贡献。
DNA第2代测序技术ppt课件
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
1.6 第2代测序技术的前景
• 大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的 芯片测序技术。 • 新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。 • 但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封 闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变 异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系 统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上 高于芯片技术。
高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达 谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
• 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行 了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据 显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息 通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’ 端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。454测序技术流程
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A) 的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数 目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。 也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷 酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
二代基因测序原理
二代基因测序原理二代基因测序技术是指通过高通量测序平台，实现对基因组的快速、准确、大规模测序。
它是基于DNA分子的扩增、测序和数据分析技术，能够在较短的时间内完成大规模基因组的测序工作。
二代基因测序技术的发展，为基因组学、转录组学、表观基因组学等领域的研究提供了强大的工具，也为医学诊断、药物研发、农业育种等领域带来了革命性的变革。
二代基因测序技术的原理主要涉及DNA分子的扩增、测序和数据分析三个方面。
首先是DNA分子的扩增，常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）和文库构建。
PCR是一种体外扩增DNA片段的方法，通过DNA聚合酶酶和引物，可以在较短的时间内扩增出数以亿计的DNA片段。
文库构建则是将DNA片段插入载体中，形成文库，以备后续测序使用。
其次是DNA分子的测序，目前常用的测序技术包括illumina、Ion Torrent、PacBio等。
这些技术都能够在较短的时间内完成大规模的DNA测序工作，且具有较高的准确性和灵敏度。
最后是数据分析，通过生物信息学分析软件，对测序得到的数据进行拼接、比对、组装和注释，最终得到基因组的序列信息和功能信息。
二代基因测序技术的原理虽然简单，但在实际应用中需要考虑到许多因素。
首先是样本的准备，包括DNA的提取、纯化和质量检测。
其次是测序平台的选择，不同的测序平台具有不同的优势和局限性，需要根据实际需求进行选择。
再者是数据分析的流程，需要根据实验设计和研究目的，选择合适的生物信息学分析软件和方法。
最后是结果的解读和验证，需要结合实验数据和生物学知识，对测序结果进行解读和验证，确保结果的准确性和可靠性。
总的来说，二代基因测序技术的原理虽然简单，但在实际应用中需要考虑到许多因素，包括样本的准备、测序平台的选择、数据分析的流程以及结果的解读和验证。
只有在这些方面做到严谨和完善，才能够保证测序结果的准确性和可靠性，为后续的基因组学研究和应用奠定坚实的基础。
二代基因测序技术的不断发展和完善，将为基因组学、医学诊断、药物研发、农业育种等领域带来更多的机遇和挑战，也将为人类健康和生活质量的提高做出更大的贡献。
第二代DNA测序技术
• Solid测序技术是第二代基因分析技术中准确度最高的。 • 测序原理：基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测
序。
连接法测序原理
• 合成新链所用酶：DNA连接酶
• 底物：8碱基单链荧光探针混合物—3’-XXnnnzzz-5’，根据XX 的不同在探针的5’末端分别标记了4种颜色的荧光染料 当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会 发出代表第1，2位碱基的荧光信号
连接法测序步骤
（1） 第一次连接反应由连接引物“n”介导，掺入一种8碱基荧光探针后 SOLiD测序仪记录下探针第1、2位编码区颜色信息 （2）化学处理除去6~8位碱基及5’末端荧光基团，暴露探针第5位碱基5’ 磷酸，为下一次连接反应作准备 （3）第二次连接反应得到模板上第6、7位碱基序列的颜色信息，而第三次 连接反应得到的是第11、12位碱基序列的颜色信息…… （4）测到末尾后，将新合成的链变性，洗脱。引物重置，开始第二轮的测 序
（1）第一次连接引物n-1比第一轮错开一位，所以此次得到0，1位碱基对的颜 色信息
（2）化学处理后，第二次连接反应得到的是5，6位碱基对的颜色信息，第三 次是10，11位碱基对的颜色信息……
•这样经过5轮测序后，可得到由颜色编码组成的SOLiD原始序列，只要知道所 测DNA序列中任何一个位置的碱基类型，就可以将SOLiD原始颜色序列“解 码”成碱基序列
第二代DNA测序技术简介
• 第二代DNA测序技术包括：Roche公司的454技术、illumina公司的 Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术
• 核心思想：边合成边测序 Βιβλιοθήκη 特点：读长短、通量高，成本低、测序快
• Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台 测序原理：焦磷酸测序法—4种酶催化的同一反应体系中的酶级联 化学发光反应 • 焦磷酸测序法反应体系：1个特异性的测序引物和单链DNA模板，
DNA第一代第二代第三代测序的介绍
DNA第一代第二代第三代测序的介绍
随着科技的不断发展，基因组测序在研究中占据了越来越重要的地位。
基因组测序最先包括Sanger流体扩增法，随着后来的发展，出现了今天
的第一代、第二代、第三代测序。
这三种测序方法在不同程度上具有其独
特的特点，其影响和应用也有所不同。
本文主要研究这三种测序方法的不
同特点，以及它们在基因组测序研究中的应用。
第一代测序是由美国普林斯顿大学的Fred Sanger博士发明的，也叫
做塞格尔流体扩增（Sanger Fluid Amplification）。
它是一种非常庞大
的基因测序方案，主要通过四种技术实现：复制，扩增，终止合成和测序
分析。
它的输出是一系列丰富的DNA序列，能够提供被测序DNA分子的准
确结构，可以显示出DNA片段中的突变和小片段的缺失或者增加。
然而，第一代测序方法的科学技术有一定的局限性，比如它的效率比
较低，耗费时间比较久，技术复杂度也比较大，还有噪声和错误率较高的
问题。
为了解决这些问题，研究人员推出了第二代DNA测序技术。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
一二三代测序技术总结
⼀⼆三代测序技术总结1、第⼀代测序技术概述：⽤的是1975年由Sanger和Coulson开创的链终⽌法或者是1976-1977年由Maxam和Gilbert发明的化学法（链降解）。
发展：除了Sanger测序技术，还出现了如连接酶测序和焦磷酸法测序，其中，连接酶测序是ABI公司SOLiD技术的测序基础，焦磷酸测序是可中断DNA合成反应的dNTP。
Roche公司454技术的测序基础。
这两者的核⼼思想都利⽤了Sanger测序技术可中断DNA合成反应的dNTP特点：（1）平均测序长度⼤约为250个碱基，准确率较⾼；（2）可直接测未克隆的DNA⽚段，不需要酶催化反应；（3）适合测定含有5-甲基腺嘌呤，G+C含量较⾼的特殊DNA⽚段以及短链核苷酸的序列。
缺点：测序成本⾼，通量低，速度慢。
2、第⼆代测序技术概述：有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa/HiSeq技术和ABI公司的SOLiD技术。
⽬前，Illumina的测序仪占全球75%以上的市场份边合成边测序的⽅法。
额，以HiSeq系列为主。
Illumina的及其采⽤的都是边合成边测序步骤;（1）构建DNA测序⽂库-超声打断加接头 （2）测序流动槽-吸附流动DNA⽚段 （3）桥式PCR扩增与变性-放⼤信号 （4）测序-测序碱基转化为光学信号特点：（1）测序速度较第⼀代，测序成本较第⼀代低，并且保持了⾼准确度；（2）测序读段较短，⽐第⼀代测序技术的读段要短很多，⼤多只有100bp~150bp；3、第三代测序技术概述：以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore公司的纳⽶孔单分⼦测序技术为标志。
特点：单分⼦测序；（1）与前两代相⽐，第三代测序技术是单分⼦测序⽆须进⾏PCR扩增（2）测序过程⽆须进⾏PCR扩增（3）具有超长读段，平均可达到10kbp ~ 15kbp，测序过程中这些序列的读段长度是不相等的。
高通量测序：第二代测序技术详细介绍
在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。
之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。
Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。
十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。
此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。
Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。
对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。
每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。
当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。
在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。
每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。
之后进行引物杂交和酶延伸反应。
由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。
同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。
酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。
Solexa 高通量测序原理--采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry）--可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。
--具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势--可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----将接头连接到片段上，经PCR 扩增后制成Library 。
二代测序建库原理
二代测序建库原理二代测序是指第二代测序技术，也称为高通量测序技术，是指在一次测序实验中能够产生大量的测序数据。
而建库则是指在进行测序前，需要将DNA或RNA样本进行一系列的处理，将其转化为适合测序的文库。
因此，二代测序建库原理即是指在高通量测序技术中，如何进行样本的建库准备工作。
首先，二代测序建库的第一步是DNA或RNA的提取。
提取的目的是获取待测序的DNA或RNA样本，这一步需要保证提取的样本纯度和完整性，以确保后续的建库工作能够顺利进行。
接下来是DNA或RNA的裂解和修复。
在这一步中，需要将提取得到的DNA或RNA样本进行裂解，将其分解为较短的片段。
同时，还需要对这些片段进行修复，修复的目的是为了在后续的连接过程中能够顺利进行。
然后是末端修饰和连接。
在这一步中，需要对DNA或RNA片段的末端进行修饰，以便于连接接头。
连接接头是为了在测序过程中能够将样本固定在测序仪的载体上，使得测序能够顺利进行。
接着是文库的放大和纯化。
在这一步中，需要对连接好的DNA 或RNA样本进行PCR放大，以获取足够的样本量进行后续的测序。
同时，还需要对放大后的文库进行纯化，去除杂质和无关的DNA或RNA片段。
最后是文库的定量和检测。
在这一步中，需要对建库后的文库进行定量，确定其中包含的DNA或RNA片段的数量和浓度。
同时，还需要进行质检，确保文库的质量符合测序的要求。
总的来说，二代测序建库原理包括提取样本、裂解修复、连接接头、放大纯化、定量检测等一系列步骤。
这些步骤的顺利进行对于后续的测序工作至关重要，只有建库工作做好了，才能够保证测序数据的准确性和可靠性。
因此，在进行二代测序建库时，需要严格按照原理进行操作，确保每一个步骤都能够达到预期的效果，从而为后续的测序工作奠定良好的基础。
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高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达 谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
• 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行 了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据 显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息 通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’ 端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。77年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞 生。 • 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组 到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本 高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经 过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的 454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的 SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。
图1. 454测序技术流程
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A) 的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数 目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。 也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷 酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
图2. Solexa测序技术流程
• Solexa技术的读取长度可以达到2×75bp，相比454技术， 其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加。 Solexa技术主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插 入或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5 %之间。 • Solexa技术每个循环能获得20.5-25 Gb的测序结果，耗 时约9.5天。
1.6 第2代测序技术的前景
• 大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的 芯片测序技术。 • 新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。 • 但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封 闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变 异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系 统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上 高于芯片技术。
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
• Solexa技术在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好 地解决了同聚物长度的准确测量问题。
图3. SOLiD测序技术流程
• SOLiD技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也 比较复杂。 • SOLiD技术每个循环的数据产出量为10-15 Gb，耗时约 为6-7天。 • SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达 2×50bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能 达到99.94 %以上。
DNA第2代测序技术与遗传学发展
•的发展 • 三.第2代测序技术对遗传学发展的影响
一. DNA第2代测序技术
1.1 什么是DNA第2代测序技术
• 第2代测序技术（next-generation sequencing）是对传 统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十 万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技 术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进 行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (deep sequencing)。
1.2 为什么要发展第2代测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非 编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技 术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度， 使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新 的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑 猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中 获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分 子和一类全新的小分子RNA。
1.5 第2代测序技术的入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学 分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量 测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence) 。
• 2007年Van Orsouw等人结合改进的AFLP 技术和454 测 序技术对玉米基因组进行了重测序，所发现的超过75%的 SNP位点能够用SNPWave技术验证，提供了一条对复杂 基因组特别是含有高度重复序列的植物基因组进行多态性 分析的技术路线。 • 2008年Hillier对线虫CB4858 品系进行Solexa重测序，寻 找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。