薄层色谱法详解
第七章薄层色谱法详解
第三节 操作方法及注意事项
一、仪器的性能检定 二、背景干扰的消除 三、样品测定操作方法
1、薄层板的制备 2、点样
3、展开 4、显色和定位
5、薄层扫描仪对斑点扫描
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1、薄层板的制备 要求：玻璃板需光洁，否则吸附剂易脱落；
大小由需求决定。
第29页，共57页。
1、薄层板的制备
（2）形成分子内H键时，被吸附力减弱；
（3）同系物中，分子量越大，极性越小，被吸附力越弱。
常见官能团极性顺序： 烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<酯类<酮类 <醛类<硫醇<胺类<醇类<酚类<羧酸类
第24页，共57页。
（二）展开剂（流动相）的选择
选择原则： 被分离成分极性大展开剂极性大 被分离成分极性小展开剂极性小
Rf越小,反之越大。
c b
B
第18页，共57页。
（二）比移值与相对比移值 （2）相对比移值Rs：为消除系统误差
原点到样品组分斑点中心的距离 Rs 原点到对照品斑点中心的距离
Rf<1, Rs不一定小于1。
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二、吸附薄层色谱中吸附剂与展开剂
（一）吸附剂（固定相）的选择 常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭和大孔吸附树脂
a、倾注法：
硅胶G或氧化铝G，直接加水调成糊状 硅胶或氧化铝，加羧甲基纤维素钠水溶液调成糊状
倒在玻璃板上
均匀铺开、振荡、晾干、活化、置干燥器中备用。
第33页，共57页。
（2）硬板的制备 b、平铺法： 过程：制板→振荡→晾干→活化→备用
优点：一次铺多块薄层板，简单易行。
经典色谱法分析技术—薄层色谱法(分析化学课件)
小
极性
大
薄层色谱固定相和流动相选择
2. 流动相展开剂的选择要求
薄层色谱分离中一般要求各斑点的Rf值在0.2～0.8之间，Rf值之 间应相差0.05以上.
3. 流动相展开剂的选择方法
如果单一展开剂分离效果不好，可用两种或两种以上的单一溶剂按 照一定比例混合而成的溶剂展开,可以达到较好的分离效果.
薄层色谱固定相和流动相选择 被测组分、吸附剂和展开剂的选择原则
常用溶剂的极性顺序为：
常用吸附剂的极性顺序为：
增
增
大
大
薄层色谱固定相和流动相选择
多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐
极 性
苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）
渐 黄酮、蒽醌等苷元、有机酸
小
香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分
烷烃＜烯烃
＜二甲胺＜酯类＜酮
＜醚＜硝基化合物
类＜醛类＜硫醇＜胺 类
＜酰胺类＜醇 类＜酚类＜羧 酸类
分离原理
吸附薄层色谱分离原理
展开（分离）
分离过程：
制板→点样→展开→显色→定性定量分析
固定相--吸附剂
薄层色谱的固定相所用的吸附剂
流动相---展开剂
薄板的底端浸入到适当的流动相溶剂
吸附薄层色谱分离原理
薄 层 色 谱
点样
展开剂
吸附薄层色谱分离原理
分离原理：
展开剂在毛细管的 浸润作用下，带着 各组分沿着薄板向
薄层色谱固定相和流动相的选择
薄层色谱固定相和流动相选择
一、固定相（吸附剂）的选择
1. 选择原则 根据被分离组分的极性选择吸附剂：
被分离组分的极性强——弱极性吸附剂； 被分离组分的极性弱——强极性吸附剂；
薄层色谱固定相和流动相选择
薄层色谱法
课程：分析制样技术
薄层色谱法
一、薄层色谱法概念及原理
• 薄层色谱法（常用TLC表示）又称薄层层析，属于固－
液吸附色谱。 • 样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之
间进行分离。由于吸附剂对不同组分的吸附能力的不同， 使它们在薄层上的移动速度也有差别，从而得以分离，显 然试样中吸附能力最弱的组分在薄层中移动距离最大，而 试样中吸附能力最强的组分在薄层中移动距离最小。
四、注意事项
1）展开时，层析缸中的有机溶剂蒸气必须达到饱和，否则，Rf值将不能重现。
2）在薄层用的吸附剂中，硅胶适用于酸性和中性组分的分离，碱性组分与硅胶有相互 作用，不易展开，或发生拖尾现象，不好分离；氧化铝适用于碱性好中性组分的分离 ，但不适用于酸性组分的分离。
3）如果单一展开剂效果不好，可以用混合溶剂，通过改变溶剂组分和比例来调整展开 剂的极性，从而达到分离效果的目的。
二、吸附剂与展开剂的选择
（2）展开剂：
选择展开剂时，主要考虑极性，其洗脱能力与极性成正比 。分离极性大的化合物赢选用极性展开剂，而分离极性小 或非极性的化合物应选用极性小的展开剂。 单一溶剂极性大小顺序如下： 酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯 仿>二氯甲烷>甲苯>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>石 油醚
① 蒸气显色法：利用样品组分与单质碘、液溴、浓氨水等物质的蒸气作用
而显色。将上述易挥发物质放于密闭容器中，再将展开剂已完全挥发的薄层板 放入则显色。
② 显色剂显色法：将一定浓度的显色剂溶液均匀喷洒在薄层上，是样品组
分显色。
③ 紫外显色法：某些化合物在紫外光照射下回发出荧光，可将展开剂挥发
TLC薄层色谱法
TLC薄层色谱法TLC（thin layer chromatography）是一种常用的薄层色谱法。
它是一种简单快速的分离技术，常用于分析和鉴定不同化合物的组分。
TLC的原理是在经过修饰的硅胶或氧化铝等固定相上进行分离。
样品溶液在薄层板上涂抹成薄层，然后将薄层板放入溶剂中进行运动。
溶剂沿薄层板上升，样品组分因吸附和流动速度差异而分离。
最后通过观察薄层板上的斑点，可以确定样品中的化合物。
TLC的操作简单，常用的仪器设备较少，所以被广泛应用于化学、药学、生物学等领域中。
下面我将详细介绍TLC的步骤和应用。
TLC操作步骤：1.准备薄层板：选择合适的固定相薄层板，如硅胶或氧化铝薄层板。
将薄层板根据需要切割为适当大小，并在板的底端画一个起始线。
2.准备样品溶液：将待分析的样品溶解在合适的溶剂中，经过充分的溶解后，可以使用微量移液管或吸管将样品溶液涂抹在起始线上。
3.运行：将涂有样品溶液的薄层板放入含有适当溶剂的槽中，使溶剂沿薄层板上升。
在运行过程中，在合适的距离上标记溶剂的前移距离，以保证足够的分离效果。
4.上样和开发：在溶剂前移到标记线附近时，将薄层板从溶剂槽中取出。
使用暗室或紫外灯观察薄层板上的斑点。
可以通过对比标准物质的斑点位置来确认化合物。
5.测量和分析：使用尺子或色谱扫描仪测量TLC板上各斑点的Rf值（移动度）。
Rf值是化合物移动距离与溶剂前行距离的比值，可以用于定量或比较分析。
TLC的应用：1.分析和鉴定化合物：TLC广泛应用于分析和鉴定化合物，通过观察斑点的颜色、形状和位置来确定化合物的组分。
2.纯化化合物：TLC也可用于纯化化合物。
当溶剂前移到一定位置时，可以用吸管垂直吸取斑点，将其转移到其他试管中，然后通过进一步的分离过程来分离纯化化合物。
3.制备层析：TLC还可以用于制备层析，即使用溶剂系统分离多个化合物，然后通过抽吸器或预柱收集纯化化合物。
4.检测杂质：TLC也可以用于检测杂质的存在，通过对比分析样品与标准溶液的斑点位置和Rf值，可以检测样品中的杂质。
薄层色谱方法
（3）其他固定相
①纤维素 按其用途不同分为普通纤维素（天然纤维
素、高纯度纤维素、微晶纤维素）、乙酰化纤 维素和离子交换纤维素。
②另外还包括聚酰胺，葡聚糖凝胶（亲水性葡 聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离 子交换剂）和硅藻土等固定相。
2、粘合剂及添加剂
（1）粘合剂 理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强
（二）薄层色谱与高效液相色谱的比较
色谱系统 展开方式 流速控制 平衡时间 分析样品 样品量 板高（μm） 有效板数 检测方式 溶剂用量 溶剂更换 固定相
薄层色谱
开放式 展开 吸附剂的毛细管作用 短 可同时分析多个样品 高 30 <600 静态 少 易 一次弃去
高效液相色谱
闭路 洗脱 由泵调节 不定 每次一个样品 低 2~5 ~5000 动态 多 难 反复使用
好的牢度，预制板有用玻璃板，塑料片或铝箔作为 载板，使薄层附着在上面，塑料片或铝箔的预制板 还有裁剪方便的优点。常用于薄层定量。
（2）手工制板 手工制板一般分为不含粘合剂的软板及
含粘合剂的硬板两种。
软 上用板手干是工法将制吸涂板附成所剂均用直匀的接的玻于薄璃玻层板璃即板可一般 为使用5c，m×但软20板cm疏，松1，0c操m×作不20方cm 或便 用，硬20因板cm此。×目2前0c很m少的使2m用m，厚主的要玻 璃板，要求板面平整，洗净后
几种不同点样方式的比较
A
B
C
A.长5~60mm，内径为0.2~0.05mm的熔融石英管；
B.微量注射器，机械控制，接触板面点样；
C.同B，用步进马达控制操作；
D.同B，完全用计算机控制点样。
方式 A B C D
薄层色谱详细资料大全
薄层色谱详细资料大全薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10×3cm左右）上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，晾干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。
待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。
基本介绍•中文名：薄层色谱•外文名：(Thin Layer Chromatography)•别名：薄板层析•类别属性：快速分离少量物质的实验技术原理,实验流程,注意事项,趋势,胶板,原理基本原理色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
薄层色谱是一种微量、快速和简便的色谱 ... 。
由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）：化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。
在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。
薄层色谱可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。
特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。
实验流程铺板点样展开显色计算Rf值铺板取7.5x2.5cm左右的载玻片5片，洗净晾干。
在50mL烧杯中，放置3g矽胶G，逐渐加入0.5﹪羧甲基纤维素钠水溶液(CMC)8mL，调成均匀的糊状，涂于上述洁净的载玻片上，用手将带浆的玻片在水平的桌面上做上下轻微的颠动，制成薄厚均匀、表面光洁平整的薄层板，涂好的矽胶G的薄层板置于水平的玻璃板上，在室温放置0.5h后，放入烘箱中，缓慢升温至110℃，恒温0.5h后取出，稍冷后置于干燥器中备用。
薄层色谱法概述
目录
CONTENTS
• 薄层色谱法的定义与原理 • 薄层色谱法的实验材料与设备 • 薄层色谱法的操作步骤 • 薄层色谱法的应用与优势 • 薄层色谱法的实验数据处理与分析 • 薄层色谱法的实验注意事项与安全防护
01 薄层色谱法的定义与原理
定义
薄层色谱法是一种基于吸附或分配原 理的分离技术，用于分析、分离和纯 化混合物中的组分。
显色与检测
根据待测组分的性质选择合适的显色剂或检测方法，如荧光 剂、紫外灯、红外光谱等。
对于不显色的组分，可以采用放射性标记或电化学检测等方 法进行检测。
04 薄层色谱法的应用与优势
在药物分析中的应用
药物成分分离
01
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
薄层色谱法可用于分离药物中的不同成分，如有效成分、杂质
和降解产物。
药物鉴别
02
薄层色谱法需要在无尘的 环境中进行，因此实验室 内应保持清洁，避免灰尘 对实验结果产生影响。
薄层色谱法的实验过程中 ，温度和湿度的变化会影 响实验结果，因此应确保 实验室内的温度和湿度保 持恒定。
根据待分离物质的性质选 择合适的吸附剂和展开剂 ，以确保最佳的分离效果 。
展开剂的纯度对薄层色谱 法的分离效果有很大影响 ，因此应使用高纯度的展 开剂。
通过薄层色谱法可以对比已知药物与未知药物的色谱图，进行
药物鉴别。
药物含量测定
03
薄层色谱法可以用于药物中有效成分的定量分析，确定药物含
量是否符合标准。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
薄层色谱法可用于检测食品中是否添加了非法或 超标的添加剂，如色素、防腐剂等。
农药残留分析
薄层色谱法可用于检测果蔬等农产品中农药残留 量，确保食品安全。
中国药典版--薄层色谱讲义
3.展开剂中加入少量酸，碱可抑 制某些化合物的拖尾现象。
4.展开剂中加入丙酮等中等极性 溶剂可使不相混合的溶剂混溶，并降 低展开剂的粘度，加快展速。
b. 展开方法
点样后的薄层板置入展开剂的薄层展 开箱中，密闭，用合适的展开剂展开。展 开剂浸入薄层下端高度不应超过5mm。点 样处不能接触展开剂，展开至规定展距后 立即将薄层板取出，晾干，以备检测。
仪器介绍 ： 1.把样品以条带状喷射在TLC/HPTLC薄层板上 2.喷雾点样技术相比,接触式点样可将更多样品点在薄 层板上
3.在点样过程中样品被浓缩到所选取长度的狭窄条带 中条带状点样可得到最高的分辨率，对所有薄层色谱工作 都有益 4.CAMAG半自动点样仪5能够通过IQ/OQ质量认证并且应 用于GMP/GLP环境中。
• 薄层色谱就是将吸附剂均匀地铺 在玻璃板上，把欲分析的样品加到薄 层上，然后用合适的溶剂展开而达到 分离、鉴别和定量的目的，因为层析 是在薄层上进行，所以称它为薄层色 谱法
前 景
近年来，由于薄层扫描仪的出现以 及高质量的预制板、高效薄层板的应用 以及上样技术的改进。目前，薄层色谱 已经进入仪器化、高效化、定量化及数 据处理自动化阶段，即向仪器化薄层色 谱发展。
第二节 薄层色谱的基本技术
原
理
薄层色谱法是色谱法中应用最普 遍的方法之一，薄层色谱法按分离机 制可分为吸附、分配、离子交换等方 法。其中吸附色谱是最常用的层析方 法，吸附色谱的原理是利用吸附剂对 不同物质的吸附力大小，从而达到分 离的目的。
因此，当溶剂流过时，不同物质在 吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附， 解吸附，再吸附，再解吸附。易被吸附 的物质（吸附性强的物质），相对地移 动慢一些，而较难吸附的物质相对地移 动快一些。经过一段时间的展开，不同 的物质就被彼此分开，最后形成相互分 离的斑点。
薄层色谱法
特点
快，需十至几十分钟，同时展开多个 试样。
试样预处理简单，对试样限制少。 仪器简单，操作方便。 分离能力较强。 灵敏度较高。
发展简史
1938年N.A.Izmailor和M.S.Schraiber首 次在显微镜载玻片上涂布的氧化铝薄层 用微量圆环技术分离了多种植物酊剂中 的成分。
50年代J.G.Kirchner及ler以硅胶 为吸附剂，煅石膏为粘合剂涂布于玻璃 载板上制成硅胶薄层，成功地分离了挥 发油 。
Ri,s值
Ri,s= b/a
前沿
与组分、色谱条件、参考物质有
关。
参比物i
Ri,s值可以大于1，也可以小于1。 被测物s
a
重现性和可比性均比Rf值好，能
b
消除系统误差（参考物质与组分 原点 ×
在完全相同的条件下展开）
(b)
分配系数
K= Cs /Cm
在分离达到平衡时，组分在固定相的浓度Cs和 流动相的浓度Cm之比。
3.薄层色谱法的误差来源有哪些？
1、 已知A，B两物质在某薄层色谱系统中的 分配系数分别为100和120，哪一个的Rf值小 些？
答：因为在薄层色谱中，组分的分配系数与 比移值成反比关系，所以，分配系数为120的 组分Rf值小些。
2、 在薄层色谱中，以硅胶为固定相，氯仿为流 动相时，试样中某组分Rf值太大，若改用氯仿-甲 醇（2∶1）时，则试样中该组分的Rf值会变得更 大，还是变小？为什么？
– 点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离 度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。
– 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul）， 微量注射器。
展开
展开方式：上行展开
展开过程：
展开缸预先用展开剂饱和，平衡系统， 薄层板浸入展开剂展开（距边缘0.51cm），挥干展开剂
TLC薄层色谱法
TLC薄层色谱法
包括介绍原理原理、原理图示、步骤介绍、优缺点、应用等
薄层色谱法（Thin Layer Chromatography, TLC）是一种在溶剂中进行二次溶剂不相溶混合物体色谱分离的方法，它是一种具有《小量样品，大量应用》的理想体色谱分离方法。
一、薄层色谱（TLC）原理
薄层色谱是一种属于液-液色谱分离技术的一种，它是溶剂在平板上水平运动，混合物在溶剂的作用下而被分离的。
薄层色谱是根据混合物中各成分在不同溶剂中的挥发速率不同而决定的。
各成分在溶剂的等张边界上逐渐散开，最后各个成分分散在溶剂中的位置不同，在同一溶剂中反映出各自的条带图象，这就是分离反应现象。
二、薄层色谱（TLC）步骤
1、膜制备：在平板上涂布膜，将膜沾湿液。
2、样品加样：将被分离物质溶液（样品或样品混合溶液）通过滴移管滴在膜上，形成一个小胶斑，然后以热风吹干。
3、烘干：将膜放在干燥无油的金属箱内，将恒温烘箱或水浴中，均匀加热干燥膜，以保持平地。
薄层色谱法简介
固定相的选择：
✓ 硅胶 • 无定形多孔性物质，略具酸性， 适用于酸性和中性物质的分离 和分析。
✓ 氧化铝 • 有中性、酸性、碱性三种类型。 • 中性氧化铝（pH7.5）的用途 最广，适用于分离生物碱、萜 类、甾体、挥发油及酸碱中不 稳定的苷类、内酯类等化合物。
应用
优点
该技术中所应用的薄板是 采用颗粒较细的吸附剂利 用喷雾法制成的，具有涂 层均匀、重现性好等优点
定义
用高分离效能薄层 板的色谱法
比较
利用HPTLC指纹图谱， 通过比较斑点数目、 顺序和相对强度(或者 光密度扫描产生的峰) 可以进行稳定性测试
高效薄层板较普通薄层 板颗粒直径小，颗粒度 分布窄，分辨率提高， 展开距离缩短，因而展 开时间缩短，3～20min
可以完成一次分析
固定相的改造
2、反相薄层色谱法
概述 操作 应用 拓展
01
定义
利用化学键合反应， 将烃基键合到硅胶表 面，制成非极性固定 相，用极性较大液 体作流动相进行分离 分析的方法
02
优点
斑点扩散小，而且分 离效果高；化学键合 相硅胶的硅烷化程度 可调，为分离提供选 择性，因此可根据需 要挑选合适的固定材 料，获得最好的分离
✓ 聚酰胺 • 分离极性和非极性物质。（尤 其在黄酮类化合物、蒽醌类、 酚类化合物的分离方面，有明 显优势）
概述 操作 应用 拓展
1.薄层板的制备
• 薄层铺板的厚度 及均匀性对样品 的分离效果极大
• 一般厚度0.25mm 为宜
• 硬板的制备: 匀浆、制板 晾干、活化
薄层色谱方法总结
2、展开 将点好样品的薄层板放入展开
缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为 距原点5mm为宜，密封，待展开至规 定距离（一般为8～15cm），取出薄 层板，晾干，待检测。 注：展开缸如需预先用展开剂预平衡， 可在缸中加入适量的展开剂，密闭， 一般保持15－30分钟。
3、显色与检视 供试品含有可见光下有
3.类极性大的小分子有机酸
没食子酸：氯仿－醋酸乙酯－甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊 苣酸、绿原酸、异绿原酸。例如下面以苯丙烷为极性小部分，随 着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加 了。依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。相应展 开剂分别为：正己烷—乙醚—冰醋酸(5:5:0.1)、苯－冰醋酸－甲 醇(30:1:3)、氯仿－甲醇－甲酸（9:1: 0.5）、石油醚－乙酸乙酯 －甲酸（3:6: 1）、醋酸丁酯－甲酸－水(7:2.5:2.5)。
纯”，溶剂组成采用体积量比（如正丁醇 冰乙酸 - 水= 4：1：1，V/V/V），或者绝 对量（如18ml 甲苯 + 2 ml 甲醇）。其总量 应足以使TLC/HPTLC 板的浸入深度约为 5mm。展开剂要求新鲜配制，不要多次反 复使用，如需分层，则按要求放置分层后 取需要的一相（上层或下层），备用。
六、薄层层析和纸色谱操作注意事项
1、点样 点样器点样于薄层板上,一般
为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm， 样点直径一般不大于2mm,点间距离可 视斑点扩散情况以不影响检出为宜。 若因样品溶液太稀，可重复点样，但 应待前次点样的溶剂挥发后方可重新 点样，以防样点过大，造成拖尾、扩 散等现象，而影响分离效果。点样时 必须注意勿损伤薄层表面
二、展开剂的选择条件
1.对所需成分有良好的溶解性 2.可使成分间分开 3.待测组分的Rf在0.2-0.8之间，定量测定
薄层色谱法的5个步骤
薄层色谱法的5个步骤薄层色谱法是一种常用的色谱分析方法，它可以将样品中的各个组分分离出来，并且可以用于定性定量分析。
下面是薄层色谱法的五个步骤：1.分离薄层色谱法的第一步是分离。
这一步是通过将样品溶液点样在薄层板上，然后将其放入色谱缸中，加入流动相，使流动相在薄层板上行走，将样品中的各个组分分离出来。
分离的效果取决于流动相的性质、点样量、流动相的流速和薄层板的性质等因素。
2.涂层在薄层色谱法中，涂层是非常重要的一步。
涂层可以防止样品中的各个组分在分离过程中扩散，同时也可以提高分离的效果。
常用的涂层材料有硅胶、纤维素和聚酰胺等。
涂层的厚度和均匀度都会影响分离的效果。
3.喷洒喷洒是指在分离之后，将固定相喷洒在薄层板上，使固定相与薄层板结合。
这样可以提高分离效果，并且可以使薄层板更加稳定。
常用的固定相有硅胶、纤维素和聚酰胺等。
4.显色在薄层色谱法中，显色是非常重要的一步。
通过显色可以清楚地观察到样品中的各个组分的分离情况。
常用的显色方法有物理显色和化学显色两种。
物理显色是基于不同物质对光的反射和吸收能力的不同来实现的；化学显色则是基于物质之间的化学反应来实现的。
5.识别在薄层色谱法中，识别是非常重要的一步。
通过识别可以确定样品中的各个组分。
常用的识别方法有观察颜色、测量Rf值和比较标准品等方法。
观察颜色可以初步判断组分的性质；测量Rf值可以确定组分的移动距离；比较标准品可以确定组分的具体种类。
以上就是薄层色谱法的五个步骤：分离、涂层、喷洒、显色和识别。
在实际操作中，可以根据不同的需求和目的进行相应的调整和优化。
薄层色谱法原理
非极性
A’ A
非极性
极性
被分离物质
展开剂成分的选择：
对于容易分离的化合物，用单一溶剂展 开
优点：溶剂简单，分离重现性好。 对于难分离组分，则选用二元、三元、
甚至多元溶剂 Rf太小——加入强极性展开剂 Rf过大——降低展开剂的极性
优化
1.占比例较大的溶剂为主要溶剂，可使 试样组分溶解并基本分离。 占比例较小的溶剂可进一步调整各组 分Rf值，改善分离效果。
• 常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭和大孔吸 附树脂等。
• 吸附剂的选择要合适，与流动相、被分离化合物不反应
• 2、流动相（展开剂）
薄层色谱法中采用单一溶剂或多元 混合溶剂作流动相，称为展开剂。
与吸附柱色谱法中选择流动相的一 般规则相同，展开剂的选用要从被分 离试样组分极性、吸附剂活性和展开 剂的极性三个因素综合考虑。
原点
A
B
比移值Rf
溶剂
前沿
原点到斑点中心的距离
Rf 原点到溶剂前沿的距离
c a
起始线
b
AA BB
Rf
a R
c
st
b c
Rf值相差越大，分离越好。一般要求分 离后组分的Rf值在0.2～0.8之间，各组 分的Rf值之差应大于0.05，以防斑点重 叠。
（二）固定相和流动相
• 1、固定相（吸附剂）
吸附剂和展开剂的选择
• 对于极性较小的被分离试样组分，应 选用活性较强的吸附剂，极性较小的 展开剂；
• 对于极性较大的被分离试样组分，应 选用活性较弱的吸附剂，极性较大的 展开剂。
被分离试样组分极性、吸附剂活性和展开剂极性之 间的关系
活泼 Ⅰ
极性
薄层色谱鉴别介绍
概念
薄层色谱法(TLC)
将固定相(如硅胶)薄薄地均匀涂敷在底板 (或棒)上，试样点在薄层一端，在展开罐内 展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同 ，形成互相分离的斑点，测定各斑点的位置 及其密度就可以完成对试样的定性、定量分 析的色谱法。
基本原理
薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它 利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在 移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程 中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解 吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。
较差
实验操作
❖ 实验仪器 ⑴ 载板 ⑵ 固定相（吸附剂）或载体 ⑶ 涂布器 ⑷ 点样器 ⑸ 展开室
实验操作
1 薄层板的制备
调制 涂布
吸附剂（硅胶）
玻璃板
粘合剂、添加剂
调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。 均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。 使用前放入烘箱内，在105-115℃左右烘干40-50min。冷 却后使用。
❖ 在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚 度等），化合物移动的距离和展开剂移动的 距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理 常数，其大小只与化合物本身的结构有关， 因此可以根据Rf值鉴别化合物。
组分二 组分一
比移值
被分离 混合物
薄层色谱展开示意图
薄层色谱法
优点 操作简单，定性结果直观 缺点 有一定毒性、定量方面的精密度
❖ 否则预饱和的效果全被你后期的
❖ 操作给抹杀了！！
D 薄层板类型的影响
D1滤纸
纸色谱中所用的滤纸性质对分离效果有很大影响。 对滤纸的要求是：
1. 物理性质均匀、 质地均一、厚薄一致，否则斑 点畸形，Rf值改变; 2. 具有一定的机械强度; 3. 纤维松紧程度适当; 4. 具有一定的纯度; 5. 纸面洁净，不含有溶于水及有机溶剂的物质。
薄层色谱法——精选推荐
（1）．硅胶：是最常用的薄层固定相，90％以上分离工 作都应用之。
１） 普通型硅胶：无定型多孔粉末，表面带有硅醇基， 呈弱酸性。因为有一羟基(silanol Si-OH)，呈弱酸性 （PH = 4.5）, 通过硅原子上的羟基与极性化合物或 不饱和化合物形成氢键， 所以表现为吸附性能。硅胶 吸附水分形成水合硅醇基，降低吸附能力。通常在 150℃活化后失水提高活度，此时约有4－6个硅醇基 /nm2,。（温度大于500℃，硅胶脱水形成硅醚（Si－ O-Si）,而失去吸附能力）。
的尺度，与传递阻滞有关；
表面积越大，表明其吸附力越大，有较强的 保留。
4）硅胶薄层板的厚度
普通薄层厚度为250μm, 高效薄层板为200μm， 制备薄层板厚度 0.5-2 mm
5）市售硅胶及预制板规格（符号及含义）
硅胶G: 是含有13％煅石膏（gypsum）黏合
剂的硅胶
硅胶H：不含黏合剂的硅胶
2．氧化铝：在薄层中其应用仅次于硅胶。由 氢氧化铝400－500℃煅烧而成。广泛的用 于萜类，生物碱，脂肪类，芳香类化合物 的分离。因制法和处理方法不同可分为碱 性，酸性，中性三类
⑴ 碱性氧化铝：PH 9－10适于中性、碱性 化合物的分离
⑵ 酸性氧化铝：PH 4－5适于酸性化合物的 分离
⑶ 中性氧化铝：PH 7－7.5适于酸性或对碱 不稳定的化合物的分离
由于该板易吹散，现已比较少用，多用硬板。
（2）湿法铺板： 一般都要加黏合剂，故称粘合薄层板（硬板）。 常用两种硬板为：硅胶G、硅胶 +CMC-Na
硅胶G板铺制：G的含量为10－13％，制板时每份 硅胶G + 水2－3份，研成糊状，倒在板上铺布。 硅胶CMC-Na板铺制: 硅胶H或硅胶G + CMC-Na 水溶液（0.5％）（1：3），研成糊状，倒入板上 铺布。
0502-薄层色谱法
0502 薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1.仪器与材料（1）薄层板按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。
固定相中可加入黏合剂、荧光剂。
硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、G、H表示含或不含石膏黏合剂。
F254为在紫外光254nm波长下显绿色背景的荧光剂。
按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～40μm）和高效薄层板（5～10μm）。
在保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。
固定相颗粒大小一般要求粒径为10～40μm。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
、（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。
水平展开用专用的水平展开槽。
（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。
暗箱内光源应有足够的光照度。
（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法（1）薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。
聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板、塑料薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的固定相层不得有破损。
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薄层板的活化：硅胶板于105-110℃烘30分钟，氧化铝板于150-160℃烘4小时，可得活性的薄层板。
点样
点样
点样方式：分为手动点样和自动点样。手动点样主要器具为微量毛细管、微量注射器等。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。手动点样灵活方便，常用于各种TCL鉴别中，器具以微量毛细管最常用。仪器的自动点样准确性好，常用于薄层扫描法的含量测定。
影响展开的因素
制备离心色谱仪
A相对湿度的影响
B溶剂蒸汽的影响(a展开室的饱和b预吸附)
C温度的影响
D展距的影响与分离度仅正比与展距的平方根
显色
A光学检出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显出不同颜色的荧光斑点(灵敏度高、专属性高)
B蒸汽显色法
显色
多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。
显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。b浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。
显色试剂
a通用显色剂硫酸溶液(硫酸：水1：1，硫酸：乙醇1：1)、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高锰酸钾溶液、碱性高锰酸钾溶液(还原性化合物在淡红色背景上显黄色斑点)
仪器与材料
编辑
⑴载板
变色硅胶
用以涂布薄层用的载板有玻璃板、铝箔及塑料板，对薄层板的要求是：需要有一定的机械强度及化学惰性，且厚度均匀、表面平整，因此玻璃板是最常用的。载板可以有不同规格，但最大不得超过20×20，玻璃板在使用前必须洗净、干燥备用。玻板除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。
吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。
物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。
展开剂的配制：配制展开剂时，应严格控制其比例准确度，如遇到比例很小的溶剂时，应尽量满足其精确度要求，而不是为图方便省事直接用滴管加入。展开剂配好后如果浑浊不清，不能立即使用。应转移入分液漏斗中，待其静置分层澄清后再取其上层(或下层)液进行展开。
展开剂的用量：展开剂的用量以薄层板放入的深度为距原点5mm为宜，切勿倒入过多，将原点浸入展开剂，成分将被展开剂溶解而不随展开剂在板上分离。
薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，连续的产生吸的。
薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。
(2)样品的溶剂：样品在溶剂中溶解度很大，原点将变成空心圆，影响随后的线性展开，所以原则上应选择对被测成分可以溶解但溶解度不是很大的溶剂。供试液的溶剂在原点残留会改变展开的选择性，亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分(特别在高湿度环境)对色谱质量也会产生影响，因此除去原点残存溶剂是必要的，但对遇热不稳定和易挥发的成分，应避免高温加热，以免成分被破坏或损失。
例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。
展开方式总的来讲平面色谱的展开有线性、环形及向心3种几何形式。
A单次展开用同一种展开剂一个方向展开一次，这种方式在平面色谱中应用最为广泛。(垂直上行展开，垂直下行展开，一向水平展开，对向水平展开)
B多次展开单向对此展开，用相同的展开剂沿同一方向进行相同距离的重复展开，直至分离满意，广泛应用于薄层色谱法
展开
薄层展开
展开剂也称溶剂系统，流动性或洗脱剂，是在平面色谱中用作流动相的液体。展开剂的主要任务是溶解被分离的物质，在吸附剂薄层上转移被分离物质，使各组分的Rf值在0.2~0.8之间并对被分离物质要有适当的选择性。作为展开剂的溶剂应满足以下要求：适当的纯度、适当的稳定性、低黏度、线性分配等温线、很低或很高的蒸气压以及尽可能低的毒性。
b专属显色剂
⑸测定比移值
在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。
⑹薄层扫描
薄层扫描法指用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测层析谱。对于中成药复方制剂，亦可用相应的原药材按需要组合作阴、阳对照，然后比较其薄层扫描图谱加以鉴别。使用仪器为薄层扫描仪。
C双向展开用于成分较多、性质比较接近的难分离组分的分离。
薄层展开室需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中)，密封室盖，待展开至规定距离(一般为10～15cm)，取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。
⑵固定相(吸附剂)或载体
薄层层析硅胶薄层层析硅胶最常用的有硅胶G、硅胶GF〈[254]〉、硅胶H、硅胶HF〈[254]〉，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F〈[254]〉等。其颗粒大小，一般要求直径为10～40μm。薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15%煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7%)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓冲液的薄层。
如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。[3]
手工制板一般分不含粘合剂的软板和含粘合剂的硬板俩种。
常用吸附剂的基本情况：颗粒的大小，太大洗脱剂流速快分离效果不好，太细溶液流速太慢。一般说来吸附性强的颗粒稍大，吸附性弱的颗粒稍小。氧化铝一般在100-150目。氧化铝分为碱性氧化铝，适用于碳氢化合物、生物碱及碱性化合物的分离，一般适用于PH为9-10的环境。中性氧化铝适用于醛、酮、醌、酯等PH约为7.5的中性物质的分离。酸性氧化铝适用于PH4~4.5的酸性有机酸类的分离。氧化铝、硅胶根据活性分为五个级，一级活性最高，五级最低。
溶剂蒸气的作用：溶剂蒸气在薄层色谱中起着重要作用，它和液相(展开剂)、固定相(吸附剂)一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程。
溶剂的质量：展开剂中溶剂的质量直接影响薄层色谱分离能力。如果含有杂质超标、水分超标以及吸收空气中干扰气体等，均可影响分离结果。如甲酸乙酯遇水容易水解，如用多次开瓶的残存溶剂，因逐渐吸收大气中的水分而不同程度地分解，所得的色谱与用新鲜溶剂所得色谱有明显差别。展开剂展开后，溶剂比例发生变化，勿重复使用。
点样应注意的问题：
(1)点样量：原点位置对样品容积的负荷量有限，体积不宜太大，一般为0.5~10μl，样品的浓度通常为0.5~2mg，太浓时展开剂从原点外围绕行而不是通过整个原点把它带动向前，使斑点脱尾或重叠，降低分离效率。点样量太小，不能检出清晰的斑点影响判断。点样量太多，展开剂不能全部负载，容易产生脱尾现象。当点样量适合时，可采用点状点样；当点样量过大，原点无法负荷时，可采用条带状点样，得到更好的分离效果，提高分辨率。
操作
编辑
薄层板制备
薄层板
除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2～0.3mm)，取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视)。