蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤

蛋白质印迹分析实验原理与操作步骤

蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或

多克隆抗体进行识别。

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印迹法

【实验原理】

蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或多克隆抗体进行识别。

如图所示,可溶性抗原,也就就是待测蛋白首先要根据其性质,如分子量,分子大小,电荷以及其等电点等采用不同得电泳方法进行分离;通过电流将凝胶中得蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上;利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合得原理,以抗体作为探针钓取目得蛋白。值得注意得就是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白,如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜得非特异性结合。

经电泳分离后得蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用得两种电转移方法分别为:

１。半干法: 凝胶与固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿得滤纸之间,通电时间为1０分钟~３０分钟。

2.湿法:凝胶与固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中,转移时间可从45分钟延长到过夜进行、由于湿法得使用弹性更大并且没有明显浪费更多得时间与原料,因此我们在这里只描述湿法得基本操作过程。

对于目得蛋白得识别需要采用能够识别一抗得第二抗体。该抗体往往就是购买得成品,已经被结合或标记了特定得试剂,如辣根过氧化物酶。这种标记就是利用辣根过氧化物酶所催化得一个比色反应,该反应得产物有特定得颜色且固定在固相载体上,容易鉴别。因此可通过对二抗得识别而识别一抗,进而判断出目标蛋白所在得位置。其她得识别系统包括碱性磷酸酶系统与125I标记系统、

1。实验器材

ＳDＳ／PAGE实验相关材料;电转移装置;供电设备;PＶDＦ膜(Millipore Imｍoｂion－Ｐ# IPVH0０010);Ｗhａtmａn 3MM 纸;其她工具:镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。

易生物仪器库:

易生物试剂库: ﻫ

2、实验试剂

⑴10x转移缓冲溶液(1Ｌ):３0。３gＴrizma ｂａse(０、25M), 14４g甘氨酸(1、9２M),加蒸馏水至1L,此时pH约为8、３,不必调整。

⑵1x转移缓冲溶液(2L):在1、４L蒸馏水中加入４00ml甲醇及200ｍl10x转移缓冲溶液。

⑶TBS 缓冲溶液:将1。22gＴrｉｓ(１0mＭ)与8、78ｇNaCl(15０mＭ)加入到1 L蒸馏水中,用HＣｌ调节pH至７、5。

⑷TTBS ｂufｆｅr:在1ＬＴＢS 缓冲溶液中加入0。5ｍｌTween 20(0.05％)。

⑸一抗:兔抗待测蛋白抗体(多克隆抗体)。

(6) 二抗:辣根过氧化物酶标记羊抗兔。

⑺3％封阻缓冲溶液(0。５Ｌ):牛血清白蛋白1５mg加入TBS缓冲溶液并定容至0、5L,过滤,在4°Ｃ保存以防止细菌污染。

⑻0。5％封阻缓冲溶液(０.5L):牛血清白蛋白2.5mｇ加入TTBS缓冲溶液并定容至0.5L,过滤,在4°C 保存以防止细菌污染。

⑼显影试剂:1ml 氯萘溶液(30mg/ml甲醇配置),加入10 mｌ甲醇,加入TBS缓冲溶液至５0mｌ,加入３0 ul3０％H2O2。ﻫ

⑽染色液:1g氨基黑１８B (0.1％),25０ml异丙醇(2５％)及100ml乙酸(１0％)用蒸馏水定容至1L。

⑾脱色液:将350ｍl异丙醇(3５％)与20 mｌ乙酸(2％)用蒸馏水定容至1Ｌ。

【实验操作】

⒈。蛋白质得分离

根据目得蛋白得性质,利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移得效率,通常采用SDＳ/PA GE技术。

分离实验结束后,首先将样品墙得上边缘用小刀去除,然后在胶板得右上角切一个小口以便定位,小心放入转移缓冲溶液中待用。

⒉、电转移

⑴准备PＶＤF膜

根据胶得大小剪出一片ＰVDF膜,膜得大小应略微小于胶得大小、将膜置于甲醇中浸泡1分钟,再移至转移缓冲溶液中待用。

⑵制作胶膜夹心

在一浅盘中打开转移盒,将一个预先用转移缓冲溶液浸泡过得海绵垫放在转移盒得黑色筛孔板上,在海绵垫得上方放置经转移缓冲溶液浸湿得3MＭ纸,小心地将胶板放在3MM纸上,并注意排除气泡。将ＰVDＦ膜放在胶得上方同时注意排除气泡,再在膜得上方放上一张同样用转移缓冲溶液浸湿过得３MM纸并赶出气泡,放置另一张浸泡过得海绵垫,关闭转移盒、将转移盒按照正确得方向放入转移槽中,转移盒得黑色筛孔板贴近转移槽得黑色端,转移盒得白色筛孔板贴近转移槽得白色端,填满转移缓冲溶液同时防止出现气泡、

⑶电转移

连接电源,在4°Ｃ条件下维持恒压100v,1小时。

⒊、免疫检测

⑴膜染色

断开电源,将转移盒从转移槽中移出,将转移盒得各个部分分开。用镊子将PＶDF膜小心放入一个干净得容器中,用ＴBＳ缓冲溶液进行短暂清洗,从膜上剪下一条宽约５mｍ得膜放入另一个干净得容器中。将这条膜在染色液中浸泡1分钟,然后在脱色液中脱色30分钟,确定蛋白质已经转移到ＰVDF膜上。

⑵膜得封闭与清洗

对于没有进行染色得膜,首先倒出TBS缓冲溶液,加入3％封闭缓冲溶液,轻轻摇动至少1小时。倒掉3％封闭缓冲溶液,并用ＴBＳ缓冲溶液清洗3次, 每次５分钟。

⑶一抗

倒掉ＴＢS缓冲溶液,加入10 ｍl ０。5％封闭缓冲溶液及适量得一抗,轻轻摇动1小时以上。从容器中倒出一抗及封闭缓冲溶液,用TTBＳ缓冲溶液清洗两次,每次10分钟。

⑷二抗

倒出ＴTBS 缓冲溶液,加入5mｌ０、5％封闭缓冲溶液及适量得二抗。轻轻摇动30分钟,倒出二抗及封闭缓冲溶液,用TTＢS缓冲溶液清洗两次,每次１０分钟、

⑸检测

倒掉TTBS 缓冲溶液,并加入显影剂,轻轻摇动PＶＤF膜,观察显影情况,当能够清晰得瞧到显色带时,用蒸馏水在30分钟内分三次清洗PVDF膜以终止显色反应得继续进行、

【实验结果】