重组DNA技术培训课件
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重组DNA技术培训课件
重要的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶
T4 DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶
碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶
末端脱氧核苷酸转移酶
活性 识别特异碱基序列，切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA 切除5－末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化 催化3'-端合成同聚尾
基因工程(genetic engineering)
是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分 子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。
本章主要内容
重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药
工业中的应用
第一节 重要的工具酶
工具酶 基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和 RNA 分 子 的切割、连接 、 聚合、逆转录等 相 关的各种酶类。
Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌
酶名称 BamHⅠ
Bgl Ⅱ EcoRⅠ Hind Ⅲ
PstⅠ SalⅠ
识别顺序 GGATCC
ACATCT
同裂酶 BstⅠ
同尾酶
Bgl Ⅱ MboⅠ
GAATTC
AAGCTT HsuⅠ
CTGCAG SalpⅠ
变性
5'
3'
+
标记探针
3'
5'
㈢ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）
作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围
70 75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）扩增DNA片
《DNA重组》课件
DNA重组技术展望
技术发展：未来DNA重组技术将更加精准、高效、安全
应用领域：DNA重组技术将在生物制药、基因编辑、生物合成等领域发挥重要作用
伦理问题：DNA重组技术可能引发伦理问题，需要加强监管和规范 技术挑战：DNA重组技术面临技术瓶颈和挑战，需要不断探索和创新
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汇报人：PPT
课程名称：《DNA重组》 课程目标：让学生了解DNA重组的基本原理和操作方法 课程内容：包括DNA重组的基本概念、原理、操作方法、应用领域等 课程对象：生物科学、生物技术、医学等相关专业的学生
课件目的
讲解DNA重组在生物技术中 的应用
介绍DNA重组的基本概念和 原理
探讨DNA重组在医学、农业 等领域的应用前景
04 DNA重组技术
重组DNA技术概述
基本原理：通过基因工程技术，将外源DNA片段插入到宿主细胞中，实现基因的转移和表达 应用领域：生物医药、农业、环境科学等领域 主要技术：基因克隆、基因表达、基因沉默等 安全性问题：需要考虑基因重组技术的安全性和伦理问题，确保技术的合理应用和健康发展。
制定伦理规范，明确重组DNA 的伦理边界
加强监管，确保重组DNA的合 规使用
加强公众教育，提高公众对重 组DNA的认知和接受度
07 总结与展望
DNA重组技术总结
技术原理：通过基因工程手段，将外源基因导入宿主细胞，实现基因的定向改造和表达 应用领域：生物医药、农业、环境等领域 技术挑战：基因导入效率、基因表达调控、生物安全性等 发展趋势：基因编辑技术、合成生物学、生物制造等
重组DNA技术应用
基因工程：通过重 组DNA技术，可 以改变生物的遗传 特性，如转基因作 物、基因编辑等。
生物制药：重组 DNA技术可以用 于生产生物药物， 如胰岛素、生长激 素等。
重组DNA完整版PPT
➢ 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是 基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子 生物学操作步骤。
➢ 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识 地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物 体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产 物。
生物技术
4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 （3〕TaqDNA聚合酶； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
5 转化子的分析——Southern杂交 以mRNA为模板，以短的寡核苷酸〔oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCTP, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A〔polyA〕 尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。 （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 4 转化受体细胞和转化子的筛选 4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 反转录人工合成互补DNA （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（的基因； PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增〔包括分离〕一段目的基因的技术。 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（3〕TaqDNA聚合酶； 美国Mullis教授 开汽车时的联想 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。
DNA片段； ➢ （3〕利用聚合酶链式反应〔PCR〕特异性
地扩增所需要的目的基因片段，等等序
反转录人工合成互补DNA➢ 构建基因获取目的基因存在的 问题——➢
➢ 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识 地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物 体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产 物。
生物技术
4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 （3〕TaqDNA聚合酶； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
5 转化子的分析——Southern杂交 以mRNA为模板，以短的寡核苷酸〔oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCTP, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A〔polyA〕 尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。 （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 4 转化受体细胞和转化子的筛选 4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 反转录人工合成互补DNA （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（的基因； PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增〔包括分离〕一段目的基因的技术。 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（3〕TaqDNA聚合酶； 美国Mullis教授 开汽车时的联想 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。
DNA片段； ➢ （3〕利用聚合酶链式反应〔PCR〕特异性
地扩增所需要的目的基因片段，等等序
反转录人工合成互补DNA➢ 构建基因获取目的基因存在的 问题——➢
DNA重组培训讲义.pptx
5、连接分子的拆分
链交换形成的连接分子必须拆分 （resolution），彼此分离为双链DNA 分子。由于交联在一起的两条双链DNA 分子实际上处在不断地异构化中，切口 可能在两对同源链中任意一对上发生。
根据链裂断切开的方式不同，得到的重组产物也不 同。如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源 双链区的两侧来自不同亲本DNA，则称为拼接重组 体（splice recombinant），此种重组又叫做交 互重组（reciprocal recombination）。
3、分支迁移
两个双螺旋形成的交 叉连接很容易以拉链 式效应扩散，也就是 链交换可沿着双链滑 动，这个过程称为分 支迁移（branch migration）
4、Holliday结构
重组中连接两个 DNA双链的交换 中间物含有4股 DNA链，在其连 接处为了转换配 对所形成交叉链 的连接点称为 Holliday结构。
转化（transformation）、 转导（transduction）、 细胞融合（cell fusion）。
1、细菌的接合作用
细菌的细胞相互接触时遗传信息可由一个细胞转移到另一细胞，称为接合作 用。供体细胞为雄性，受体为雌性。通过接合而转移DNA的能力由接合质粒 提供，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码。能够促使染色体基因 转移的接合质粒称为致育因子（fertility factor），简称性因子或F因子。
3、细菌的转导
转导（transduction）是通 过噬菌体将细菌基因从供体 转移到受体细胞的过程。
4、细菌的细胞融合
在有些细菌的种属中可发生由 细胞质膜融合导致的基因转 移和重组。
三、大肠杆菌重组的分子基础
在细菌重组反应中活性最为明显的是由 大肠杆菌染色体上rec 基因和ruv 基因 编码的一些酶。
DNA重组技术ppt课件
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
DNA重组及重组DNA技术PPT课件
切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’ 端为磷酸基，3’ 端为羟基。
II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口
在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如Hpa I：
5' …GTT▼AAC…3' Hpa I 5' …GTT AAC…3'
• 多聚核苷酸激酶 • 碱性磷酸酶
合成双链cDNA分 子
5ˊ羟基末端 磷酸化
切除末端 磷酸基
1. 限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease, RE）
能识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
由于能限制外源DNA的 “入侵”而得名。与甲 基化酶共同构成细菌的 限制修饰系统，限制外 源DNA， 保护自身DNA
3' …CAA▲TTG…5'
3' …CAA TTG… 5'
在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5' 端切割产生5' 端突出的粘性末端，如EcoR Ⅰ ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTA A 5'
5' AATTC…3' G… 5'
基因克隆的主要操作步骤
分(分离) 目的基因
粘性末端
切(切割)
质粒
粘性末端
匹配的粘性末端
酶切后的目的基因片段 接(连接)
连接后的重组 质粒DNA分子
转(转化)
目的基因
染色体
重组质粒
重组DNA技术讲解培训课件
重组DNA技术讲解
15
（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的 磷酸基团
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP） 或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于 脱去DNA（RNA）5′末端的磷酸基团，使5′ -P成为5′ -OH，该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译
PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序
重组DNA技术讲解
31
五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA
A. 无转录因子：报告基因不表达
报告基因
酵
“诱饵”DNA序列
母 B. 有转录因子：报告基因表达 .
单
转录因子
杂
交
系
报告基因
统 C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：报告基因表达
另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用， 能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸 残基（A）。
重组DNA技术讲解
21
（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´ 羟基末端磷酸化
常 用 的 是 T4 多 核 苷 酸 激 酶 （ T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶 和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA 和RNA的5′-羟基转移。
转化细胞内 由克隆载体 所携带的所 有 cDNA 片 段的集合29从基因组DNA或cDNA中筛选 目的DNA的策略
（亲和筛选法）筛选
重组DNA技术讲解
30
四、经PCR获取目的DNA
如果已经知道目的基因的序列，就能很 方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中 获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文 库构建过程。
15
（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的 磷酸基团
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP） 或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于 脱去DNA（RNA）5′末端的磷酸基团，使5′ -P成为5′ -OH，该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译
PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序
重组DNA技术讲解
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五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA
A. 无转录因子：报告基因不表达
报告基因
酵
“诱饵”DNA序列
母 B. 有转录因子：报告基因表达 .
单
转录因子
杂
交
系
报告基因
统 C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：报告基因表达
另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用， 能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸 残基（A）。
重组DNA技术讲解
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（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´ 羟基末端磷酸化
常 用 的 是 T4 多 核 苷 酸 激 酶 （ T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶 和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA 和RNA的5′-羟基转移。
转化细胞内 由克隆载体 所携带的所 有 cDNA 片 段的集合29从基因组DNA或cDNA中筛选 目的DNA的策略
（亲和筛选法）筛选
重组DNA技术讲解
30
四、经PCR获取目的DNA
如果已经知道目的基因的序列，就能很 方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中 获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文 库构建过程。
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
第十五章 重组DNA技术
Blue-white screening on medium with ampicillin, X-gal and IPTG. white colonies contain recombinant plasmid and can be isolated directly from this plate
• DNA诊断 • 基因治疗
27
DNA诊断 DNA Diagnosis
• DNA 诊断常用方法 PCR、限制性片断长度多态性、单链构象多 态性、限制性酶切图谱及基因测序等 • DNA诊断的应用 杜氏肌营养不良(DMD)、Leber遗传性神经 病、苯酮酸尿症
28
基因治疗 Gene Therapy
• 基因治疗的概念 从基因水平调控细胞中缺陷基因、修补矫正 或替代缺陷基因，分为基因增补、替换、修 复三种类型。
14
质粒
• 细菌染色体外、自主复制、闭合环状 DNA • 分子量1kb到200kb以上 • 带有特殊的遗传信息 “抗药性”等 • 改造后成为极其常用的载体 穿梭载体
15
pUC19 map
16
第二节 重组DNA基本步骤
• • • • • 目的基因的获得(分) 载体的选择与修饰（切） DNA分子的体外重组（接） 重组DNA分子的导入、鉴定（转，筛） 目的基因的表达（表）
25
目的基因的表达 Expressing a Target Gene
• 外源基因在原核细胞的表达 优点：简单、迅速、经济适合大规模生产 缺点：缺乏转录后、翻译后加工机制 • 目的基因在真核细胞的表达 表达产物更接近真核天然蛋白质结构 表达载体既含原核克隆载体的主要元件， 又含各种真核表达元件
26
第三节 重组DNA技术在医学中的应用
重组DNA技术详细概述PPT(41张)
动物和植物 基到某种载体上能够 代表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的 DNA片段的集合。根据序列的来源，可分 为基因组和cDNA。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
DNA重组技术PPT课件
为倒置重复序列，如HindIII, AAGCTT。
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酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
15
限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
14
限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。
6
① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
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酶的切割可以有两种方式：即粘性末端和平末端
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端 的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸 的情况不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
第二类(II型)限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶.
Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。
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限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株 用d，即Hind。
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① 质粒/载体
质粒(Plasmid)基本概念 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组 DNA的同一组酶系。
特别是在完成人类基因组测序计划后，DNA重组技术与其它技 术相结合，将为功能基因组的研究提供强大的技术支持；通 过此方法可以对单个或多个基因的功能进行研究；
结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产 品，如胰岛素、干扰素等药物以及疫苗等。
《重组DNA技术》课件
发展更精准、高效的基因编辑 技术。
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
生物化学课件 第二章 重组DNA技术
43
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
特点 以mRNA作为模板,以dNTP为底物， RNA指导 的DNA聚合酶 (RDDP，RNA-dependent DNA polymerase ) 种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV） Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV) 用途： （1）逆转录合成cDNA （2）补平或标记5’粘端 （3）DNA测序 （4）制备探针
库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。
37
（三）DNase I
1. 特点：
内切酶，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特 异型（随机切割），产生5’-磷酸脱氧寡核苷酸。
2. 用途：
1) 切口平移法，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
38
重组DNA技术中常用的工具酶
29
3、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase )
特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。 具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺 乏3’ 5’ 外切酶活性，因而无校正阅读功能。
用途：（1）PCR
（2）DNA序列测定
30
4、逆转录酶(Reverse Transcriptase ,RTase)
33
T4多核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase)
催化将 ATP 的 γ- 磷酸转移到DNA链的 5’ -末端。 用途： （1）放射性标记DNA链的5’ -末端，用于DNA 测序或探针制备。 （2）将人工接头和其它没有 5’ -末端磷酸的
重组DNA技术PPT课件
3. cDNA 4. 聚合酶链反应
2021/3/7
CHENLI
4
基本概念
• 基因（gene）：P219
• 基因组（genome）：P292
• 基因组学（genomics）：
研究基因组的结构、信息与功能的 科学。
• 基因组计划：HGP——P440
• 后基因组
• 功能基因组
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CHENLI
CHENLI
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(五)重组体的筛选
直接选择法
1. 抗药性选择 2. 标志补救 3. 分子杂交法
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间接筛选法
核酸水平
蛋白质水平
*1. 酶切图谱 *2. 核酸探针 *3. PCR *4. 序列测定
CHENLI
免疫学的技术： SDS-PAGE 、 Western blot 、 ELISA 、 放 免 、 免疫沉淀、 荧光抗体等
2. 平端DNA间的连接
3. 同聚物加尾连接
4. 人工接头连接
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CHENLI
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CHENLI
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CHENLI
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(四)重组DNA分子导入受体菌
• 无性繁殖
• 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态.
• 方式:
转化、转染、感染
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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第40章、重组DNA技术
1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选
6. 克隆基因的表达
2021/3/7
CHENLI
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Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+
GATCC G
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+
GATCC G
XmaⅠ
CCCGGG GGGCCC
C CCCGG
+
CCGGG G
SmaⅠ
CCCGGG GGGCCC
CCC + GGG
GGG CCC
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属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）； 用罗马的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之 处，请联系网站或本人删除。
（二）Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性
重组处D，N请A联技系术网站中或常本用人删的除工。具酶
工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶
碱性磷酸酶 反转录酶 末端脱氧核苷酰转移酶 DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
Taq DNA聚合酶 多核苷酸激酶
功
能
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
切除末端磷酸基
合成cDNA；替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
在3´羟基末端进行同聚物加尾
合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针； DNA序列分析；填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3末端标记等
1. 具有特定的识别和切割位点
II型限制性内切酶的识别位点举例（'示切割位点）
限制性内切酶
Apa I BamH I
Pst I EcoR I
识别位点
GGGCC’C C’CCGGG
G’GATCC CCTAG’G
CTGCA’G G’ACGTC
G’AATTC CTTAA’G
限制性内切酶
Sma I Sau 3A I
6. 切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有
特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。
例如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-” 序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温 度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤 嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性 （star activity），以EcoR I*表示。
常用于PCR；产物的3′末端带有A，可用于T-A克隆
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
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一、限制性处核，请酸联系内网站切或本酶人用删除于。 切割DNA
定义: 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周 围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切 酶是重组DNA技术中重要的工具酶。
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重组DNA技术（recombinant DNA technology）
又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆 （DNA cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术， 是指在体外利用酶学方法将目的DNA片段与能自主复 制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子， 进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分 子的大量拷贝。
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第一节
重组DNA技术中常用的 工具酶
Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology
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本文档所二提供、的D信息N仅A供连处参，考接请之酶联用系，用网不于站能或作催本为科人化学删D除依N据。A，请片勿段模仿连；接如有不当之
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
GCCTAG+
GATCC G
A
+GATCT
TCTAG
A
本文档所提供的5信. 不息仅同供处参的，考酶请之联用可系，网不以站能识或作本为别科人同学删除依一据。，个请序勿模列仿；如有不当之
能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同 的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
本文档所提（供的一信）息仅重供处组参，考D请之N联用A系，网不技站能术或作本为中科人通学删除依常据。，使请用勿模仿；如有不当之 Ⅱ型限制酶
命名
Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株
流感嗜血杆菌d株的第三种酶
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3. 切割双处链，D请N联A系分网子站或后本产人删生除黏。端或平端
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口 （blunt end）
G +GATCC
CCTAG
G
黏端切口 （sticky end）
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4. 不同处的，酶请联可系以网站产或本生人同删除样。的末端
同尾酶（isocaudarner） 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切 割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾 酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。
Not I Sfi I
识别位点
CCC’GGG GGG’CCC
GATC’ ’CTAG
GC’GGCCGC CGCCGG’CG
GGCCNNNN’NGGCC CCGGN’NNNNCCGG
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2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）