菌种传代与保藏作业指导书
菌种保藏作业指导书
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菌种保藏作业指导书
一、目的
微生物菌种是实验室十分宝贵的生物资源，是保证微生物检验工作顺利开展的重要因素。
因此，如何能长期保持菌种优良的特性，不致衰老和断种，十分重要。
二、适用范围
本指导书适用于微生物室的菌种保藏。
三、依据文件
SN/T1538.1-2005《培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则》附录B。
四、菌种保藏操作步骤
采用斜面低温保藏法
1、将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2～8℃的冰箱中保藏。
2、保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移种一次。
酵母菌两个月，细菌每月移种一次。
编制人：批准人：第 1 页共1页。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
06菌种保存、传代管理作业指导书.
06菌种保存、传代管理作业指导书.菌种保存、传代管理制度1.⽬的为保证实验室标准菌株保藏及传代规范有效，保证⼯作菌株储存制定本作业指导书。
2.适⽤范围适⽤本实验室保藏具有菌种标准号的标准菌株及本实验室在检测中分离的已证明菌株。
3．来源1.1微⽣物实验室使⽤的参照菌种来源有⼆：⼀是从标准菌株提供单位购买获得的标准菌株，⼆是从本实验室⽇常检测中分离到的阳性菌株。
1.2实验室如需购买某种标准菌株，则由微⽣物检测相关⼈员提出申请并填写《耗材采购申请单》，经技术负责⼈批后，从标准菌株提供单位购买具有标准号的有证标准菌株。
1.3实验室在⽇常检测中发现的阳性菌株如需留存，由⽣物安全员提出申请并填写《菌种、毒种（株）阳性标本保管⽬录登记表》，经技术负责⼈审批后，进⾏存。
4．验收、验证4.1购买的标准菌株到达实验室由试剂管理员与⽣物安全员共同进⾏验收，主要观察和核对其包装、名称、标识、编号、有⽆破损、污染以及瓶塞紧否等外观状态，并填写《物质验收⼊库登记表》与《菌种、毒种（株）阳性标本保管⽬录登记表》，验收合格的菌株存放于指定冰箱；验收不合格的菌株及时退货，并让发货单位重新发货。
4.2标准菌株验收后由⽣物安全员组织有关⼈员对购买的标准菌株进⾏复活传代后，验证确认鉴定，并填写《菌种、毒种（株）验证记录表》。
验证合格菌株存放于指定冰箱；验证不合格菌株及时退货，并重新申请购买。
4.3实验室⾃留菌株因在检测过程中已经过确认，⽆需重新验证。
5．保存与传代5.1经过确认的新菌种（包括购买的标准菌株、实验室⾃留的阳性菌株以及这⼆者传代后得到的⼦代菌株）保存在菌种室的专⽤冰箱，冰箱由⽣物安全员实⾏双⼈双锁管理。
5.2购买的标准品初次使⽤时，应⼤量增殖，菌种保存采⽤斜⾯传代、琼脂斜⾯加固体⽯腊封管、磁珠冷冻保存等⽅法，即接种后37℃培养18h左右，⽤上述⽅法处理、塞上橡⽪塞、并做好有关标识，⽤斜⾯传代、琼脂斜⾯加液体⽯腊管置0-5℃5.3专⽤冰箱保存，磁珠置-20℃以下保存。
菌种传代、使用、保存操作规程
菌种传代、使用、保存操作规程1.目的本文件规定了微生物检验用菌、无菌检验用菌及抗生素检验用菌的接种、保存，传代方法及要求，适用于中心化验室进行检验用菌的接种和传代操作。
2. 适用范围适用于中心化验室菌种管理人员进行检验用菌的接种、保存和传代操作。
3.职责菌种管理人员应按本程序的规定操作。
4.参考文件及相关程序B08(02)005 微生物实验室标准管理程序B08(02)019 微生物检验用菌标准管理程序B08(02)020 检验用培养基标准管理程序5. 程序5.1.对照菌株名称·金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕·铜绿假单胞菌〔CMCC(B) 10 104〕·生孢梭菌〔CMCC(B) 64 941〕·枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 501〕·大肠埃希菌〔CMCC(B) 44 102〕·白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕·黑曲霉〔CMCC(F) 98 003〕·短小芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 202〕·藤黄微球菌〔CMCC(B) 28 001〕·乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B) 50 094〕5.2.菌种来源中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥菌种（即安瓿）。
5.3. 微生物检验用菌菌悬液的制备5.3.1.菌种的复苏与传代5.3.1.1. 取备妥的冷冻菌种安瓿，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、灭菌水及复苏菌种所需的培养基等物品，移入超净工作台。
5.3.1.2. 用75%酒精棉球擦净冷冻菌种安瓿外壁，放在灭菌双碟内，待干。
5.3.1.3. 点燃酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼，用灭菌毛细管吸取灭菌水或胰酪大豆胨液体培养基少许在灼热处，使其骤冷,用干燥无菌纱布包裹安瓿，安瓿掰开。
5.3.1.4. 在不离开火焰圈内，迅速用注射器抽取约0.5ml胰酪大豆胨琼液体培养基，注入安瓿内，轻轻震摇使冷冻菌块溶解、混匀，随即用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支胰酪大豆胨液体培养基，1支普通胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面培养基内。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2〜8℃,有效期为3个月。
3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：a.打开洁净工作台。
氏在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5〜0.8ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30〜35℃,培养18〜24小时；真菌培养温度23〜28℃,培养3〜5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。
微生物菌种常规保藏作业指导书
微生物菌种常规保藏作业指导书1目的规范药品微生物学检定的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检定结果的准确可靠。
2范围本规程适用于检定用细菌菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
3职责实验人员严格按本管理规程的要求完成标准细菌菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等工作。
4专业术语4.1标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌。
4.2传代用菌种是指标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
4.3菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4.4菌种保藏微生物菌种用适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定，以便于研究、交换和使用的目的。
4.5定期移植保藏法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适合的条件下培养，待菌种生长完全后，通常置于4～6℃进行保藏，并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
5检定菌种的申购由部门主管根据检定菌种的使用情况，提出购买计划，交由部门经理审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
6定菌的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号则按检定菌种的编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2～8℃直到需要使用时。
储存期最长不超过5年。
7定菌的保存7.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适合的固体培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。
菌种的传代、保藏及菌液
菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏 的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标 签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名 称，系列号，传代次数，接种时间等。一 旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必 处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量 菌种的质量对检验至关重要，对实验式储 备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种 进行纯度和属性确认外，还应对每一次传 代都进行确认的质量控制系统。因为微生 物菌种从上一代传到下一代时，很可能发 生污染或变异，因此每次传代中至少要对 菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必 要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到 污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实 验。
微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性 清楚. （2）菌种的接收与复活
标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式 包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中， 微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须 的环境条件，一般呈休眠状态。
白色念珠菌—显微镜下菌体形态
黑曲霉
形态特征： 单层和双层瓶梗、孢子头球形
放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。
培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成
菌落初为白色羊毛状 ，继而黑色或黑褐色，
粗绒状。
分离培养：快速显色培养基
黑曲霉—显微镜下菌体形态
黑曲霉—电镜下菌体形态
菌种传代的工作环境、工具及其他器皿
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存 库址等。
3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 全防护措施规程，采取有效预防措施进行 自我保护。 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 其他部门的人员未经允许不得进微生物实 验室。所有的意外情况，都必须立即向主 管部门报告以便得到及时解决。 5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程 中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录 格式。
菌种传代与保藏作业指导书
菌种传代与保藏作业指导书1、标准菌得来源标准菌株必须购买具备资质得菌种保藏中心提供得冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2、标准菌得验收从菌种保藏中心购买得原始菌种管就是玻璃安瓿装得冻干菌，接收同时应检查就是否有随菌种附有得相关资料。
接收菌种时应检查安瓿得数量与名称，与每一支安瓿得完整性。
在相应得菌种接收记录上记上所有得关于菌种得信息，如名称、数量与接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入得0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买得已接种好得菌种斜面（3代）应检查菌种管就是否完好。
储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3、标准菌得复苏、复壮及标准储备菌株得制备3、1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3、2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮、营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3、3操作步骤：a、打开洁净工作台。
b、在安瓿得外表面用75%得酒精擦拭并让其自然风干。
c、用一小砂轮在安瓿得上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d、以无菌方法用一无菌吸管从已准备好得上述液体培养基中移取0、5～0、8 ml到安瓿中。
e、轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种与液体培养基充分混合并完全溶解。
f、用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应得液体培养基。
g、根据安瓿上所标明得不同菌种类型而将其培养于相应得温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察就是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h、取经复苏后得上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
菌种传代与保藏指导书
菌种验收、传代与保藏作业指导书1.目的为确保菌种管理的正确操作性，制定本作业指导书。
2.适用范围适用于实验室各菌种。
3.职责检验员负责菌种的验收、传代与保藏。
4.内容4.1定义标准菌株是指由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。
传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每培养一次即称为一代。
所有传代用菌种和工作用菌种的传代次数应严格控制，原则上不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度传代增加菌种变异和污染的风险。
4.2标准菌的来源标准菌株需有明确来源，应可溯源至国内或国际认可的菌种保藏中心的标准菌株。
4.3标准菌的验收新购买的标准菌株应检查是否随菌种附有菌种证书。
接收时还应检查菌种数量和名称及每一支包装的完整性。
在相应的菌种验收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和验收日期等。
新购入的标准菌株储存于－20℃冰箱。
4.4菌种的复苏与传代根据不同的菌种保存方法和保存形式，选择适宜的方法无菌开启菌种。
应减少开启过程对菌种活力的影响，且不要引入外部污染。
经冷冻干燥安瓿保存的菌种：先用适宜的消毒剂擦拭安瓿后，用砂轮在安瓿上部1/3处划痕，将安额管顶部烧热，将无菌水滴于加热处使顶部出现裂纹，用无菌器具轻叩裂纹处上部，开启安瓿管的顶端，用适宜的缓冲液或液体培养基溶解菌块，并转移至新鲜的培养基上培养。
甘油小瓷珠保存法保存的菌种：取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。
无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镊子取出1个小瓷珠，拧紧瓶盖。
尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生产能力。
取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。
检定用菌种传代、贮存、接种操作细则
检定用菌种、传代、贮存、接种操作细则传代与接种操作步骤：1、先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。
2、再将菌种管（即原有的菌种斜面培养基）与待接种的新鲜斜面培养基（接种管）持在左手拇指、食指与中指之间，要注意能清楚的观察到斜面，菌种管在前、接种管在后，应斜持试管显45℃角，使试管内斜面上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免底管凝聚小浸湿培养基表面。
3、用右手将两管棉塞转动，以便接种时易于拔取。
再灼烧接种环注意灼烧时，接种环应垂直或稍斜的在外焰上灼烧，外焰温度与内焰高，顶端的环必须烧红，以彻底灭菌，环以上进入试管部分也应充分通过火焰灭菌。
4、使用右手小指与无名指及无名指中指之间，在火焰旁分别拔下两只试管的棉塞、持住，将试管口通过火焰，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。
5、将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触无军生长的培养基快速冷却，若接触的培养基有熔印时则表明接种环未冷却，能烫死细胞。
待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，在火焰旁边，迅速踌躇接种环伸入接种管，在管内斜面上划线接种。
划线时在斜面上应先由内向外划一直线后，再由内向外划曲线。
*注意事项：1、整个操作过程应迅速且在酒精灯上方操作，勿使菌苔沾至管壁或管口。
2、从菌种管取出少量菌种苔后接种环，切不可通过火焰，以免菌种被烧死，也不宜火焰太远。
（避免污染）3、接种完毕后，立即在火焰旁塞上棉塞，再将接种环灼烧灭菌放回原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可置适宜温度培养。
4、操作过程中，若棉塞不慎触及火焰而着火，切忌用口吹，若是棉塞进试管塞内一端着火，可在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不是会很快熄灭，若棉塞外着火，可用手捏熄，若棉烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基的灭菌棉塞，代替塞上。
5、借重完毕，应做好记录。
菌种的分离鉴别操作细则目的：当菌种污染某菌时，可将菌种接种于平板培养基进行分离，再根据菌种形态，挑取典型纯菌落并鉴别制成菌种管。
分离方法及步骤：1、取已污染某菌的菌落管，左手拿着菌种管拧松棉塞。
菌种传代、保存、使用、销毁操作规程(第一版第0次修订)
1术语标准菌株是指由微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种（标准储备菌株）是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作菌株是指用标准菌种或传代用菌种接种至相应固体或液体培养基后作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基培养上，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
2操作程序2.1菌种接收（验收）菌种到达实验室后，由菌种管理人员接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，进行记录，内容包括：名称、编号、数量、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其贮存于菌种说明书规定条件中，在有效期内完成菌种复苏。
2.2菌种复苏、复核、传代按菌种所附说明书进行复苏培养，或按检验标准中菌株的要求接种至适宜培养基内适宜温度和时间进行培养。
必要时按相应检验标准复核菌株，即接种上述培养物至适宜培养基中，适宜温度和时间进行培养后，观察菌落形态，或进行革兰氏染色及镜检，必要时进行进一步生化鉴定。
若菌种不纯或疑有污染，应查因及处理。
菌种复核后转接斜面或按冻存管说明书制备冻存液。
菌种管编号，将菌种冻存管冻存、斜面相应温度培养后适宜温度保存或使用。
菌株传代、使用不超过5代。
操作完成及时予以记录。
2.3菌种保存斜面低温保存法：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法用于菌种的短期保存，使用时若发现污染杂菌和变异等异常情况，应停止使用并灭活销毁。
冻存管法：按产品说明书操作与保存。
斜面低温保存法主要用于工作菌种的保存，保存时间根据菌种种类不同而不同，细菌与酵母菌一般2个月，霉菌及芽胞一般3个月；冻存管法用于传代菌种的保存。
2.4实验室菌种的编号采用字母加数字表示：菌株保藏编号（代次）-保存年份-顺序号。
代次用G带有下标数字表示。
2.5菌种保管保存、领用与销毁菌种设双人双锁保管、领用。
菌种的复苏传代及保存标准程序
菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7 取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
菌种传代与保藏指导书
菌种传代与保藏指导书菌种验收、传代与保藏作业指导书1.目的为确保菌种管理的正确操作性，制定本作业指导书。
2.适用范围适用于实验室各菌种。
3.职责检验员负责菌种的验收、传代与保藏。
4.内容4.1定义标准菌株是指由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。
传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每培养一次即称为一代。
所有传代用菌种和工作用菌种的传代次数应严格控制，原则上不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度传代增加菌种变异和污染的风险。
4.2标准菌的来源标准菌株需有明确来源，应可溯源至国内或国际认可的菌种保藏中心的标准菌株。
4.3标准菌的验收新购买的标准菌株应检查是否随菌种附有菌种证书。
接收时还应检查菌种数量和名称及每一支包装的完整性。
在相应的菌种验收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和验收日期等。
新购入的标准菌株储存于－20℃冰箱。
4.4菌种的复苏与传代根据不同的菌种保存方法和保存形式，选择适宜的方法无菌开启菌种。
应减少开启过程对菌种活力的影响，且不要引入外部污染。
经冷冻干燥安瓿保存的菌种：先用适宜的消毒剂擦拭安瓿后，用砂轮在安瓿上部1/3处划痕，将安额管顶部烧热，将无菌水滴于加热处使顶部出现裂纹，用无菌器具轻叩裂纹处上部，开启安瓿管的顶端，用适宜的缓冲液或液体培养基溶解菌块，并转移至新鲜的培养基上培养。
甘油小瓷珠保存法保存的菌种：取出冻存管并用力摇晃，使管内瓷珠分散。
无菌条件下拧开冻存管，用无菌的接种环（接种针）或镊子取出1个小瓷珠，拧紧瓶盖。
尽可能快地将冻存管放回原来的保存环境，温度过多改变将减弱细菌的生产能力。
取出的小瓷珠可以直接放在平板培养基上作划线接种，或者直接置于适合的液体培养基中培养。
《中国药典》菌种的传代与保藏
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
4~6℃
一般4~6个月
丝状真 菌
一 般 用 PDA 琼 脂 、 蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
4~6℃
精品课件
每4个月移植一次 （每于推广；一
般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微 生物都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次 数多，易发生变异及污染。
▪ 适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保 藏效果较差。
精品课件
液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种 菌株数
细菌
87
霉菌
586
酵母菌
400
放线菌
380
保存时间 （年）
5 5 2 4
存活率 （%）
20.9 83.6 88.9 91.3
精品课件
（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。
精品课件
1.琼脂斜面低温保存法
▪ （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上， 按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把 培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养 基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏 管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱 中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保 藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可 保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。
▪ （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
精品课件
大肠杆菌斜面 斜面
金黄色葡萄球菌
精品课件
生孢梭菌 白色念珠菌 需气菌、厌气菌培养基
真菌培养基
精品课件
各类菌种保藏条件及时间
检定菌传代贮存接种操作规程
检定菌传代、贮存、接种作业指导书1、目的：建立检定菌的传代、贮存、接种操作规程。
2、范围：本标准适用于本厂检定菌的传代、贮存、接种。
3、责任人：微生物检验员、无菌检验人员对本标准的实施负责。
4、内容：4.1：检定菌种由药检部门提供已接种好的菌种斜面。
4.2保存：4.2.1.将购来的试管斜面菌种放入冰箱中冷藏保存。
4.2.2.将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中保存。
4.2.3.每只保存菌种需标明菌名、统一编号、接种日期。
4.3传代和接种：4.3.1.试验用菌种每月传代一次，在菌种接种室内进行传代和接种。
4.3.2.先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作。
烧灼接种环。
4.3.3.再将原有的菌种斜面培养基（简称菌种管）与待种的新鲜斜面培养基（简称接种管），持在左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚地观察到斜面，菌种管在前，接种管在后。
应斜持试管呈45°角，使试管内斜面向上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。
4.3.4.首先，以右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易于拔取。
再以右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。
顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。
环以上凡接种时可进入试管的部分，也应通过火焰烧灼。
烧灼时，应把环置于酒精灯的外焰上，因外焰的温度比内焰高，容易烧红。
4.3.5.使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞，持住。
再将试管口在火焰上通过，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。
4.3.6先将烧灼过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，如有熔印则表明接种环未冷却，能烫死细菌。
一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许。
取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。
划线时一般先由下而上划一直线后，再由下而上划曲线。
操作过程应迅速，勿使菌苔沾至管壁或管口。
4.3.7当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞。
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菌种传代与保藏作业指导书
1.标准菌的来源
标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：
a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取
0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。
观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。
每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。
以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。
制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。
其余作为储备管。
将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。
内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有
效期至等。
i．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。
3.4菌种确认
用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。
然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。
3.5污染处理
假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。
将此被污染了的培养物灭菌处理。
可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。
并重新制备储备菌种管
3.6菌种的传代与保藏
将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。
菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。
菌种的传代保藏过程 3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。
传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。
此时，工作用菌种为第3代。
工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。
定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：
（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。
（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。
（3）关闭紫外灯。
点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。
（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。
（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。
（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。
当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。
按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。
菌种斜面的培养、保藏条件及时间（供参考，如相关菌种证书上有特殊要求，以证书为准）
注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。
3.7菌种的使用及销毁
每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。
如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。
每次操作，都应进行记录。
菌种管上应贴有牢固的标签。
标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。
废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
并对操作过程进行记录。
3.8 记录
传代和接种使用后，应做好《菌种传代接种记录》及《验证记录》。