细菌的简单染色

实验二细菌的简单染色、革兰氏染色

虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。

一、目的要求

1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

2．巩固显微镜的使用方法。

二、基本原理

1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染

的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是复红。

三、器材

1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和葡萄球菌。

2、染色液和试剂：碱性美兰、结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、香柏油。

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

四、操作步骤

1、简单染色：

（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。

（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏

（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min

（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。

（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

2、革兰氏染色：

（1）涂片

（2）晾干

（3）固定，与简单染色法相同

（4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

（5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。

（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。

（7）复染：滴加复红复染3-5min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。

（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。

（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

（10)实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，

a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。

b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液将镜头擦2-3次。

c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小

心轻拿，按号放入显微镜柜中。

②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。

五.注意事项