液相色谱与超高效液相色谱方法如何转换与验证
高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证方案验证文件类别：技术标准编号：V-A-c-004-0部门：验证委员会页码：共1页，第1页版次：¨新订¨替代：起草：年月日部门审核：年月日审阅会签：（验证委员会）批准：年月日实施日期：年月日复印数：批准：分发至：目录1.设备基本情况1.1概述1.2基本情况3职责3.1验证委员会3.2工程处3.3Qc4验证内容4.1安装确认4.1.1安装确认所需文件资料 4.1.2关键性仪表及消耗性备品4.1.3评价仪器的安装是否符合GmP及供应商提议的要求4.1.4起草标准操作规程4.2校正4.2.1紫外检测器4.2.1.1固定波长紫外检测器波长示值误差的校正4.2.1.2可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定4.2.2高压泵4.3运行确认4.3.1紫外检测器4.3.2高压泵4.4性能确认4.4.1最小检测浓度4.4.2定性、定量测量的重复性4.5拟订再验证项目及周期4.6验证结果评定与结论1.设备基本情况1.1概述本高效液相色谱仪主要由一个二元泵、一个柱温箱、一个可变紫外检测器、一个带有20μL定量环的进样器和一台工作站组成，各部分由工作站软件控制。
本仪器主要用于分析原料和成品的有关物质和含量。
1.2基本情况设备编号：设备名称：高效液相色谱仪型号：生产厂家：供货厂家：安装日期：使用部门：工作间：保管员：2．验证目的为确认高效液相色谱仪测试数据准确可靠，性能稳定，特制订本验证方案，对高效液相色谱仪进行验证。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证委员会批准。
3职责3.1验证委员会1.负责验证方案的审批。
2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。
3.负责验证数据及结果的审核。
4.负责验证报告的审批。
5.负责再验证周期的确定。
3.2工程处1.负责设备的安装、调试，并做好相应的记录。
高效液相色谱法的实验操作指南
高效液相色谱法的实验操作指南高效液相色谱法是一种广泛应用于各个领域的分析技术。
它通过将溶液在高压下通过固定好的柱子进行分离，可以快速、准确地测定样品中的成分。
本文将介绍高效液相色谱法的实验操作指南，包括仪器和试剂准备、样品制备、色谱条件设定等。
首先，进行高效液相色谱实验前，准备好所需的仪器和试剂是必不可少的。
一般情况下，实验使用的仪器包括高效液相色谱仪、进样器、柱温箱等。
在使用前需要进行仪器的检查和校准，确保各项参数正常。
此外，还需要准备好色谱柱、移液管、吸管、试剂瓶等实验所需的小工具。
对于试剂的选择，需要根据实验的目的和需要选择适当的溶剂和试剂浓度。
其次，样品的制备是高效液相色谱实验中的重要一步。
样品的制备需要根据实验的具体要求进行。
一般情况下，可将样品溶解于适当的溶剂中，并进行必要的稀释。
在样品制备过程中，需要注意样品的溶解度、稳定性以及是否需要进行预处理等因素。
在进行实验时，色谱条件的设定是至关重要的。
首先，选择合适的柱子和移液管进行分离，根据需要设定流速和柱温。
其次，根据实验目的和需要，选择适当的流动相。
流动相的选择基于试剂的性质、溶解度以及对样品成分的分离效果等因素。
在色谱条件的设定过程中，需要进行系统的优化，比如调整流动相组分和浓度、柱温等参数来提高分离效果。
在进行实验时，操作的细节也需要特别关注。
首先，在进行进样时，需要控制好样品的体积和进样速度，以免影响实验结果。
另外，在进行分离时，需要注意观察波峰的形态和峰面积，以判断分离效果的好坏。
最后，在实验结束后，需要及时清洗仪器和柱子，并妥善保存。
高效液相色谱法的实验操作指南不仅涵盖了仪器和试剂的准备，还包括了样品制备和色谱条件设定等方面的内容。
在进行实验时，需要注意细节，并进行适当的优化和调整，以保证实验结果的准确性和可靠性。
通过遵循实验操作指南，我们可以更好地掌握高效液相色谱法的实验技巧，为科研工作提供有力的支持。
希望本文的介绍能够对读者有所帮助，促进高效液相色谱法的应用和发展。
高效液相色谱法检验操作规程
高效液相色谱法检验操作规程一、范围：本标准规定了使用高效液相色谱法的检验方法和操作要求；适用于本公司检品采用高效液相色谱法的质量检测。
二、引用标准：中华人民共和国药典（2000年版二部附录）三、仪器的组成和一般要求：1、仪器的组成：高压输液泵；色谱柱；检测器；积分仪；打印机。
2、对仪器的一般要求：所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（药典2000年版附录IV A）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2.1 紫外分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质），测定其吸收度。
溶剂和吸收池所吸收度，在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得超过0.20，在251~300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。
四、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求，或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。
1、色谱柱的理论板数（n）在先定的条件下，注入供试品溶液或品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
从HPLC到UPLC的方法转换以适应更高的分析通量
从HPLC到UPLC的⽅法转换以适应更⾼的分析通量从HPLC到UPLC的⽅法转换以适应更⾼的分析通量⼀个典型的HPLC分析⽅法成功地转换并优化为WatersACQUITY UPLC TM⽅法，既达到了样品分析的⾼通量⼜得到更⾼的分析灵敏度。
提出了进⼀步快速转换⽅法的策略。
对运⾏成本和样品通量的分析表明：UPLC的成本优势要超过HPLC。
⽇益增长的制药⾏业⼤批量样品分析的需求，促进了ACQUITY Ultra Performance LC (UPLC TM)的研制和开发。
这个系统之所以能够提供如此快速的分析，得益于它采⽤了⼩颗粒杂化填料(1.7µm)，它具有极好的分离度和奇特的化学特性。
(1-5)为了与这种⼩颗粒杂化填料相匹配，实现快速分析，Waters公司在普通液相⾊谱的基础上，从⾊谱柱到⾊谱系统都进⾏了⼤幅度改进。
要实现真正的超⾼效液相⾊谱分离，UPLC仪器系统必须耐⾼压（⾼达15000psi）、死体积⼩，且检测器的数据采集速率要⼤⼤提⾼以与⾼速流出的⾊谱峰匹配。
新型的针内针设计真正地防⽌了交叉污染，极⼤地提⾼了检测灵敏度。
在本⽂中，⼀个⽤于质量控制（QC）的HPLC⽅法被优化为UPLC⽅法，⽬的是减少总运⾏时间，降低分析成本和增加仪器正常运⾏时间。
⽅法的开发初始的HPLC⽅法为：分析时间：10分钟，样品：溶于有机溶液中的杂环药物（Cpd A）。
加⼊内标以补偿样品前处理所造成的损失，采⽤梯度是必要的，⽬的是清洗后⾯流出的⼲扰物。
从普通HPLC⽅法转换为UPLC⽅法，开始仅仅是将流动相流速、进样体积进⾏简单的换算。
换算因⼦由⾊谱柱横截⾯积的⽐率得到，以保持相同的线速度。
从UPLC得到的⾊谱峰是⾮常窄的，超凡的分离度表明⽅法尚有改进的余地。
原来认为：只要柱反压允许，流动相的流速可以随意提⾼。
但是后来对⾊谱柱寿命的研究表明，⽤提⾼流动相中的有机相含量的⽅法来缩短分析时间似乎更经济合算，溶剂的消耗也⼤⼤减少。
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程
高效液相色谱仪操作技巧及操作规程高效液相色谱仪操作技巧任何颗粒物进进高效液相色谱仪后都会在柱子进口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力加添并使色谱峰变形。
因此，要实行各种防备措施，包括操纵步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或削减颗粒物进进高效液相色谱仪中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并进步数据的牢靠性。
在高效液相色谱仪中，颗粒物的紧要来源有三个途径：活动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、被测样品使用针筒式过滤器不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会或多或少的丢失。
丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。
2、活动相无论是高效液相色谱仪HPLC级的水还是在试验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2μm微孔滤膜。
任何一种缓冲液中加进了固体物，必定活动相过滤将。
少量杂质颗粒存在于活动相中必定成为残渣。
解决方法：2.1.活动相制备仅接受HPLC级液体时不需要过滤，反之全部活动相构成在使用前必需过滤。
2.2.在连接储液瓶和泵的输液管的末端进口接受下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很紧要的。
这个过滤器的规格为≥10μm的微孔物质，所以它不能取代活动相过滤步骤，但是它能除往系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的牢靠性。
2.3.推举在HPLC系统中接受一个0.45或0.5μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。
这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如接受一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又便利（几分钟就可更换）。
若接受在线过滤，高效液相色谱仪检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升确定值，例如25%或加添500psi，应当更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。
3、仪器系统部件的磨损物最后，在高效液相色谱仪HPLC系统中颗粒物的另一个紧要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。
高效液相色谱分析方法的优化与验证
高效液相色谱分析方法的优化与验证第一章引言高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于溶液相和固定相之间的相互作用进行物质分离的分析技术。
它广泛应用于药物、环境、农药、食品等领域。
本章将介绍高效液相色谱分析的发展背景、优化与验证的重要性以及本文的研究目的。
第二章高效液相色谱分析方法的优化2.1 数据采集与预处理在优化高效液相色谱分析方法时，数据采集与预处理是一个关键步骤。
数据采集应该具有高灵敏度、高准确性和高重复性。
常用的数据采集方法有UV/VIS检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
预处理方法则包括峰识别、峰面积计算和峰的定性定量分析等。
2.2 固定相的选择与优化固定相的选择是高效液相色谱分析中的关键步骤之一。
不同的固定相具有不同的分离能力和选择性。
选择适合样品的固定相可以提高分析效果。
此外，固定相的尺寸、孔径和填充物种类也会影响分析效果，需要进行优化。
2.3 流动相的优化流动相对于高效液相色谱分析方法的优化也具有重要意义。
流动相的组成和流速直接影响分离能力和分析时间。
通过选择合适的有机溶剂、缓冲液和添加剂等来调整流动相的性质，可以提高分离效果。
此外，流速的选择也需要根据样品的特性和分析目的进行优化。
第三章高效液相色谱分析方法的验证3.1 方法精密度的验证方法精密度验证是为了评估在指定条件下，同一操作者对同一样品进行多次测定所得结果的一致性。
常用的精密度验证方法包括重复测定法、中期精密度法和日内精密度法等。
3.2 方法准确度的验证方法准确度验证是为了评估方法所得结果与真值的接近程度。
准确度可以通过添加标准品、与其他方法进行比较或者与已知浓度样品进行比较等方法来验证。
3.3 方法选择性的验证方法选择性验证是为了评估分析方法对目标成分的专属性。
选择性验证需要考虑干扰物质的影响，并进行相关实验以确定方法的选择性。
3.4 方法灵敏度的验证方法灵敏度验证是为了评估方法对目标物质的检测限和定量限。
液相色谱方法转换
液相色谱方法转换
液相色谱方法转换是指将一个液相色谱方法转换为另一个液相色谱方法，其目的是改变分离条件以提高分离效果、减少分析时间或使用更适合的柱和检测器等。
液相色谱方法转换的具体步骤如下：
1. 选择新的柱和固定相：根据分析目标和需求，在新的方法中选择合适的柱和固定相。
新的柱和固定相应具有适当的分离效果、分离速度和样品容忍度等特性。
2. 选择新的移动相：根据样品的特性和分离要求，选择适当的移动相。
移动相的选择需要考虑溶解度、流动性和分离效果等因素。
3. 优化分离条件：根据新的柱、固定相和移动相，优化分离条件，包括流速、温度、梯度等。
通过调整这些条件，可以改善分离效果，提高分离速度和方法灵敏度。
4. 选择新的检测器：根据新的分析目标和分离条件，选择合适的检测器。
常见的检测器包括紫外-可见光谱法、荧光法、电化学检测法等。
5. 验证新的方法：在确定新的分离条件和检测器后，对新的方法进行验证。
验证的内容包括方法线性范围、精密度、准确度和选择性等。
通过液相色谱方法转换，可以改善分析工作的效率和准确度。
但在进行方法转换时，需要注意对比新旧方法的结果，确保新方法的准确性和可靠性。
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程1 定义及概述：1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求：2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备：3.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH 计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45µm适宜的滤膜滤过，用前脱气。
中药复杂样品高效液相色谱和超高效液相色谱分析条件转换方法
的 样 品 。 ［１０￣１１］
醇 ， 超声 １０ｍｉｎ， 过滤， 滤 液 定 容 到 ２５ｍＬ， 备 用 。 进 样
本 实 验 室 对 于 ３６ 味 药 材 建 立 了 标 准 化 的 液 相 前用 ０．４５μｍ 有机滤膜过滤。
分析方法， 采用五次线性梯度获取了中药复杂样品 的 ａ， ｃ 值。本实验 就是以 ａ， ｃ 值 为 基 础 ， 对 ＨＰＬＣ 和
流 动 相 ： 水 （ Ａ） － 乙 腈 （ Ｂ） ， 两 相 加 ０．１％（ｖ／ｖ） 甲 酸 ； ＨＰＬＣ 的 流 速 为 １．０ ｍＬ／ｍｉｎ； ＵＰＬＣ 的 流 速 为 ０．２５ｍＬ／ ｍｉｎ； 柱 温 ： ３０℃； 检 测 波 长 ： ２８０ ｎｍ； ＨＰＬＣ 的 进 样 量 为 ５μＬ； ＵＰＬＣ 的 进 样 量 为 ３μＬ。 五 次 线 性 梯 度 如 表 １ 所 示 。用 于 验 证 超 高 效 液 相 色 谱 预 测 结果的色谱条件为色谱条件 ３。
收稿日期： ２００７－ １０－ １０ 修回日期： ２００７－ １０－ ２３
线性梯度对样品进行液相色谱分析，五个梯度下的液 相 色 谱 图 在 ＣＳＡＳＳ 软 件 （ Ｃｏｎｐｅｅｘ ｓｑｍｐｌｅ ａｈａｌｙｓｔｓ
＊ 联系人： 梁鑫淼， 本刊编委， 研究员， 主要研究方向： 组分中药研究， Ｔｅｌ： ０４１１－ ８４３７９５１９，Ｅ－ ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｘｍ＠ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ。
色 谱 柱： Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ２ Ｃ１８（ ２５０ ｍｍ ×４．６ ｍｍ， 于表 ２。在 ＨＰＬＣ 和 ＵＰＬＣ 上都得到了很好的预测 精
５μｍ， 大 连 依 利 特 ） ； ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣＴＭ ＢＥＨ ＳＨＩＥＬＤ 度。通过预测的结果可以看出， 两种分离所计算的 ａ，
液相色谱仪HPLC分析方法验证 液相色谱解决方案
液相色谱仪HPLC分析方法验证液相色谱解决方案为了保证分析检测结果精准、牢靠，必需对所接受的分析方法的精准性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。
从本质上讲，方法验证就是依据检测项目的要求，预先设置确定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所接受的分析方法符合检测项目的要求。
方法验证在质量掌控上有紧要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是订立质量标准的基础。
方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、精准度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。
1.专属性专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。
对于纯度检测，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。
必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。
一般要求产品和杂质之间的分别度大于2.0、2.线性线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原材料或产品的浓度呈线性关系的程度。
线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。
一般用储备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用zui小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。
3.范围范围指在能够达到确定的精准度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。
简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度zui大值和zui小值。
需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80%～120%。
4.精准度精准度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证精准度。
精准度应在规定的范围内建立，对于原材料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原材料药进行测定，必要时可与另一个已建立精准度的方法比较结果。
液相色谱验证方案
液相色谱验证方案引言液相色谱是一种常用的分析技术，广泛应用于药物分析、环境分析、食品检测等领域。
验证液相色谱的方法的准确性和可靠性是非常重要的。
本文将介绍一种常见的液相色谱验证方案，该方案涵盖了验证仪器性能、方法准确性和操作员技术等方面。
仪器性能验证色谱柱效能测试色谱柱是液相色谱分析的核心组成部分，验证色谱柱的效能可以确保分析结果的准确性和可重复性。
色谱柱效能测试的方法有很多种，以下是一种常用的方法：1.选择合适的色谱柱，确保其符合分析要求。
2.准备一组标准物质溶液，其中包含多个化合物，这些化合物在液相色谱中具有不同的保留时间和峰形。
3.使用这组标准物质溶液进行色谱柱效能测试。
首先进行等温保留时间测试，确定标准保留时间和峰形。
然后进行柱寿命测试，比较初始测试和长期测试的保留时间和峰形。
检测器性能测试液相色谱检测器是另一个关键的组成部分，验证检测器的性能对于准确测量样品成分至关重要。
以下是一些常用的检测器性能测试方法：1.分别准备一组含有目标物质的标准物质溶液。
2.使用这组标准物质溶液进行检测器性能测试。
通过测定目标物质的峰面积、高度、对称性等参数来评估检测器的准确性和灵敏度。
3.对于荧光检测器，可以使用荧光标准物质进行测试，并测定荧光强度和信噪比。
方法准确性验证为了确保液相色谱分析结果的准确性，需要进行方法准确性验证。
下面是一些常用的方法准确性验证方法：准确度测试使用已知浓度的标准物质溶液进行测试，通过比较测试结果与标准值的偏差来评估方法的准确度。
可以重复测试多次，并计算平均值和相对标准偏差。
精密度测试使用同一批样品，按照同一方法重复测试多次，通过计算结果的相对标准偏差来评估方法的精密度。
重复性测试使用不同的仪器、不同的操作员和不同的实验条件对同一批样品进行测试，通过比较结果的一致性来评估方法的重复性。
操作员技术验证操作员的技术水平对于液相色谱分析结果的准确性和可靠性也起着重要的影响。
以下是一些常用的操作员技术验证方法：1.培训和考核：操作员应接受相关的培训，并通过考核来评估其液相色谱操作技术的熟练程度。
液相色谱方法开发与方法验证
液相色谱方法开发与方法验证液相色谱方法开发的关键步骤包括选择适当的色谱柱、优化流动相和确定分析条件。
首先，根据待分析物的性质和分离要求选择合适的色谱柱。
不同的色谱柱有不同的色谱特性，如填充剂类型、粒径大小和长度等，对分离效果和分析速度有重要影响。
其次，优化流动相的组成和流速是液相色谱方法开发的关键步骤之一、流动相的选择应考虑到待分析物的溶解度、极性和分离要求等因素。
最后，确定适当的分析条件，包括进样方式、柱温和检测波长等参数。
这些条件的选择应根据样品的性质和分析要求进行优化。
液相色谱方法验证是为了评估方法的准确性、精密度和可靠性。
方法验证需要考虑下述几个方面。
首先，评估方法的线性范围和灵敏度。
线性范围应涵盖待分析物的预期浓度范围，并根据分析要求确定基准线性回归方程和相关系数。
灵敏度的评估常利用限制检出限、限制定量限和峰高比等指标。
其次，验证方法的精密度和准确度。
精密度评估包括重复性、中间精密度和再现性，通过多次测定同一样品的重复性和不同日子测定同一样品的中间精密度来评估方法的精密度。
准确度评估则需要利用标准品进行稳定性和恢复率实验。
最后，评估方法的选择性和系统适用性。
选择性评估通过测定可能存在的干扰物或陪伴物的分离和检测来验证方法的选择性。
系统适用性评估包括柱效和峰形因子的评估，以确保方法的准确性和可重复性。
在液相色谱方法开发和验证中，还需要进行合理的质量控制，并制定相关的操作规程和记录。
质量控制包括实验室条件、仪器设备的校正和维护、试剂和溶剂的质量控制等。
操作规程和记录应详细描述方法的操作步骤和参数设定，并记录实验结果、分析数据和评估结果。
总之，液相色谱方法的开发和验证是确保分析结果准确可靠的重要步骤。
通过选择适当的色谱柱、优化流动相和确定分析条件，开发出可靠的液相色谱方法。
通过评估方法的线性范围、灵敏度、精密度、准确度、选择性和系统适用性等指标，验证方法的准确性和可靠性。
质量控制和制定操作规程和记录保证方法的科学性和可重复性。
高效液相色谱方法的验证
方法验证的内容
• 准确度 • 精密度 • 专属性 • 检测限 • 定量限 • 线性和范围 • 耐用性
准确度
定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。
1. 主成分含量测定
原料药：对照品或方法比对
制剂、中药：标准加样回收 2. 杂质定量
杂质对照品 方法比对 杂质与主成分的相对含量
S h =
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测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应 色谱峰高hp和平均基线噪音（h baseline noise）之比。通常报告进样质量 或进样体积（需与样品制备方法相关）。
线性和范围
线性ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关 系的程度。
专属性
定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。
1. 鉴别反应
2. 含量测定
杂质测定 限量检查
测定： 空白制剂，模拟复方
加速破坏试样测试
DAD峰纯度检查
检测限和定量限
检测限（LOD）：供试品中被测物能被检测出的最低量。 通常采用信噪比3:1或2:1
定量限（LOQ）: 供试品中被测物能被定量测定的最低量。 通常采用信噪比10:1
分析方法研究和验证中使用的标准物质
• 对照品（一级标准） • 工作标准（二级标准） • 非法定对照品
杂质分析
新原料药和新制剂中的杂质研究 国家有关新药申报要求 ICH文本：Q3A, Q3B
仪器要求：
1. 检测灵敏度：波长，灯 能量，流通池，进样量 等其它色谱条件
2. 数据处理：积分参数
• 采用对照品，或相对保留时间定位 • 采用DAD或MWD确定UV光谱或不同波长的检测情况 • 测定对主成分的相对响应因子（0.9~1.1）
高效液相色谱分析技术方法认证和注意事项陈桂良.ppt
检测限
• 非仪器分析目视法(用已知浓度的被测 物，试验出能被可靠地检测出的最低 浓度或量);信噪比法(用于能显示基线 噪音的分析方法，即把已知低浓度试 样测出的信号与空白样品测出的信号 进行比较，算出能被可靠地检测出的 最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1 或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确 定检测限)。
• 对于①法的要求是：除检测限和精密 度指标不必要求外，对准确度、选择
性、线性与范围、定量限、耐用性等 均应有所要求；
• 对于②法的要求是：只对检测限、选 择性和耐用性三项指标有所要求，其 余均无需要求。
• 用于溶出度测定的方法及药物释 放度测定的方法，只有精密度和 耐用性有所要求，其余项目可不 作要求。
其他影响因素
• 实验条件如避光，pH值或流动相组 份比，温度，衍生化反应时间，进 样温度等要进行论证评估。
灵敏度
• 检测限和定量限，在仪器设置在最 高灵敏度时可检出注入样品的最小 量。最小检出量通常是指分析样品 量产生的响应大于噪声的2~3倍，灵 敏度可用检出限度或定量限度来表 示，检出限度或定量限度越小，该 方法灵敏度越高。
药品质量标准分析方法验证的目的
• 证明采用的方法适合于相应检测要 求。在起草药品质量标准时，分析 方法需经验证；在药物生产方法变 更、制剂的组分变更、原分析方法 进行修订时，则质量标准分析方法 也需进行验证。方法验证过程和结 果均应记载在药品标准起草或修订 说明中。
需验证的分析项目
• 鉴别试验，杂质定量或限度检查， 原料药或制剂中有效成分含量测定， 以及制剂中其他成分(如降解产物、 防腐剂等)的测定。药品溶出度、释 放度等功能检查中，其溶出量等测 试方法也应作必要验证。
色谱条件与系统适用性试验
• 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以0.01mol/ml十二烷基硫酸钠溶液 （用磷酸调节pH值至2.5）-乙腈 （60：40）为流动相；检测波长为 254nm。理论板数按醋酸可的松峰计 算应不低于2500，醋酸可的松峰与 盐酸四环素峰的分离度应不小于3.0。
中国药典液相方法转换规则
中国药典液相方法转换规则
中国药典中的液相方法转换规则主要包括以下几个方面：
1. 色谱条件的转换：液相色谱方法的转换需要根据不同的药物性质和分析目的来确定色谱柱、流动相、检测器等条件。
根据药典中给出的方法，可以调整柱型、柱温、流速和梯度程序等参数进行转换。
2. 校正系数的转换：液相方法的校正系数是指对于不同的样品和成分，根据药典中给出的相应方法所得峰面积与浓度之间的关系。
在转换方法时，需要根据新方法中的校正系数对原有方法得到的结果进行修正。
3. 样品前处理的转换：在液相方法中，样品前处理是不可或缺的步骤之一。
转换方法时，需要根据新方法的要求对原有方法中的样品前处理步骤进行调整，例如提取溶剂的选择、样品的制备方法等。
4. 方法验证的转换：药典中的液相方法通常需要进行方法验证，以保证分析结果的准确性和可靠性。
在转换方法时，需要根据新方法的要求对原有方法中的验证步骤进行调整，例如样品稳定性的研究、精密度和准确度的评价等。
总之，液相方法的转换规则主要是根据新方法的要求对原有方法中的色谱条件、校正系数、样品前处理和方法验证等方面进行调整，以实现新方法的有效转换。
中药复杂样品高效液相色谱和超高效液相色谱分析条件转换方法
中药复杂样品高效液相色谱和超高效液相色谱分析条件转换方法发表时间：2018-03-09T11:19:37.803Z 来源：《医药前沿》2018年2月第5期作者：张传燕[导读] 在该方法中，很好的实现了分析条件的互相转化，并且实现了两个分析方法在数据分析上的通用性。
（宜宾市第三人民医院药剂科四川宜宾 644000）【摘要】目的：对中药复杂样品高效液相色谱和超高效液相色谱的基础条件进行分析，建立其相互转换的方法。
方法：将丹参水提组作为模型样本，并运用五次线性梯度分别对高效液相色谱和超高效液相色谱的12色谱峰保留参数进行计算，然后分别对计算出的12色谱峰保留参数进行关联，获得线性方程，而该线性方程也便可以使两组12色谱峰保留参数得以相互转换，进而对两组12色谱峰保留参数的色谱条件进行预测和优化改进。
结果：高效液相色谱和超高效液相色谱两者的12色谱峰保留参数具有较好的线性关系，两组12色谱峰保留参数的线性关联R2值分别为0.9914和0.9936。
结论：在该方法中，很好的实现了分析条件的互相转化，并且实现了两个分析方法在数据分析上的通用性，且具有操作简单、准确的优点特性，最终实现了中药复杂样品的优化与分析预测。
【关键词】中药复杂样品；高效液相色谱；超高效液相色谱；转换方法【中图分类号】R28 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2018）05-0377-02 高效液相色谱法，简称HPLC，是一种对中药复杂样品进行分析的方法，在中药复杂样品的分离过程中发挥着至关重要的作用。
而随着时代的发展，在材料分离方面，人们对其提出了新的更高的要求。
而在固定相发展中，小颗粒的填料则成为了一个重要的发展方向。
其中，超高效液相色谱法，简称（UPLC），就一种以1.7纳米的填料作为固定相的分析方法，在小颗粒的填料过程中，不仅具有高效的柱效，而且帮助了中药复杂样品的分离，进而促使分析更加的快速便捷。
1.资料和方法1.1 一般资料1.1.1仪器和试剂高效液相色谱仪。
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1.流速的转换
不改变线速度，流速与柱内径的平方成比例，速从 4.6 x 150 mm （5µm）到 2.1 x 50 mm(1.7 µm )，几何缩放流速的计算：
上述为方法转换时推荐流速，实际使用时可根据系统压力、保留时间以 及常用流速范围（如1.7 µm，2.1 mm内径色谱柱的常用流速范围为： 0.3～0.7ml/min ）进行调整。
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应用实例1-阿托伐他汀有关物质检查
图1、阿托伐他汀钙有关物质HPLC图(进样20µL) 50分钟
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
图2、阿托伐他汀钙有关物质UPLC图(进样2µL)
17分钟
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表1、阿托伐他汀钙有关物质HPLC梯度洗脱程序
时间（min） 0 25 35 40
40.01 50
流动相A（%） 48 48 10 0 48 48
75ml/针 75ml*18针 (1350ml)
6.8ml/针 6.8ml*18针
(122ml)
形成废液
＞3240ml
＞1350ml
＞122ml
消耗能源
7倍
3倍
1
假设：1000个样品一个月内必须完成。如果使用5μm，4.6X150mm色谱柱， 流速1.4ml/min，45min运行时间的方法，需要3套LC系统，14天来完成这个 实验。但是如果使用1.7μm，2.1X100mm色谱柱，流速0.4ml/min，11min运 行时间的方法，则只需要1台LC系统，10天就能完成。
灵敏度 ↑ 3X
(Increased optimal flow
(Peak height increases as peak width
rate & shorter column)
and column length decreases)
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1、等度洗脱方法转换后的验证工作
1.1根据两种方法比对结果，鉴别和定量试验中峰顺序峰个数均一致， 且SST符合要求。方法中SST规定全面，包含了分离度、灵敏度。此时 经过比对，实验条件完全满足，可无需进行其他确认工作。
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不同方法效率差别很大
有关物质和 含量测定
分析时间
欧洲药典 HPLC方法
120分钟/针 120*18针 （36小时）
修订后 HPLC方法
50分钟/针 50*18针 (15小时)
超高效 液相色谱方法
17分钟/针 17*18针 (5.1小时)
消耗流动相
180ml/针 180ml*18针 (3240ml)
由Van Deemter方程可以诠释小颗粒填料的分离优势，颗粒度越 小柱效越高，分离越好；此外，一方面由于粒径小，色谱柱内径 减小（4.6mm减小至2.1mm），载样量少，因此必须减少进样体积， 可能会影响灵敏度；另一方面色谱柱内径变小使得峰扩散减小， 峰宽变窄，峰高增高（柱效增大），信噪比增大，灵敏度增大。
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2. 梯度洗脱方法转换后的验证工作
2.1根据两种方法比对结果，峰顺序峰个数均一致，有关物质及含量结果均 一致，且SST符合要求，SST要求全面，例如有R、灵敏度的规定，此时： （1）鉴别、含量、溶出度和含量均匀度：峰纯度/分离度满意即可； （2）有关物质：2～3种条件强制破坏试验，分别进样，比较两者图谱，检 测出杂质的情况应基本一致，且物料平衡结果基本一致即可。
液相色谱与超高效液相色谱方法如 何转换及验证
高青 2015.12.15
1
主要内容
一、背景与前提 二、方法如何转换 三、转换后的方法如何评估与验证 四、应用案例介绍 五、讨论
2
背景与前提
液相色谱是药物分析领域使用最广泛的技术手段，随着 小粒径色谱柱的发展，越来越多的业内人士期望使用亚 2μm粒径色谱柱的超高效液相色谱来拓宽选择性、提高工 作效率、降低耗能、减少污染。
1.2 根据两种方法比对结果，鉴别和定量试验中峰顺序峰个数均一致， 且SST符合要 求，有关物质及含量结果均一致，但方法中SST无灵敏 度规定，如下操作： （1）鉴别：可直接进行，无需验证； （2）有关物质：可取对照品溶液稀释，测定灵敏度，达到对照品溶 液二十分之一或更灵敏即可； （3）含量测定、溶出度、均匀度等：可直接转换。
9
2.进样体积的转换
用完全相同的样品
– 同样的浓度 – 同样的稀释倍数
计算对应于柱体积的进样体积，几何缩小
10 µL 进样量从 4.6 x 150 mm到 2.1 x 50 mm 4.6 x 150 mm
2.1 x 50 mm
10
2.进样体积的转换
供试品浓度不变 10 µL 进样量从 4.6 x 150 mm（5µm）到 2.1 x 50 mm(1.7 µm )
如果没有同品牌的小粒径填料色谱柱，可以参考一些比较成熟的色 谱柱分类手段，选择相似色谱柱。相关查询网址如下：
( /resources/freeware/colsel/) (/app/USPNF/columnsDB.html)
13
方法转换后的验证
准确性试验：考察辅料对主药的影响、溶剂提取、供试品制备的方 法；
线性范围：方法转换中，通过前述公式计算调整进样体积，使得方 法转换前后，供试品溶液进入色谱柱后，在柱内的浓度是一致的， 因此线性不变或变化十分微小；
重复性试验：考察供试品制备方法（例如是否能提取完全）； 稳定性试验：考察供试品溶液状态放置是否稳定； 专属性：筛选色谱柱、流动相、柱温以及流速的主要指标，方法开
如果柱效N相同, 峰高与柱长L成反比 :
Height
1 L
柱效相同, 柱长L 降低与颗粒度dp成正比 (固定 L/dp)
1. e.g., 5 μm，150mm 色谱柱同 1.7 μm，50 mm色谱柱柱效相当，分离度相当， 那么1.7um色谱柱的峰高应该是5um色谱柱的3倍 2. 同样的进样浓度，峰面积相同，因小颗粒色谱柱扩散小，峰展宽变小，峰宽变小，峰高变高
高 液相色谱
超高效液相色谱
超高效液相色谱
液相色谱
低
低
产品生命周期
5
背景与前提
《中国药典》2015年版HPLC通则（0512）关于色 谱柱粒径改变的使用规定：
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进 样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如 有必要，色谱条件也应作相应调整。当测定结果产生争议 时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
10
表4、槐角苷测定UPLC梯度洗脱程序
时间（分钟） 0~0.2 0.2~3 3~18
18~18.1 18.1~20 20~20.1
25
流动相A（%） 10
10~15 15~20 20~90
90 90~10
10
流速（ml·min-1） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
流速（ml·min-1） 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
3
背景与前提
分离效果提高
<2 µm 3.5，2.5 µm 5 µm
<2 µm
更多样材质
10 µm
30-80 µm
2004年第一台超高 效液相色谱仪器问世
传统液相色谱仪器
1970s
1980s 1990s 2000s 分析时间缩短
2010s
高效率 低耗能 环保
4
效率提高、降低能耗和减少污染
高
工作效率飞跃式提升
需验证：分离度和灵敏度两个方面
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van Deemter 方程
其他条件不变的情况下，扩撒越小，A、B项越小，H越小 H越小，N柱效越高
A项 + B项 + C项
H a(dp) b c(dp)2 µ
µ
A 项 涡流扩散/粒子间通道. 取决于颗粒大小和流速.
B 项 分子的轴向扩散. 反比于流速.
H a(dp) b c(dp)2 µ µ
图3、槐角苷测定HPLC图谱（进样10µL）
100分钟
图4、槐角苷测定UPLC图谱（进样1µL）
25分钟
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表3、槐角苷测定HPLC梯度洗脱程序
时间（min） 0~5 5~18
18~84 84~85 85~89 89~90
100
流动相A（%） 10
10~15 15~20 20~90
90 90~10
发阶段已经进行了全面研究；此处方法转换，选择与原标准填料一 致或相似的色谱柱，流动相与原标准保持一致，柱温不变，流速根 据上述公式进行调整，使得线流速不变，专属性不受影响。
因此上述所及验证工作均无需重做。
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方法转换后的验证
依然针对两者的差异进行验证：色谱柱填料粒径不同、系 统体积不同、仪器输送流动相系统内径不同，方法转换调 整了流速、进样量、梯度洗脱程序
C 项 传质动力学. 正比于流速和颗粒度的平方.
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什么是 HETP?
H = HETP (理论塔板高度) {要求 H 尽可能小,这样就可以往柱子里‘装’更多的‘板’}
N ，柱效
N L HETP
N= # Plates (来自蒸馏理论)
Plate HETP
L 柱长
5 块板
(较大的 H) “较厚”
10块板
同时，由于不同仪器之间系统体积存在差异，也需要在转换时加以考虑。 梯度程序转换的计算过程这里不做详细描述。通常色谱仪器均配备转换软 件，输入原始洗脱程序，软件可自动计算并转换为目标仪器的洗脱程序， 然后根据色谱峰分离情况进行人工微调。
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方法转换成功其他因素
为方便转换，并保持转换前后色谱行为一致，最好采用同品牌、相 同填料仅粒径不同的色谱柱。
为进样准确、重现性好，建议在UPLC上的最小进样体积为0.5 µL。 可根据灵敏度调整进样体积，最大进样体积为10µL，但为了减少溶剂扩散对分 离度的影响，推荐最大进样量不超过5 µL