细胞破碎法——高压匀浆法
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
常用的几种细胞破碎方法介绍
随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。 1. 高压匀浆法 设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，美国Microfluidics公司和ATS公司均有产品出售。其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。 存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 2. 高速珠磨法 设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。 3. 超声破碎 频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 存在问题；超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。 4. 酶溶法 就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 存在的问题；易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 5. 化学渗透法 某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 本文介绍了几种细胞破碎的方法，可谓各有千秋，在实际应用中，应尽量考虑全面，选择最科学、有效的方法。
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
工艺学3-细胞破碎
第三章
第一节 第二节 第三节
（二）高速珠磨机 （High speed bead mill）
第三章
第一节 第二节 第三节
高速珠磨机工作原理
磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园 盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离 小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层 之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
（二）、目的物的稳定性 （三）、破碎效果和产物释放率
第三章
第一节 第Байду номын сангаас节 第三节
方法 匀浆法
机 械 珠磨法 法
超声波
表 3-1 常用的细胞破碎方法
原理
特点
基于液相的剪切力
适用面广，处理量大，速度快，在工业生产上广 泛应用，但不适用于某些高度分支的微生物，另 外产热大，可能造成生物活性物质失活
利用研磨作用破碎
胞 内 冰 晶 引 起 细 胞 膨 较温和，但破碎作用较弱，常需反复冻融，仅
胀破裂
适于在实验室中使用
渗透压冲击法 渗透压突然变化，使细 较温和，但破碎作用较弱，常与酶法合用 胞快速膨胀破裂
化学试剂处理 应 用 化 学 试 剂 溶 解 细 需选择合适的试剂，减小对活性物质的破坏，
胞 或 抽 提 某 些 细 胞 组 可应用于大规模生产
第三章
第一节 第二节 第三节
三、化学法（Chemical treatment）
（一）、加入化学试剂 1、用碱处理 2、用脂溶性有机溶剂 3、表面活性剂
（二）酶解法（Enzymatic lysis） （三）制成丙酮粉
第三章
第一节 第二节 第三节
四、选择破碎方法的依据
（一）、规模及成本 工业规模：高压匀浆和珠磨
细胞破碎技术与设备
缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需 选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚 糖抑制葡物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶 胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。
影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH 值、激活剂和细胞代谢途径等。
缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋 白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过 滤速度下降。
2、化学渗透法（Chemical permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、 表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可 以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）， 从而使胞内物质有选择地渗透出来。
• 特点：主要用于实验室中。该法对冷冻 －融解敏感的生化物质不适用。
5、超声破碎法
• 工作原理：利用超声波振荡器发射的1525kHz的超声波处理细胞悬浮液，由于超 声波的空化作用而使细胞破碎。
• 特点：超声波振荡容易引起温度的剧烈 上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入 冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
细胞破碎技术与设备
1 Summary 概述 2 Cell Wall 细胞壁
3 Methods and Machines 细胞破碎方法与设备
1 Summary 概述
• 生物分离的第一步是将生物机体从发酵液 中分离，通常使用过滤和离心等方法。
• 发酵细胞的代谢产物有的分泌到细胞或组 织之外，还有许多是存在于细胞内部。
• 超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、 细胞浓度及首种类型等因素有关。
• 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插 入介质两种型式。
• 结构组成：超声波发生器、探头、机架、 液槽、控制系统等。
几种常见的细胞破碎方法
几种常见的细胞破碎方法：
一、机械方法
1、捣碎发：一般用组织捣碎机，适用于动物组织及植物组织的破碎。
2、研磨法：一般手工研磨，适用少量的细菌或坚硬之物组织。
3、匀浆法：主要是利用高压827bar使细胞破碎。
二、物理方法
1、温差法：主要通过反复的冻溶或急热骤冷等温度变化来达到目的
2、压差法：使用加压的方法主要采用高压匀浆机来破碎
3、超声法：采用超声波15-20KHz使细胞在高强度急剧振动下破碎
三、生物化学方法
1、采用化学试剂甲苯、丙酮、氯仿、Triton等通过化学渗透使细胞内含物选择性的渗透出来。
2、自溶法：主要通过一定的pH和温度，借助细胞内的自身酶系使细胞破碎。
3、酶解法：利用各种水解酶、或变性剂如8M 尿素、6M 盐酸胍等变性剂、表面活性剂NLS、SDS等使细胞破碎。
细胞破碎方法综述
细胞破碎方法综述细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。
结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法1前言目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。
破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。
自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。
很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。
因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。
2细胞破碎技术2．1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
细胞破碎的方法
工艺流程
第一步：溶酶法溶解细胞 第二步：萃取 青霉素有机酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水，利用这一性质在酸 性条件下将青霉素转移到有机溶酶中，调节PH。常用醋酸丁酯和戊酯萃取 第三步：反萃取
采用硫酸盐，碳酸盐缓冲溶液 进行反萃取。与溶剂比为3:4，几次萃取后 浓缩加倍。
第四步：脱色 加入活性炭，除去色素 第五步：结晶 青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小在二次丁酯萃取液中加入醋酸甲乙醇 溶液，青霉素钾盐就会结晶析出。然后采用重结晶法，进一步提高纯度，将钾盐溶 于氢氧化钾溶液，调Ph为中性，加无水丁醇，在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。
择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 Nhomakorabea 产黄青霉
• 简介：产黄青霉属无性型真菌。分布于土壤、空气及腐败的有机材料 等基物。最适生长温度为20-30°C。产生青霉素、多种酶类及有机酸， 是重要的工业用真菌，也产生真菌毒素。 • 形态：菌落在CYA（查氏酵母膏琼脂）培养基上生长，25°C下7天 生长至直径21-25 mm，具辐射状皱纹，边缘菌丝体白色，质地绒状， 分生孢子结构大量，蓝绿色，有些许浅黄色渗出液和可溶性色素，菌 落反面呈浅黄褐色。分生孢子梗发生于基质菌丝，孢梗茎100-300 × 3-4 um，壁平滑。帚状枝三轮生，偶尔双轮生或四轮生。每个帚状枝 有副枝2-3个，14-20 × 3-4 um。梗基每轮3-5个，10-15 × 2.5-3.5 um，顶端稍膨大。瓶梗安瓿形，每轮4-7 个，7-10 × 2-2.7 um，梗 颈较短。分生孢子球形、近球形、椭圆形或近椭圆形，2.5-3.6 × 2-3 um，淡绿色，光滑，分生孢子链稍叉开而成疏松的柱状。 • 用途：生产抗生素－青霉素；葡萄糖氧化酶；霉腐测验菌；橡胶腐蚀 菌；有机酸Gluconic生产菌；杀虫剂降解菌； Ethylene生产菌；氨基 酸－谷氨酸生产菌
浅谈常用细胞破碎方法
浅谈常用细胞破碎方法随着生物技术的逐渐发展，生物所产生的各种代谢产物也逐渐被人们发现其有用的一面，但是在获得目的产物过程中，往往因为不同产物所处的生物个体不同，造成了个体差异性，所以为了获得大量，不被破坏的产物，往往针对不同生物个体选用不同的细胞破碎技术来做预处理。
现将几年来一直常用的细胞破碎技术介绍一下：关键词：细胞破碎机械法酶法（一）细胞破碎的定义1.细胞破碎（cell rupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
2.破碎各种细胞的主要阻力：2.1破碎细菌细胞的主要阻力：肽聚糖网状结构的致密程度和强度，取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度;2.2 破碎酵母细胞的阻力:葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度;2.3 破碎霉菌细胞的阻力:葡聚糖网状结构的交联度,几丁质或纤维素的纤维状结构。
(二) 细胞破碎的方法1.机械法1.1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器（High pressure homogenizer）操作原理：在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
操作方式：单次或多次循环出口温度：20℃左右压力：55－70Mpa适用范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。
料液细胞浓度：20%左右。
☆团状和丝状菌，不宜使用。
注意事项：（1）操作温度：↑２－３℃/10MPa（2）对料液作冷却处理。
（3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。
（4）较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合该法处理【1】。
1.2珠磨机研磨珠磨机研磨：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
工作原理：细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起，磨室配有冷却夹套。
注意事项：操作参数较多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30%左右。
(12)细胞破碎
13
3、超声破碎法
机理
空化作用引起的冲击波和剪切力有关 空化现象：在强声波作用下，气泡形成、 胀大和破碎的现象 实验室规模应用较普遍
注意冷却，间歇进行 产生噪音（声能传递困难） 产生的自由基易使敏感性物质失活 对不同菌种，效果差别较大
14
优点
缺点
物理法
非机械法
化学法 酶解法
15
1、物理法
反复冻融法
22
应多种方法相结合提高破碎率
23
细胞破碎的机械法主要有 ___________ 、 ____________、____________ 。 （ ）采用珠磨法进行时，为了达到较高的破 碎率，需要进行循环破碎。
24
预习
过滤设备
25
压力 温度 浓度 次数
55-70MPa ＜30℃，预冷2--8 ℃ 60—80% 2-4次
12
比较
高压匀浆法
少，易于控制，适合 大规模生产 需配备换热器， 冷却 进行级间冷却 破碎率 低，需循环2-4次 适用性 不适合丝状真菌及有 包含体的基因工程菌
参数
珠磨法
多，浆液损失很大 有双重功能：破 碎和冷却 较高 各种微生物细胞
设备
中试 工业
4
高速珠磨机的原理
研磨破碎
进入珠磨机的细胞悬浮液与研磨剂在 搅拌浆的作用下充分混合，在剪切、 碰撞作用下，细胞破碎，释出内容物
固液分离 珠液分离器（珠隔离盘） 控制温度
夹层冷却
5
需控制的参数
搅拌速度 进料速度 温度 浓度 珠体大小 珠体装量
剪切力 研磨时间
实验一 高压匀浆法破碎酵母细胞提取蔗糖酶
5．使用实验仪器时，应注意用电安全；实验仪器使用结束后，应 及时关闭电源。
6．严禁在实验室吸烟。 7．禁止在实验室用电炉或明火取暖。 8．实验时，应保持桌面的整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌
面收拾干净方可离开实验室。
名称 MW
Km
pI
最适pH
(底物为蔗 (等电
糖)
点)
膜外酶 27万(22万) 26mM
5.0 (3.5～ 5.5)
最适温 度
60℃
膜内酶 13.5万 25mM
4.5 (3.5～ 60℃ 5.5)
注：pH 4.2-4.5最适温度：高浓度时60℃，低浓度时 45~50℃，80℃失活
pH 3.0 最适温度40℃以下 pH 5.0 最适温度40℃以下 pH 7.0 最适温度45℃以下
高速匀浆破碎的动力学方程为：
l 1 n 1S
k Pa Nb
细胞破碎率S与操作压力P和循环次数N之间的关系。
k为破碎速度常数
上述参数随微生物种类和培养条件的不同而有所差异
压力P可用动能表达：
l 1 n 1 S
k ( u2 )a N b
2
细胞破碎率用包内产物释放率表示：
三、操作步骤
1、称取32克活性酵母和60克蔗糖放入1000ml烧杯中，加入 300ml水于室温条件下活化2小时（课前活化，节省实验时 间），然后加入500ml冷却至10℃左右的去离子水，用玻璃 棒搅拌均匀，再用组织捣碎机打碎使其呈均匀状。（注意： 此用量为全班30组共用）
2、用高压匀浆机对酵母悬浮液进行细胞破壁。压力表设定为 560~600bar，循环操作3次。
细胞破碎
细胞破碎-------综述摘要：细胞破碎，细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁细胞破碎方法有：高压匀浆破碎法振荡珠击破碎法高速搅拌珠研磨破碎法超声波破碎法渗透压冲击破碎法酶溶破碎法等等，这篇综述主要讲的是超声波破碎法。
关键词：细胞破碎超声波破碎法原理应用超声波细胞破碎仪又叫超声波细胞粉碎仪是一种利用强超声在液体中产生空化效应，对物质进行超声处理的多功能、多用途的仪器。
能用于多种动植物细胞、病毒细胞的破碎，同时超声波细胞破碎仪可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡、清洗及加速化学反应等。
仪器原理：超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。
简单说就是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。
超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。
同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。
超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。
热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42-43℃），因为正常组织的临界致死温度为45.7℃，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。
细胞破碎技术
摘要：细胞破碎技术的根本概念及其根本方法关键词：细胞破碎技术破碎方法生物别离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反响液或动植物细胞的培养液中别离并纯化有关产品〔如具有药理活性作用的蛋白质等〕的过程，又称为下游加工过程。
生物别离过程的主要特点:常无固定操作方法可循,生物材料组成非常复杂,别离操作步骤多，不易获得高收率,培养液〔或发酵液〕中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高,别离进程必须保护化合物的生理活性,生物活性成别离开生物体后，易变性、破坏, 基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。
生物别离的一般工艺流程：发酵液→预处理→细胞别离→〔细胞破碎→细胞碎片别离〕→初步纯化→高度纯化→成品加工的过程，而胞产物需经细胞破碎，细胞碎片别离等步骤；胞外产物那么将细胞去除后，对余下的液体即可进展初步纯化。
在生物别离技术中细胞的破碎应用非常的广泛，尤其在生物技术迅猛开展的今天更是不可小视。
组织细胞的破碎方法很多，有机械方法、物理方法、化学方法和生物化学方法等。
在破碎前，材料常需要预处理，如动物材料要除去与实验无关甚至有阻碍的结缔组织，脂肪组织和血污等，植物种子需要除壳，微生物材料需将菌体和发酵液成分分开等。
不同实验规模、不同实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。
一些坚韧组织，如肌肉、植物的根茎等，常需要强烈的搅拌或研磨作用，才能把其组织细胞破坏。
而比拟柔软的组织如肝、脑等，用普通的玻璃匀浆器即可到达完全破坏细胞的目的破碎技术中细胞破碎法包括机械法和非机械法．机械法又包括高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎等方法。
非机械法包括化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、枯燥法。
细胞壁的结构和破碎方法都会对细胞破碎产生影响。
了接细胞壁的组成对于选择破碎方法非常重要。
在微生物中各种生物的细胞虽小但是每一种都有其特有的组成方式。
例如：细菌球菌直径0.5-1um杆菌直径0.5-1um，长为直径1-几倍螺旋菌直径03-1um，长1-50um 细菌大小也不是一成不变的细胞重量10-13-10-12g，每g细菌根本结构是细胞不变局部，每个细胞都有，如细胞壁、膜、核。
18-2 细胞破碎技术
细胞破碎技术微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。
必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
机械法外加作用力的方式非机械法所用方法的属性物理法化学法生物法物理破碎法l高压匀浆法、l挤压法、l高速珠磨法、l超声波法；化学破碎法l渗透冲击法l增溶法生物破碎法l酶溶法①高压匀浆法——大规模细胞破碎的常用方法①高压匀浆法适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。
不适用于高度分支的微生物。
①高压匀浆法在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
②挤压法（X-press法）将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃至-30℃形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出使之破碎。
②挤压法（X-press法）细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，引起包埋在冰中的细胞变形所致。
主要用于实验室中。
②挤压法（X-press法）适用的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。
对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。
③珠磨法进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂微球（直径小于1mm的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等）一起快速搅拌，细胞与微球之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。
③珠磨法在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可以得到部分解决。
④超声波破碎法超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。
通常采用的超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。
④超声波破碎法在超声波作用下液体发生“空穴”作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为机械能，至使细胞破碎。
对产物的释出选择性好，细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。
药品生物技术《3高压匀浆法》
内容总结
1。采用高压匀浆器〔由高压泵和匀浆阀组成〕。细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击 环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。Bran and luebbe 公司SHL40 型。高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右
一 机械法
机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法〔homogeniation〕 高速珠研磨破碎法〔bead grinding〕 超声波破碎法〔ultrasonication〕
1 第一页，共七页。
1高压匀浆法
〔High-ogeniation〕
采用高压匀浆器〔由高压泵和匀浆阀组成〕。
细胞悬浮液自高压室针形阀 喷出时，每秒速度高达几百 米，高速喷出的浆液又射到 静止的撞击环上，被迫改变 方向从出口管流出。细胞在 这一系列高速运动过程中经 历了高速剪切、碰撞及压力
骤降，造成细胞破碎。
阀座
阀杆 撞击环 阀杆
压力控制手轮
APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
2
第二页，共七页。
标准阀
细胞破碎阀
锯齿阀
刀型阀
锥型阀 球型细胞破碎阀
高压匀浆器各种阀型设计源自3第三页，共七页。
高压匀浆器的种类
高压匀浆器的种类较多： WAB公司的AVR型 Bran and luebbe 公司SHL40型 意大利Niro Soavi
5 第五页，共七页。
高压匀浆法适用的范围
—大规模细胞破碎的常用方法 ☆高压匀浆法适用的范围：
酵母和大多数细菌细胞的破碎；
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细胞破碎法——高压匀浆法
摘要：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。
目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。
破碎方法可归纳为机械法和非机械法两大类。
机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超生波等方法。
本次综述主要介绍高压匀浆法，高压匀浆法的应用以及高压匀浆机的介绍和使用。
关键词：细胞破碎高压匀浆法高压匀浆器应用
正文：
一、高压匀浆法破碎细胞的原理
高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，作用机理是液体剪切作用，利用高压是细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。
细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。
二、高压匀浆器
高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。
三、高压匀浆器性能特点
凡与物料相接触的零部件材料都具有极高的耐磨性和良好的耐腐蚀性、对物料不会产生不良的影响，高压均质机与其他均质设备相比，具有占地面积小、效率高、能量大、反应时间快、运转费用低等优点。
高压均质机品种、规格齐全，完全能满
足各个领域用户的需要。
均质功率从1kw-200kw，压力从15MPa-100MPa，从0.2升物料能做试验的台式小型均质机到3万升/小时超大型均质机，各种规格达一百多种，为全国同行业之最。
机器的均质系统分别由一级阀和二级阀组成双极均质系统，两者的均质压力可以在其额定的压力范围内任意选择，两者可同时使用，也可单独使用。
均质阀的结构可分为平型和W型两种，平型阀能承受高压冲击，具有耐磨性好、使用寿命长等优点。
W型阀是一种能在一组阀件内产生多次均质过程结构的网，大大的提高了其均质效果。
泵体阀的结构分球型阀和碟型阀两种，球型具有耐高压、使用寿命长等优点。
碟型具有结构简单、容积效率高等优点。
四、高压匀浆器使用领域
1、食品饮料行业：豆奶、花生奶、松子奶、大豆蛋白质等各种植物蛋白和饮料。
橙汁、苹果汁、核桃露、莲子汁、椰子汁等各种悬浮果汁饮料。
酸奶、均质牛奶、纯牛奶、甜牛奶、乳酸饮料、冰淇淋、豆奶粉等各种乳品和乳制品。
2、制药：抗生素、各种乳剂、浆液制剂、中药制剂、脂肪乳输液、花粉破碎及各种营养保健液。
3、轻工化工行业：香精香料、化妆品、乳化硅油、感光剂、增亮剂、增稠剂、高级涂料、颜料、染料、重油渗水等。
4、生物工程技术：对大肠杆菌、酵母菌、细胞进行破碎，提取其细胞内酶、蛋白质等活性产物。
五、高压匀浆法的应用举例
高压匀浆破碎螺旋藻细胞释放藻蛋白的研究
螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻，因含有多种对人体有益的营养物质而受到广泛的关注。
螺旋藻可通过大面积的海水养殖而得，其含量丰富的藻蛋白，在化妆品制造业、食品加工等行业中有着巨大的应用潜力，近期的研究还发现藻蛋白对某些疾病有治疗作用。
从海藻中提取分离藻蛋白目前仍是获得藻蛋白的主要途径，由于藻蛋白为螺旋藻的胞内产物，因此，提取纯化分离藻蛋白采用何种细胞破碎技术是直接影响蛋白提取率的关键因素之一。
目前用于螺旋藻藻蛋白提取分离过程中的细胞破碎方法主要有超生波破碎法、高压匀浆法、反复冻融法、酶溶法和化学试剂法等。
但由
于超声粉碎，反复冻融，酶溶法只适用于实验室中小规模的细胞破碎，在某种程度上限制了螺旋藻藻蛋白的大规模分离纯化。
高压匀浆法是工业上常用的细胞破碎方法。
采用高压匀浆法破碎螺旋藻进行细胞破碎，释放藻蛋白过程中的物理和化学因素，包括均浆次数、均浆压力、藻细胞密度、缓冲液PH值、悬浮液体系等进行系统研究，并结合该过程的动力学规律，初步确定了大规模破碎螺旋藻细胞，提取藻蛋白的匀浆工艺，为螺旋藻蛋白工业化生产奠定基础。
六、总结
影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数，升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不致过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。
Brokman等人已研究了能适应与高压操作的匀浆阀，试验表明在约175MPa的压力下，破碎率可达100%，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长的很慢。
在工业生产中，通常采用的压力为55--70MPa。
破碎性能还随菌体的种类和生长环境的不同而不同，例如采用高压匀浆法时，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。
高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用。
参考文献：1新编生物工艺学下册俞俊棠唐孝宣等主编化学工业出版社
2、胡一兵，胡鸿钧，李夜光等，从一种富含藻蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究[J] 武汉植物学研究，2002,20（4）:299-302
3、吴蕾，洪建辉，甘一如，张瑛，高压匀浆破碎释放重组大肠杆菌提取包含体过程的研究[J]，高校化学工程学报，2001，（02）
4、吴蕾，庞广昌，陈庆森，高压匀浆破碎螺旋藻细胞释放藻蛋白的研究[J]食品科学，2008，（03）
5、彭卫民，商树田，刘国琴等，钝顶螺旋藻藻蛋白的提取[J]食品科学，1996（6）:48-49。