GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程

蛋白纯化系统操作流程

一、蛋白的诱导：蛋白原核表达

1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中（分区划线），37℃培养过夜；

2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中，37℃振摇过夜；

3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中，振摇2h（留样1ml）；

4、加入一定终浓度IPTG，37℃诱导表达4h（留样1ml），离心，弃上清收集细菌。

存入4℃。

二、蛋白表达状态分析（可溶性or包涵体表达）

取少量（1ml）诱导菌体沉淀，加入不含变性剂（如盐酸胍，尿素等）PBS（150μl），超声裂解。分离上清和沉淀，分别SDS-PAGE电泳。

三、蛋白的纯化

纯化前准备

1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液，

Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。

2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂

3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素

注：

1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则

需先用含有尿素的buffer进行透析

2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH 值法等可被应用，详见说明书

Bingding buffer 中咪唑的浓度

在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。

Buffer 的准备

所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤

所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低

推荐buffer

Bingding buffer：20 mM 磷酸盐

0.5 M NaCl

20- 40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐

0.5 M NaCl

500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）

样品准备

样品需被充分溶解。过柱前经0.45 μm滤膜过滤。样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。

重力纯化法Ni-NTA Column 准备

1. 温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。

2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。

3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。

4. 用bingding buffer 重复第3步。

5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurry

样品与Ni 柱结合

1.每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白

2.将混合物室温，低速振荡孵育1h

Buffer 洗涤及洗脱

1.离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4℃for SDS-PAGE

analysis。

2.用1 ml Binding Buffer洗涤柱子，在摇床上温和的振荡2min，然后低速离心5 minute

at 500 ×g，小心吸出上清，重复该步一次。上清保存放在4°C for SDS-PAGE

analysis。

3.用0.5 ml Elution buffer洗脱柱子，方法同4。重复该步三次。分管收集4次洗脱

液，存放在4°C for SDS-PAGE analysis。

纯化柱的再生：

如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重复使用5－7次。

1.用5倍柱体积的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸盐，0.5 M NaCl pH 7.4的buffer

洗涤柱子，洗去螯合的镍离子。

2.用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子

3.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子

4.用0.5倍柱体积的含0.1 M 的NiSO4的无菌水溶液装填

5.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子

6.用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子

7.加入20％的乙醇4-30℃长期保存。

在某些情况下，一些物质如变性蛋白或脂质在再生过程中不能被洗脱，可采用

Cleaning-in-Place 方法，具体见说明书。