微生物研究技术与方法 重点大全要点

第一章绪论

课程主要内容：

1、微生物学研究技术发展

2、微生物材料的准备

3、微生物研究中的物理化学方法基础

4、微生物的观察与微生物分析法

5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离

6、微生物育种技术

7、固相化技术与生物传感器

8、免疫学技术

9、微生物学研究的分子生物学技术

微生物学研究技术发展：

微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括：

1、显微镜术和制片染色技术

2、消毒灭菌技术和无菌操作技术

3、纯种分离和克隆化技术

4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术

5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术

6、菌种保藏技术

7、原生质体制备和融合技术

8、各种DNA重组技术等

第二章微生物材料的准备

第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作

掌握知识要点：

原理、方法、生物活性物质的除菌

无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存

一、几个基本概念

控制害菌的措施：

1）杀灭法：

○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物

○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌

2）抑制法：

○1防腐：抑制霉腐微生物

○2化疗：抑制宿主体内的病原菌

1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的

措施。例如：高温灭菌、辐射灭菌等。

2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或

内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。例如：

常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法

对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法

1）巴氏消毒法（pasteurization）

2）煮沸消毒法

采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。

3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。

防腐的方法：

①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、

生物制品或菌种等。

②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食

等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。

除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。

③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常

见的防止霉腐的方法；

在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。

④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的

方法。

⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜

蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。

⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄

泥螺等产品，都是特色风味食品。

⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂

或防霉剂来达到防霉腐的目的，如：

用苯甲酸来使酱油防腐；

用尼泊金作墨汁防腐剂；

用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂；

用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。

4、化疗——化学治疗

利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。

用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。

要点：

1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。

2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。

3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。

灭菌、消毒、防腐、化疗的比较

比较项目灭菌消毒防腐化疗

处理因素强理、化因

素

理化因素理化因素化学治疗剂

处理对象任何物体内

外

生物体表，酒、乳

等

有机质物体内

外

宿主体内

微生物类型一切微生物有关病原菌一切微生物有关病原菌对微生物作用彻底杀死杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死

实例加压蒸汽灭

菌，辐射灭

菌，化学杀

菌剂

70％酒精消毒，巴

氏消毒法

冷藏，干燥，

糖渍，盐腌，

缺氧，化学防

腐剂

抗生素，磺胺药，

生物药物素

二、灭菌的方法

1、干热灭菌法:干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃、2h，到达

160 ℃之后开始计时。

实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。

2、火焰灭菌法：利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。该法方法简单，

灭菌彻底，但使用范围有限，仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。

3、电磁波、射线灭菌法：利用电磁波、紫外线、X射线、γ射线或放射性物质产生的

高能粒子进行灭菌，以紫外线最常用。

紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力

强。

紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体

物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。

250～270 nm之间杀菌效率高，以波长在260 nm左右灭菌效率最高。

除紫外线外，X射线和γ射线也可进行灭菌。

超声波、微波（均匀、快速）

4、湿热灭菌法：最常使用又最简单的物理方法是加热灭菌。

因为细胞内部的蛋白质在加热到70℃以上，便会变性而使微生物细胞死亡。虽然有些细菌可以抵御100℃甚至更高的温度，但绝大多数微生物，包括耐热力极强的芽孢细菌，在一个大气压力下加热到121℃，经过15-30min后大都会被杀死。家用高压蒸汽锅内的温度可以接近这个温度。

从事微生物学工作，必须采用特殊的装置，这就是我们通常所用的高压蒸汽灭菌法，它能达到完全灭菌的目的。所用器具叫高压灭菌锅。

（1）湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件

多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5-10min；

酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理；

细菌的芽孢：121℃处理15min以上；