微生物研究技术与方法 重点大全要点

第一章绪论课程主要内容：1、微生物学研究技术发展2、微生物材料的准备3、微生物研究中的物理化学方法基础4、微生物的观察与微生物分析法5、细胞破碎方法及亚细胞物质分离6、微生物育种技术7、固相化技术与生物传感器8、免疫学技术9、微生物学研究的分子生物学技术微生物学研究技术发展：微生物学是整个生物学中第一门具有一套自己独特操作技术的学科，其技术的发展主要包括：1、显微镜术和制片染色技术2、消毒灭菌技术和无菌操作技术3、纯种分离和克隆化技术4、合成培养基技术；选择性和鉴别性培养技术5、突变型标记和筛选技术；深层液体培养技术6、菌种保藏技术7、原生质体制备和融合技术8、各种DNA重组技术等第二章微生物材料的准备第一节灭菌、消毒、除菌与无菌操作掌握知识要点：原理、方法、生物活性物质的除菌无菌操作：意识、个人卫生、环境卫生、灭菌、接种等操作、保存一、几个基本概念控制害菌的措施：1）杀灭法：○1灭菌：彻底杀灭（杀菌、溶菌）——一切微生物○2消毒：部分杀灭——仅杀灭病原菌2）抑制法：○1防腐：抑制霉腐微生物○2化疗：抑制宿主体内的病原菌1、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。

例如：高温灭菌、辐射灭菌等。

2、消毒：消除毒害，即传染源、致病菌。

一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。

例如：常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法1）巴氏消毒法（pasteurization）2）煮沸消毒法采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。

3、防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过抑菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。

防腐的方法：①低温：利用4℃以下的各种低温（0，－20，－70，－196℃）保藏食物、生化试剂、生物制品或菌种等。

②缺氧：可采用抽真空、充氮或二氧化碳、加入除氧剂等方法来有效防止食品和粮食等的霉腐、变质而达到保鲜的目的。

除氧剂的种类很多，是由主要原料铁粉再加上一定量的辅料和填充剂制成，对糕点等含水量较高的新鲜食品有良好的保鲜功能。

③干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对粮食、食品等进行干燥保藏，是最常见的防止霉腐的方法；在密封条件下，用生石灰、无水氯化钙、无氧化二磷、氢氧化钾（或钠）或硅胶等作为吸湿剂，也可很好的达到食品、药品和器材等长期防霉腐的目的。

④高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保存食物，是在民间早就流传的有效防霉腐的方法。

⑤高酸度：在我国和韩国等具有悠久历史的泡菜，就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂菌和防霉腐的目的。

⑥高醇度：用白酒或黄酒保存食品，在我国有悠久传统，如：醉蟹、醉麸、醉笋和黄泥螺等产品，都是特色风味食品。

⑦加防腐剂：在有些食品、调味品、饮料、果汁或工业器材中，可加入适量的防腐剂或防霉剂来达到防霉腐的目的，如：用苯甲酸来使酱油防腐；用尼泊金作墨汁防腐剂；用山梨酸、脱氢醋酸作化妆品防腐剂；用二甲基延胡索酸（DMF）作食品、饲料的防腐剂。

4、化疗——化学治疗利用具有高度选择毒力即对病原菌具高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。

用于化学治疗目的的化学物质称化学治疗剂，包括磺胺类等化学合成药物、抗生素、生物药物素和若干中草药中有效成分等。

要点：1.灭菌：利用物理、化学方法杀死物体表面、内部全部的微生物。

2.消毒：杀死物体表面或内部有害微生物或使其钝化，使致病微生物不致病。

3.除菌：利用物理方法除去物体表面的微生物。

灭菌、消毒、防腐、化疗的比较比较项目灭菌消毒防腐化疗处理因素强理、化因素理化因素理化因素化学治疗剂处理对象任何物体内外生物体表，酒、乳等有机质物体内外宿主体内微生物类型一切微生物有关病原菌一切微生物有关病原菌对微生物作用彻底杀死杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死实例加压蒸汽灭菌，辐射灭菌，化学杀菌剂70％酒精消毒，巴氏消毒法冷藏，干燥，糖渍，盐腌，缺氧，化学防腐剂抗生素，磺胺药，生物药物素二、灭菌的方法1、干热灭菌法:干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃、2h，到达160 ℃之后开始计时。

实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。

2、火焰灭菌法：利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。

该法方法简单，灭菌彻底，但使用范围有限，仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。

3、电磁波、射线灭菌法：利用电磁波、紫外线、X射线、γ射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌，以紫外线最常用。

紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。

紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。

250～270 nm之间杀菌效率高，以波长在260 nm左右灭菌效率最高。

除紫外线外，X射线和γ射线也可进行灭菌。

超声波、微波（均匀、快速）4、湿热灭菌法：最常使用又最简单的物理方法是加热灭菌。

因为细胞内部的蛋白质在加热到70℃以上，便会变性而使微生物细胞死亡。

虽然有些细菌可以抵御100℃甚至更高的温度，但绝大多数微生物，包括耐热力极强的芽孢细菌，在一个大气压力下加热到121℃，经过15-30min后大都会被杀死。

家用高压蒸汽锅内的温度可以接近这个温度。

从事微生物学工作，必须采用特殊的装置，这就是我们通常所用的高压蒸汽灭菌法，它能达到完全灭菌的目的。

所用器具叫高压灭菌锅。

（1）湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5-10min；酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理；细菌的芽孢：121℃处理15min以上；根据锅的容量决定灭菌的时间，通常为20—30min。

以杀灭嗜热脂肪芽胞杆菌（121℃，10min）为依据（2）高压蒸汽灭菌锅的种类卧式、手提式、立式（3）湿热灭菌出现的问题I.培养基发生浑浊或沉淀a. 蛋白质大分子凝固b. 钙、镁等的二、三价离子与可溶性磷酸盐形成沉淀措施：分开灭菌II.改变和破坏营养成分糖在加热条件下产生褐色物质使pH值下降0.3左右冷凝水使体积增加酸性条件下灭菌更彻底，只需要煮沸5min措施：葡萄糖灭菌115℃，20—30min（4）间歇灭菌适用于蛋清、牛乳等不耐热的培养基方法：60—70℃灭菌30min→37 ℃培养过夜→反复5—6次5、化学药剂灭菌法某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。

化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。

化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。

（1）表面消毒剂一切对活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。

①甲醛（一般不单独使用）甲醛35 mL/4 m3+5%重铬酸钾，熏蒸12h，可杀灭空间中的芽胞、孢子等。

若污染严重可加15%重铬酸钾。

②硫磺3—4 g/m3对真菌毒杀效果最好③酸类：苯甲酸、水杨酸、乳酸④碱类（一般不用）⑤还原剂：甲醛单独使用⑥氧化剂：2.5%的高锰酸钾2h可杀死芽胞碘：1%的碘酒10min杀芽胞有机碘：碘伏（杀菌谱广、细菌不易产生耐药性、毒性低、对伤口刺激小）氯：饮用水：0.2—0.5 mg/L2%—5%漂白粉水洗接种环，可防噬菌体⑦酚类（损伤细胞膜）5%的苯酚抑菌，加1%—2%的NaCl可增强效果来苏儿只杀灭营养体细胞，不杀芽胞⑧醇类：70%—77%的乙醇只表面消毒，不杀芽胞⑨染料：1%结晶紫，不能杀死孢子或芽胞⑩重金属：波尔多液：石灰水+硫酸铜6、过滤除菌法空气和不耐热的液体培养基的灭菌（1）滤膜（100mL以下小范围适用）规格：0.45、0.25、0.2μm（不适用于病毒）操作过程：1.安装金属筛板2.放置超细纤维板滤膜3.待滤溶液过滤4.滤液无菌检查●滤膜使用前用无菌水浸泡30min以上，使其孔径张开；装入滤器时亮面向上。

●粘性基质如牛乳、蛋清先稀释5—10倍，而后加压。

过滤液进行真空浓缩（<60 ℃）。

真空中，水60℃蒸发，记录体积。

大范围情况下过滤除菌☐抽滤瓶，布氏漏斗+纱布（过滤纸）☐超细纤维玻璃滤纸主要用于发酵罐中的分过滤器，加2124酚醛树脂+酒精（溶解作用）可增加滤纸的强度而不影响通气☐粘合瓦楞纸用于超净台三、无菌操作1、接种工具1）环：一般用2）针：穿刺用3）扒、铲：用于真菌（长在培养基内）4）钩：用于放线菌（未长孢子，菌丝在培养基内）2、超净工作台第二节微生物采集和分纯技术要点：●不同生态条件下的微生物采集，●加富培养，●单孢分离，●菌种复壮。

一、采样1、采样方法土壤：①去除表层土5厘米，②取土样50g置于无菌袋，记录时间、地点、气候，③尽快分离水样：水样采集器当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。

2、生境细菌、放线菌：菜园土、耕作土（有泥腥味）真菌：森林土耐热菌：火山、堆肥、温泉水抗高渗微生物：盐碱土光合细菌：水边的土壤或污泥，有机废水边的土壤或其中的污泥农药降解菌：农药厂、排污口降解烃类的细菌：石油厂边土壤稀有菌：海水等处豆科植物：根瘤菌果园：酵母茶园、酸性土、枯枝败叶处：真菌春秋季能采集到较多微生物雨季易分到兼性微生物二、分离操作1.划线纯化2.单细胞操作产荚膜的菌荚膜中有杂菌或伴生菌，可先将其培养成芽孢，然后热处理。

若多种微生物在一起但比较娇弱，则不适于热处理，在这种情况下，尤其是多种微生物性质相似、难以分开时，可在显微镜下利用毛细管吸单个菌。

三、加富培养1)直接在土样中加葡萄糖等营养物质，培养、增殖2)客土法：直接用土样接种入其它土中（或培养基培养）3)加入目的菌所好的碳源或氮源4)添加限制生长的因素，如：pH、温度或抗生素四、性能测定1、初筛（一般根据选择性培养基的原理进行。

）不同糖中生长情况抗生素的抑菌圈酪蛋白透明圈注意菌落直径与抑菌圈（透明圈）之比越大越好a.OD值（以不接菌培养基对照为零）不适用于产荚膜菌b.平板计数c.血球计数2、稳定及性能的进一步提高，复筛（一般将菌种培养在三角瓶中作摇瓶液体培养，然后对培养液进行分析测定。

）第三节培养基设计制备、大规模细胞培养、好氧与厌氧培养技术一、培养基1、定义：人工配制的适合微生物生长代谢、繁殖的营养基质。

2、培养基的类型和用途○1根据来源分：天然培养基马铃薯合成培养基无氮培养基半合成培养基LB培养基○2根据状态分固体培养基适于微生物的保存、计数、纯化、分离液体培养基适于观察微生物生长代谢半固体培养基适于观察细菌的运动性（琼脂0.2~0.5%）③根据主要成分或使用目的分：A.基础培养基B.增殖培养基C.鉴别培养基（eg.：乳糖培养基，应用于水质检测）D.选择培养基（在培养基中添加某些物质使特定微生物得以生长而其它不生长eg.：无氮培养基、抗生素培养基）无机盐培养基：培养自养微生物，eg.：硅胶平板④根据生产工业的要求分：孢子培养基——供制备孢子用；种子培养基——满足菌种生长；发酵培养基——满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累⑤无机盐培养基：培养自养微生物，eg.：硅胶平板⑥活组织培养基：鸡胚、单层细胞、昆虫、高等动物，用于培养病毒、立克次氏体等专性寄生微生物3、成分⏹能源：有机能、无机盐、光源⏹碳源：作为细胞骨架⏹氮源：合成蛋白质⏹生长因子：嘌呤、嘧啶、氨基酸、维生素⏹无机因子：K+、Na+、Co+、Zn2+、Cu2+、Mo2+一般用玻璃仪器配制⏹水细菌需水量> 酵母、霉菌需水量综合考虑干燥程度、培养料的持水性及环境因素通风加水量一般为培养料的1~1.5倍4、培养基的选择①从微生物的特点来选择②液体和固体培养基选择③从生产实践和科学试验的不同要求选择④从经济效益方面考虑选择生产原料5、培养基成分配比的选择①参照前人所使用的较适合于某一类菌种培养基的经验配方，②结合所用菌种和产品的特性，③采用摇瓶、玻璃瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等进行逐个单因子试验，④观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响，⑤综合考虑各因素的影响，⑥得到一个适合该菌种的培养基配方，⑦以得到高产。