流式细胞分析操作流程
CytoFLEX流式细胞分析仪快速入门
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f
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3. 验证 USB 配置密钥已连接至 USB 端口。
注意
可能会出现仪器损坏。从流体容器托架取下鞘液容器，并且远离仪器进行充 注，以防止鞘液溢出损坏仪器电路。
4. 从流体容器托架取下鞘液容器，并用提供的鞘液填充鞘液容器。 5. 如有必要，拆下右侧盖子，并填充带有 1 部分 Contrad 70 和 1 部分 DI 水混合的深度清
CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 启动
2. 请确保所有管线和电缆根据颜色代码连接至仪器。
b
c
d 1. 废液液位传感。与废液传感器电 缆相连。 2. 流动室废液排出。与流动室废液 导管相连。 3. 鞘液液位传感。与鞘液传感器电 缆相连。 4. 废液排出。与废液导管相连。 5. 鞘液回流。与鞘液导管相连。 6. 鞘液流入。与鞘液导管相连。
洁溶液。
警告
漂白剂具有化学伤害危险。为避免接触漂白剂，请使用包括防护眼镜、手套和 适当的实验室服装在内的屏障保护。使用化学药品前，请参阅有关化学品暴露 的安全数据表以了解详细信息。
6. 如有必要，清空废液容器。将 400 mL 5% 至 6% 的漂白剂添加至废液容器。
仪器启动
1. 打开仪器后盖上的电源开关，它位于电源电缆正上方。
8. 使用“阈值”工具 ，或选择
9. 使用“标尺”和“增益”工具 至所需位置。
设置辨别以消除图上不需要的细胞群。
，或选择
以将图上显示的细胞群移动
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CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 调节设置和补偿
调节设置和补偿
“图表”、“门控”和“统计资料”管理
1. 若要修改图表、门控、统计表或细胞群层级属性，请选择该图表并右击以选择属性 选项。参见以下示例。 • 图表属性 （右击门控）
流式检测ros步骤
流式检测ros步骤流式检测ROS（Reactive Oxygen Species）是一种用于研究细胞中活性氧化物含量和活性的方法。
ROS在细胞代谢和信号传导中起着重要的调节作用，但过高的ROS水平可能导致细胞损伤和炎症反应。
了解ROS的产生、调节和检测方法对于研究细胞的生理和病理过程具有重要意义。
本文将介绍流式检测ROS的步骤。
一、实验准备在进行流式检测ROS之前，首先需要准备实验所需的材料和仪器。
主要的实验材料包括细胞悬液、ROS探针染色剂和细胞培养基。
实验仪器主要包括流式细胞仪和荧光显微镜。
确保实验室环境整洁，并进行必要的消毒操作，以防止细菌或其他污染物对实验结果产生影响。
二、样品处理1. 细胞培养和处理：培养细胞至对数生长期，并按照实验需求进行不同处理组的分组。
例如，可以设置对照组、药物处理组和其他实验条件组。
注意保证各组样品的处理时间和用量一致。
2. ROS探针染色：选择合适的ROS探针染色剂，如DCFH-DA （Dichlorodihydrofluorescein diacetate）或DHE（Dihydroethidium），并根据产品说明将其加入培养基中处理细胞样品。
染色后，细胞内的ROS会使染色剂发生荧光变化。
三、流式细胞仪检测1. 仪器准备：打开流式细胞仪，进行仪器预热和流体平衡操作。
检查仪器的各项参数设置，包括激发光源波长、荧光信号收集设置等。
确保仪器的正常工作和准确的数据获取。
2. 样品装载：将经处理和染色的细胞样品分装到合适的试管中，并用细胞培养基或缓冲液洗涤样品，以去除残留的染色剂和培养基。
避光操作是非常重要的，以防止染色剂受到光照引起的激活。
3. 流式细胞仪设置：设置细胞仪的相关参数，包括流速、激发光源强度、荧光信号收集通道等。
根据不同的染色剂选择合适的激发波长和荧光通道，以确保准确的荧光信号检测。
4. 数据获取：将样品试管依次插入流式细胞仪中，进行数据获取。
根据实验需要，可以选择连续获取或选取特定的细胞种群进行采集。
巨噬细胞流式分选操作步骤
巨噬细胞流式分选操作步骤
流式细胞术是一种常用的细胞分选技术，可以分离、分析和纯化复杂的细胞群体。
巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，具有多种生物学功能，在研究免疫学、炎症和感染等方面具有重要应用价值。
本文介绍了巨噬细胞流式分选的操作步骤。
1. 细胞准备
首先需要从组织或培养物中收集巨噬细胞，一般采用胶原酶或丝裂霉素等酶类消化酶来分离细胞。
收集细胞后，需要进行胞外标记，以便在流式细胞仪中进行检测和分选。
可以使用荧光素、荧光素同工酶、抗体等标记物质。
2. 流式细胞检测
将标记后的细胞悬浮于缓冲液中，加入适当的抗体，进行流式细胞检测。
在流式细胞仪中，通过激光器激发标记物质，检测细胞的荧光信号，并进行细胞计数和分析。
3. 巨噬细胞分选
根据细胞检测结果，可以设置分选门限，选择特定的细胞群体进行分选。
巨噬细胞分选可以采用荧光激活细胞分选或者磁珠分选等技术。
在分选过程中，需要注意细胞的稳定性和纯度，以保证实验结果的准确性。
4. 分选后细胞的处理
分选后的巨噬细胞可以用于一系列的细胞学、免疫学、分子生物学等实验中，如细胞培养、基因表达分析、蛋白质分析等。
需要注意
的是，在使用分选后的细胞时，应该避免细胞的冻融和处理时间过长等因素对细胞的影响。
总之，巨噬细胞流式分选是一项重要的实验技术，它可以帮助研究者更深入地了解巨噬细胞的生物学功能和免疫调节机制。
在实验中，需要严格按照操作步骤进行，保证实验结果的准确性和可重复性。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
CytoFLEX流式细胞分析仪快速入门
1. 每隔一个月清洁一次流动室。 a. 机器待机时，选择“细胞分析仪”菜单中的深度 清洁，然后等待至过程结束。
注意
可能会出现仪器损坏。请勿将清洁溶液放置在流动室中超过 24 个小时。 b. 等待半个小时，然后选择充注以清除剩余清洁溶液。 c. 等待至充注循环完成，然后运行“日常清洁”。
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显示并保存。
• 结果部分的绿色图标 • 结果部分的红色图标
表明通过。 表明失败。
6. 若 QC 失败，请充注仪器、初始化并重复操作 QC。
注释 若 QC 同一天连续失败两次，请联络 Beckman Coulter 代表。
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CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 数据采集
数据采集
创建实验
重要 对于每个新批次编号，下载对应的目标值文件，并参考步骤 2.
4. 使用屏幕左侧的批次编号-下拉列表 球对应的批次编号。
，选择与 QC 荧光微
5. 选择 始 QC。
，将已准备的 QC 样品试管插入样品试管托架，然后选择
以开
注释 QC 可能需要数分钟。QC 荧光微球的最低流速为 100 事件/秒。一旦完成，结果就会自动
4. 请熟悉工具栏。
图形 统计资
料 层级
5. 利用“图表”工具
门 缩放 标尺
增益 阈值 撤消/恢复
新建所需直方图或点状图。
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CytoFLEX 流式细胞分析仪快速入门 数据采集
6. 设置所需样品流速，然后选择“采集”面板上的
，以起动激光器和流体。
7. 将样品管装入样品端口，然后选择
以开始采集和显示数据。
关闭
1. 从“文件”菜单打开任一实验，并初始化仪器。 2. 在“细胞分析仪”菜单中选择日常清洁。
流式细胞操作流程
流式细胞操作流程
流式细胞术是一种用于分析和分类细胞的生物学技术。
以下是典型的流式细胞操作流程：
1.细胞样本准备：
•收集要分析的细胞样本，可以是细胞悬液、组织细胞悬液或血液等。
•对样本进行必要的预处理，如裂解红细胞，去除细胞碎片等。
2.标记细胞：
•使用荧光标记物（荧光染料、抗体等）标记细胞中的特定分子，以便流式仪器能够检测到这些标记。
•标记的目标可以是表面抗原、细胞器、DNA或RNA等。
3.样本染色：
•添加染色剂（荧光标记物）到细胞样本中，使其能够在流式仪器中发光。
•染色通常通过孵育样本和染色剂混合物来实现。
4.细胞固定（可选）：
•如果需要保持细胞在染色后的状态，可以进行细胞固定步骤。
5.样本混合：
•将经过标记和染色的细胞混合均匀，以确保获得代表性的样本。
6.样本注射到流式细胞仪：
•将样本通过流式细胞仪的进样口注入，使其形成单个细胞的流动流。
7.激光激发和信号检测：
•使用激光激发样本中的荧光标记物。
•流式细胞仪会检测细胞产生的荧光信号，并记录下来。
8.数据分析：
•通过计算机软件对收集到的数据进行分析。
•分析可以包括对不同细胞亚群的鉴定、数量统计、染色物的表达水平等。
9.结果呈现：
•将分析结果呈现为图表、图像或表格，以便更好地理解和解释实验结果。
流式细胞术可以用于许多研究领域，如免疫学、细胞生物学、肿瘤学等，以研究和识别不同细胞类型、表达分子的水平等。
流式细胞仪操作规范流程-SOP
流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T 及纯真T 的检测3：HLA-B27 测定4：CD55／CD59 测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T 细胞亚群细胞内因子IFN- γ /IL-4 测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定（流式细胞仪）医院检验科操作规程文件号：200 年月日起实施第1 版（共3 页）本规程每2 年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定试剂品牌剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体2—8℃(CD45/4/8/3 No.6607013 CD45/56/19/3No.6607073CD4/8/3 No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672CD3/19 No.IM1293CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5No.IM2643Flow-Count 荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂 (Q-Prep) 液体 (No.7546946)A ：甲酸液体 70ML 室温B ：碳酸钠等液体 32ML 室温C ：多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C No.IM1401) 液体室温3：鞘液 (No.8546859) 液体 20L室温4：清洗液 (No.8546930)液体5L室温5：荧光微球 (No.6605359) 液体10ML2-8 ℃(Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备 ：参考值(百分数(绝对值) )CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)Th/Ts 1.05-2.03周血 NK 细胞增加。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro1.软件，选择“联机”。
Acq Connect（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；（2） 对实验样本进行命名；（3） 对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3. 画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几够选中图形），将 改为 ,更改横纵备注：第一个散点图横坐标为FSC ，纵坐标为SSC 。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
流式细胞凋亡检测步骤
流式细胞凋亡检测步骤引言：细胞凋亡是一种正常的生理现象，它在维持机体稳态和调节细胞数量方面起着重要作用。
流式细胞凋亡检测是一种常用的方法，用于定量测量细胞凋亡程度。
本文将介绍流式细胞凋亡检测的步骤，并详细阐述每一步的操作方法和注意事项。
一、细胞准备在进行流式细胞凋亡检测之前，首先需要获得待检测的细胞样品。
这些细胞可以是体外培养的细胞系，也可以是从动物或人体组织中分离得到的原代细胞。
细胞样品应该在合适的培养条件下生长，确保其细胞活力和凋亡状态的稳定。
二、细胞收集细胞收集是流式细胞凋亡检测的关键步骤之一。
常用的方法有机械剥离、消化酶处理和离心等。
在收集过程中，需要注意尽量减少细胞损伤和凝聚物的形成。
收集的细胞应该进行适当的洗涤，以去除培养基中的残留物。
三、细胞固定细胞固定是为了防止细胞在后续处理过程中的损伤和凋亡。
常用的固定剂有甲醛、乙醛和乙酸等，可根据实验需要选择合适的固定剂和浓度。
固定处理后的细胞需要进行洗涤，以去除固定剂的残留物。
四、细胞染色细胞染色是流式细胞凋亡检测的核心步骤。
常用的染色剂有荧光素酶标记的Annexin V和PI（propidium iodide）等。
Annexin V 用于检测细胞外磷脂外翻的现象，而PI则用于判断细胞膜完整性。
染色剂的选择应基于实验目的和细胞类型，同时需要根据厂家提供的说明书进行操作。
五、流式细胞仪检测流式细胞仪是流式细胞凋亡检测的重要工具。
在进行检测之前，需要对流式细胞仪进行校准，包括激光功率、流速和检测通道的设置等。
校准后，将染色后的细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过激光的照射和细胞的流动，测量细胞的荧光强度和散射信号。
六、数据分析流式细胞仪检测得到的数据需要进行后续的分析和解释。
常用的数据分析软件有FlowJo、ModFit和Cyflogic等。
通过设置门，可以将细胞分为不同的亚群，分析细胞的凋亡率和凋亡类型等。
此外，还可以进行统计学分析，比较不同实验组之间的差异。
流式细胞术工作原理
流式细胞术工作原理流式细胞术又称为流式细胞分析（FACS），是一种用于快速测定和分析细胞及其组分的工具和技术。
它通过对单个细胞的多重参数进行单细胞测量和分析，可对不同种类和状态的细胞进行区分和识别，从而为细胞学、免疫学、实验室诊断和药物研发等领域提供了重要的实验手段和数据支持。
流式细胞术工作原理基于一定的光学原理和电子信号转换技术，其主要步骤包括样本准备、流式细胞仪检测和数据分析等三个部分。
下面将详细介绍各个部分的工作原理：1. 样本准备样本准备是流式细胞术的第一步，它主要是为了将待测细胞或细胞组分转化成能够被流式细胞仪检测和分析的样品，其中包括以下几个步骤：（1）细胞收集：这是流式细胞术的前提条件，它要求待测细胞必须单个存在，不能形成团块或粘连。
通常采用利用酶或化学试剂将细胞从组织、器官、培养基或体液中分离出来进行收集。
其中细胞来源各不相同，可以是血液、骨髓、组织癌变、分离免疫细胞等等。
细胞处理在流式细胞学中是个棘手的问题。
该过程既需要最大程度地维持细胞的原始形态和性质，又不影响流式细胞仪对细胞的检测和分析。
样本处理的方式包括细胞染色、标记、吸释样本预处理等方法，处理条件严格，样品要求高纯度，无污染。
细胞染色是为了能够让细胞在仪器中产生不同的光谱信号。
染色剂的种类有非常多，它们包括活细胞染色剂、细胞膜染色剂、DNA染色剂、标记抗体等。
一般情况下，染色前细胞都要进行适当的处理，如调节pH值、添加细胞破解液等，扩大染色剂与待测细胞的作用。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪是用于测量和分析单个细胞的主要工具和设备，它是由激光器、光学器件、检测单元和计算机组成的。
在具体工作中，样品通过采用压力推动等技术被强制通过一个光学器件中的微细通道，流式细胞仪则通过这个微细通道对其进行检测和分析。
具体步骤如下：（1）激光器发出激光：激光是流式细胞仪最核心的光源，它可以发射可见光、激光、紫外线等光谱范围内的单色光束。
光线经过反射器作用，形成光束。
流式细胞术常见实验分析
2.3 胞内活性氧水平的检测与分析
DCFH-DA单染法
DCFH-DA
DCFH ROS
DCFH-DA进入细胞在细胞内酯酶作 用下脱去二脂形成不发荧光的DCFH， 当细胞内存在H2O2，O2-，OH-等 ROS时被氧化成发绿色荧光的DCF。
DCF
注意事项：
结果分析
——数据分析中几种常见图形及分析原则 （1）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显
2323胞内活性氧水平的检测与分析胞内活性氧水平的检测与分析dcfhda单染法dcfhdadcfhrosdcfdcfhda进入细胞在细胞内酯酶作用下脱去二脂形成不发荧光的dcfh当细胞内存在hros时被氧化成发绿色荧光的dcfyte 8HT 操作流程
正常细胞 凋亡细胞
488nm
+
-
+
-++
+
-+
590nm
488nm +
-+
529nm
结果分析
用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体） 和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色 荧光与黄色荧光阳性百分率之比。
Ratio=G.M./Y.M.
比值升高，膜电位降低，膜受损。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+ 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+ 坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
结果分析
阴性对照
流式细胞检测方法
流式细胞检测方法流式细胞检测是一种常用的细胞分析技术，广泛应用于生命科学研究和临床诊断。
它通过流式细胞仪对细胞进行高通量的分析和排序，具有高灵敏度、高分辨率和高效率的特点。
流式细胞检测方法包括样本准备、细胞标记和流式细胞仪分析等几个步骤。
细胞标记是流式细胞检测的关键步骤之一、通过对细胞表面或细胞内特定结构或分子的标记，可以实现对不同类型细胞的鉴别和特定分子的表达或变化的测定。
细胞标记主要有两种方法：直接标记和间接标记。
直接标记是将荧光染料等直接结合到待测分子或细胞表面抗原上。
间接标记是通过结合在第一层标记上的一种特异性标记物，如抗体，再与待测分子结合。
细胞标记的选择需要根据研究目的和标记物的特异性来确定。
流式细胞仪分析是流式细胞检测的核心环节，它能够实现对细胞的高速精确检测和分类。
流式细胞仪利用流体力学原理，将单个细胞按顺序通过聚焦点，通过光散射和荧光信号等技术检测和记录细胞的特性。
光散射分析可以根据细胞的大小和形态进行粗略分类或鉴别。
荧光信号则可以根据特定荧光标记物的强度和频谱进行细胞鉴别和特定分子的定量测定。
通过采集细胞的多个参数，如荧光强度、散射光强度和荧光颜色等，可以对细胞进行多参数的定量和定性分析。
此外，流式细胞仪还可以实现单细胞的分选、分析和培养，对于研究特定细胞亚群或深入研究个体细胞的生物学特性非常重要。
总的来说，流式细胞检测是一种先进的细胞分析技术，具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点。
它在生命科学研究和临床诊断中有广泛的应用前景，可以用来研究细胞的表型和功能，鉴别和分析特定细胞类型，评估细胞的状态和变化，以及监测疾病的发展和治疗效果的评估。
随着新的标记技术和流式细胞仪的不断进步，流式细胞检测将在未来发展出更多的应用和挑战。
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）
流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）⼀、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续⼯作3个⼩时左右）、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中⽓压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.⽓压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中⽓泡。
⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。
⼀般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加⼊1滴质控⼩微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。
3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器⾃动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运⾏完毕，显⽰结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，⼀定要⽤“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使⽤仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。
1.（2）对实验样本进⾏命名；（3）对实验通道进⾏预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界⾯被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3.画图选择画图⼯具（⼀般选择散点图），Inspect界⾯会⾃动弹出，对⼏个常⽤选项进⾏设定：将散点图选中（⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第⼀个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
流式细胞术临床检测项目操作流程
临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。
抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃2：全血溶血试剂A：甲酸70ML 室温B：碳酸钠等32ML 室温C：多聚甲醛14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
流式细胞仪的操作和数据分析技术
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Dector/Amps
Threshold
Compensation
status
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弹出此对话框说明机 器与电脑建立链接
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放大器（AmpGain）：可对信号进行微调。对FSC、SSC、FL1、FL2、 FL3可设置放大模式和放大增益。若放大模式选择Lin(线性)，放大器 的增益可在1－9.99之间调节。可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标 上下移动。若放大模式选择Log(对数)，放大器的增益则不可调节。 对数常用于分开阴性信号和弱阳性信号
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CONTENTS
Histogram Dot Plots Contour Pseudo 3D & 3D
Gating
Papers Cell cycle Apoptosis
Histogram
Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
Monocyte retention in the bone marrow
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
Cancer Cell 2011；20：781–796
JEM 2007；204（5）：1037–1047 The Journal of Immunology, 2009, 182: 240–249
Dot Plot
Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3
J. Clin. Invest. 2007;117:902–909
Distinct Populations of Cancer Stem Cells Determine Tumor Growth and Metastatic Activity in Human Pancreatic Cancer
Histogram
Cancer Cell 2011；20： 728–740
Dot Plot
Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development
Nature 2011；479:547-551
Science 2003;299:1057-1061
Contour
Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido
Nature Medicine 2011；17（9）:1094-1100
Cell Death and Differentiation 2008;15:51–57
Prolonged Maturation and Enhanced Transduction of Dendritic Cells Migrated from Human Skin Explants After In Situ Delivery of CD40-Targeted Adenoviral Vectors
Histogram
CXCL12 and Vascular Endothelial Growth Factor Synergistically Induce Neoangiogenesis in Human Ovarian Cancers
Cancer Res 2005; 65(2): 465-72
Histogram
Cancer Res 2005; 65(8): 3437-46
Pretransplant CSF-1 therapy expands recipient macrophages and ameliorates GVHD after allogeneic hematopoietic cell transplantation
Combined Genetic Inactivation of b2-microglobulin and CD58 Reveals Frequent Escape from Immune Recognition in Diffuse Large B Cell Lymphoma
Cancer Cell 2011；20： 728–740
JEM 2011;208(5):1069-1082
Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide
Nature 2007;449:564-569
Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis
Cancer Res 2006; 66(13): 6807-15
Flt-1, vascular endothelial growth factor receptor 1, is a novel cell surface marker for the lineage of monocyte-macrophages in humans Blood. 2001;97:785-791
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Nature 2002；418:41-49
Histogram
Human dendritic cell mediated cytotoxicity against breast carcinoma cells in vitro
Journal of Leukocyte Biology 2002;72:312-320
Cell Stem Cell 2009;4:263–274
CD8 a+ Dendritic Cells Are the Critical Source of Interleukin-12 that Controls Acute Infection by Toxoplasma gondii Tachyzoites
Cancer Cell 2011; 20, 701–714
Engraftment and Reconstitution of Hematopoiesis Is Dependent on VEGFR2-Mediated Regeneration of Sinusoidal Endothelial Cells
Immunity 2011;35, 249–259
Identification and Functional Analysis of Tumor-Infiltrating Plasmacytoid Dendritic Cells in Head and Neck Cancer
Cancer Research 2003；63：6478–6487
Contour
Antiangiogenic and Antimetastatic Activity of JAK Inhibitor AZD1480
Cancer Res 2011; 71(21); 6601–10
Pseudo 3D & 3D
Gating
Peripheral blood
CD80 in Immune Suppression by Mouse Ovarian Carcinoma– Associated Gr-1+ CD11b+ Myeloid Cells
Dot Plot
Prevalence of Regulatory T Cells Is Increased in Peripheral Blood and Tumor Microenvironment of Patients with Pancreas or Breast Adenocarcinoma
Cancer cell 2004;6:409-421
Tumour hypoxia promotes tolerance and angiogenesis via CCL28 and Treg cells
Nature 2011；475:226-230
Nonmyelinating Schwann Cells Maintain Hematopoietic Stem Cell Hibernation in the Bone Marrow Niche
The Journal of Immunology, 2002, 169: 5ivo Elicited Tumor Infiltrating Macrophages and Dendritic Cells towards Tumor Rejection
Cancer Immunol Immunother 2007; 56:641–648
VCAM-1 Promotes Osteolytic Expansion of Indolent Bone Micrometastasis of Breast Cancer by Engaging a4b1PositiveOsteoclast Progenitors
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Cell Stem Cell 2007;1:313–323
Essential Role of Lung Plasmacytoid Dendritic Cells in Preventing Asthmatic Reactions to Harmless Inhaled Antigen
J. Exp. Med 2004;200(1):89-98
Metronomic cyclophosphamide regimen selectively depletes CD4+CD25+ regulatory T cells and restores T and NK effector functions in end stage cancer patients