流式细胞术实验技巧及数据分析
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精品课件
BrdUrd与PI检测
精品课件
细 胞 三 色 荧 光 检 测
精品课件
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
精品课件
G6=R1*R5
精品课件
*CD4抗原分子结构精引品课起件 CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
精品课件
纯化单核细胞
精品课件
调节性T细胞检测
精品课件
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
精品课件
DNA分析比较
精品课件
排除双联体细胞
精品课件
细胞阻滞在G2M期
精品课件
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
精品课件
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
Laser
488nm
精品课件
ECD 620
PE
CY5
670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
精品课件
表型测定 细胞分选
统
继
FISH PCR
析
计 学
续 培
分
养
单 分 散 细 胞
精品课件
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
精品课件
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
精品课件
精品课件
BrdUrd与PI检测
精品课件
BrdUrd与PI检测
488
525 、575
488
525
5Leabharlann Baidu8
488
525、 675
488
525、 625
488
525、575、675
488
525、575、675 绿、橙红
488
525 、 575
精品课件
633
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿” 精品课件
荧光补偿
精品课件
Mean值判断补偿
精品课件
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE FITC+T red
FITC+PeCy5 FITC+ ECD F+P +PeCy5 F+ ECD +PeCy5 F+P +PeCy5 +APC
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气精压品课,件就可获得不同的流速。
精品课件
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
精品课件
激发光源与光束成形系统
精品课件
光
束
聚焦距离
成
形
与 激光束
.
细
聚焦透镜
胞
受
照
64um
方
强度
式
32um
0
精品课件
这种椭圆形 20um 光斑的检测
区保证每个 细胞分别受 到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细 32um 胞照明技术
精品课件
荧 光 光 谱 重 叠
FITC和PE荧光光谱重叠
精品课件
荧 光
Uncompensated vs Compensated
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
精品课件
细胞散色光信号
精品课件
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光
经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光
信号.
精品课件
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
流式细胞术实验技巧及数据分析
上海交通大学医学院 史桂英
精品课件
BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
FACSAria
精品课件
FACSVantage&DiVa
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
精品课件
FCM原理示意图
精品课件
层流技术
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中
层流 的形成要满足雷诺数
dρV
Re =
< 2300，
η
式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和
V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利
用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作
用,为细胞分析分选提供技术保证.
精品课件
精品课件
精品课件
精品课件
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
精品课件
凋亡细胞测定
精品课件
细胞凋亡检测
精品课件
阴性的设置
精品课件
血 小 板 检 测
精品课件
血 小 板 检 测
精品课件
血 小 板 检 测
精品课件
血小板检测
精品课件
谢谢
精品课件
BrdUrd与PI检测
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细 胞 三 色 荧 光 检 测
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细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
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G6=R1*R5
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*CD4抗原分子结构精引品课起件 CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
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纯化单核细胞
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调节性T细胞检测
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特 异 染 色 的 荧 光 信 号
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DNA分析比较
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排除双联体细胞
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细胞阻滞在G2M期
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双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
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BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
Laser
488nm
精品课件
ECD 620
PE
CY5
670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
精品课件
表型测定 细胞分选
统
继
FISH PCR
析
计 学
续 培
分
养
单 分 散 细 胞
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FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
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胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
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BrdUrd与PI检测
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525 、575
488
525
5Leabharlann Baidu8
488
525、 675
488
525、 625
488
525、575、675
488
525、575、675 绿、橙红
488
525 、 575
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633
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿” 精品课件
荧光补偿
精品课件
Mean值判断补偿
精品课件
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE FITC+T red
FITC+PeCy5 FITC+ ECD F+P +PeCy5 F+ ECD +PeCy5 F+P +PeCy5 +APC
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气精压品课,件就可获得不同的流速。
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低速
高速
不同样本速率形成的样本流
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激发光源与光束成形系统
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光
束
聚焦距离
成
形
与 激光束
.
细
聚焦透镜
胞
受
照
64um
方
强度
式
32um
0
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这种椭圆形 20um 光斑的检测
区保证每个 细胞分别受 到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细 32um 胞照明技术
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荧 光 光 谱 重 叠
FITC和PE荧光光谱重叠
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荧 光
Uncompensated vs Compensated
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
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细胞散色光信号
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细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光
经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光
信号.
精品课件
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
流式细胞术实验技巧及数据分析
上海交通大学医学院 史桂英
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BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
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FACSVantage&DiVa
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
精品课件
FCM原理示意图
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层流技术
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中
层流 的形成要满足雷诺数
dρV
Re =
< 2300，
η
式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和
V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM利
用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦作
用,为细胞分析分选提供技术保证.
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G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
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凋亡细胞测定
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细胞凋亡检测
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阴性的设置
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血 小 板 检 测
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血 小 板 检 测
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血小板检测
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谢谢
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