流式细胞术免疫标记简介
人巨噬细胞流式标记
人巨噬细胞流式标记标题：人巨噬细胞流式标记：探索免疫系统中的生命守护者引言：免疫系统是人体中最重要的防御机制之一，可以识别和消除入侵的病原体。
人巨噬细胞作为免疫系统中的关键成员，在抗感染和免疫调节中扮演着重要角色。
为了更好地了解人巨噬细胞的功能和特性，科学家们开发了一种流式标记技术，该技术能够准确地鉴定和分析人巨噬细胞的亚群，并揭示其在免疫应答中的作用。
本文将深入探讨人巨噬细胞流式标记的原理、应用和前景，以及对于免疫系统研究的意义。
一、人巨噬细胞流式标记的原理1.1 核心原理人巨噬细胞流式标记利用不同细胞表面标记物间的特异性结合，通过荧光或抗原标记，使得巨噬细胞可以被特定抗体识别和检测。
通过流式细胞仪中的激光器，可以将标记的细胞的信号检测出来，并对其数量和特性进行定量和分析。
1.2 常用标记物人巨噬细胞流式标记中常用的标记物包括细胞表面标记物（如CD14、CD11b等）和内源性病原体相关分子模式识别受体（如TLR1、TLR2等）。
这些标记物的选择与人巨噬细胞的功能和特性密切相关。
二、人巨噬细胞流式标记的应用2.1 疾病诊断与监测人巨噬细胞在多种疾病的发生和发展中起着重要作用，如感染性疾病、自身免疫疾病和肿瘤。
通过人巨噬细胞流式标记，可以对不同疾病状态下的巨噬细胞进行定量和分析，从而为疾病的诊断和监测提供有效指标。
2.2 免疫治疗的发展人巨噬细胞作为重要免疫细胞，其在免疫治疗中的作用日益受到重视。
通过人巨噬细胞流式标记，可以鉴定和分析治疗过程中巨噬细胞的状态和功能，为个体化的免疫治疗策略提供重要依据。
三、人巨噬细胞流式标记的前景与挑战3.1 前景人巨噬细胞流式标记技术的不断创新将使我们更好地理解免疫系统中的巨噬细胞功能和调节机制。
通过深入研究和应用该技术，可以更好地促进疾病诊断、治疗和新药开发。
3.2 挑战然而，人巨噬细胞流式标记技术仍面临着一些挑战。
标记物选择和标记过程的特异性需要更进一步提高，以确保准确性和可靠性。
免疫标记技术名词解释
免疫标记技术名词解释免疫标记技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术。
它利用特异性抗体与待检测的分子结合，然后利用这些抗体上的标记物（如酶、荧光剂或放射性同位素）来检测和定量目标分子的存在和表达水平。
下面是一些常见的免疫标记技术及其解释：1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：在组织切片或细胞上，利用抗体与特定抗原结合，再利用染色剂（如酶、荧光剂）将目标抗原可视化，从而研究和分析细胞或组织中特定蛋白质的表达和定位情况。
2. 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）：通过与荧光素结合的抗体，将特定蛋白质或其他目标分子在细胞或组织中可视化。
这种技术不仅可以用于检测蛋白质的表达和定位，还可以用于研究细胞的功能、相互作用和信号通路等。
3. 免疫酶标记（Immunoenzymatic labeling）：利用酶标记（如辣根过氧化物酶-HRP）结合抗体，形成特定酶抗体复合物。
通过加入合适底物和显色反应，可以观察到酶的活性，从而实现对目标分子的检测和定量。
4. 免疫原位杂交（Immunohistochemical In Situ Hybridization，IHC-ISH）：结合免疫组化和原位杂交的技术，可以同时检测细胞或组织中的蛋白质表达和基因表达情况。
通过使用标记有荧光或酶的核酸探针，可以在组织切片或细胞上可视化特定基因的表达位置。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：该技术利用荧光标记的抗体与细胞中的特定分子结合，经过流式细胞仪检测细胞的荧光强度和分布情况。
这种技术可以用于检测和分析细胞表面标记物、细胞周期、凋亡等多种细胞特性。
免疫标记技术的应用范围非常广泛，可以用于癌症诊断、药物研发、免疫学研究和疫苗开发等领域。
通过免疫标记技术，科研人员可以更加准确地了解分子的功能、定位以及其在疾病中的变化，从而为疾病的早期诊断和治疗提供重要的依据。
医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 量与细 胞周 期
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
小胶质细胞流式标记
小胶质细胞流式标记
小胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞，它们在维持神
经系统正常功能、代谢调节和免疫反应中起着重要作用。
流式标记
是一种常用的细胞分析技术，通过使用特定的抗体对细胞表面或内
部分子进行标记，然后利用流式细胞仪进行分析和检测。
针对小胶质细胞的流式标记，可以选择特定的抗体来标记它们。
常用的小胶质细胞标记抗体包括CD11b、CD45、CD64等。
CD11b是
一种细胞表面标记，它通常用于标记单核细胞系的细胞，包括小胶
质细胞。
CD45则是一种白细胞常见的标记，用于区分白细胞和非白
细胞。
CD64是单核细胞的标记，也可以用于小胶质细胞的标记。
在流式标记实验中，首先需要对待测样本进行细胞表面标记，
然后使用流式细胞仪进行细胞分析。
通过流式细胞仪可以对细胞进
行高通量、高灵敏度的分析，得到细胞表面标记的情况，从而对小
胶质细胞进行定量和定性分析。
除了单一细胞表面标记外，还可以结合细胞内标记进行更全面
的分析。
例如，可以使用荧光染料或荧光蛋白标记小胶质细胞内部
的特定蛋白或分子，以实现对小胶质细胞功能和代谢状态的分析。
总的来说，小胶质细胞的流式标记是一种重要的细胞分析技术，通过选择合适的抗体和标记方法，可以全面、准确地分析小胶质细
胞的表面标记和内部特征，为进一步研究其功能和参与的生理过程
提供重要的实验手段。
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的先进技术，它通过对细胞的特定特征进行高效、快速的检测和分析，为科学研究和临床诊断提供了强大的工具。
流式细胞术的原理和应用涉及到许多方面，包括仪器原理、标记技术、数据分析等，下面将对这些内容进行详细阐述。
一、流式细胞术的原理流式细胞术的原理基于细胞在流动液体中依次通过激光束后的单个检测区域，通过检测细胞在不同参数下的散射或荧光信号来获取关于细胞数量、大小、形态、表面标记物等信息。
流式细胞术通常包括以下步骤：1. 样本制备：将样本中的细胞进行适当的处理，如酶消化、离心、过滤等，以获得单细胞悬浮液。
2. 细胞标记：利用标记物（如荧光染料、抗体等）对待测细胞进行特异性标记，以便在流式细胞仪中对其进行检测和分析。
3. 流式细胞仪检测：将标记后的细胞悬浮液通过流式细胞仪，激光束依次照射每个细胞，并通过检测散射光和荧光信号来获得相关信息。
4. 数据分析：通过专门的流式细胞数据分析软件对获得的数据进行处理和分析，获取细胞的数量、特征等信息。
二、流式细胞术的应用1. 免疫学研究：在免疫学领域，流式细胞术可用于分析免疫细胞的类型、数量和功能，如淋巴细胞亚群的鉴定、T细胞的活化状态等，为免疫学研究提供了重要的数据支持。
2. 癌症诊断和治疗：流式细胞术可用于检测肿瘤细胞的类型和数量，分析肿瘤细胞的表面标记物，评估肿瘤的侵袭性和预后，指导临床治疗方案的选择和疗效监测。
3. 干细胞研究：流式细胞术可用于干细胞的鉴定和分离，分析干细胞的表面标记物和多能性，为干细胞研究和应用提供重要的技术支持。
4. 病原微生物检测：流式细胞术可用于检测微生物感染，分析微生物的数量、类型和毒力，评估感染的严重程度和治疗效果。
5. 血液分析：流式细胞术可用于分析血液中各类细胞的数量和功能，如白细胞亚群的鉴定、血小板的活化状态等，为临床诊断和治疗提供重要信息。
流式细胞术作为一种高效、敏感的细胞分析技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
免疫标记技术的应用原理
免疫标记技术的应用原理什么是免疫标记技术免疫标记技术是一种利用免疫反应特异性和可检测的性质将抗原或抗体标记并追踪的方法，广泛应用于生物医学领域。
该技术基于免疫学的原理，通过选择性地结合特定抗体和其对应的抗原，在细胞、组织或生物样品中检测、定位和分析特定分子的表达和功能。
免疫标记技术的应用领域免疫标记技术被广泛应用于生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域。
以下是免疫标记技术的主要应用领域：1.免疫组织化学：用于检测、定位和分析特定蛋白质在组织和细胞中的表达和分布，从而了解其功能和相互作用关系。
2.免疫细胞学：用于分析和鉴定细胞表面标志物、细胞分型和免疫细胞亚群等方面的研究。
3.流式细胞术：用于检测和定量特定细胞表面标志物的表达水平和细胞数量，广泛应用于免疫学、肿瘤学等领域。
4.免疫组学：用于分析和鉴定蛋白质组学中的特定蛋白质和蛋白质修饰，从而研究蛋白质与疾病、代谢和信号转导等之间的关系。
5.免疫流电法：用于检测和定量细胞表面标志物或药物靶点的表达和结合情况，广泛用于生物药物研究和开发。
免疫标记技术原理免疫标记技术基于免疫学的原理，利用抗体与其对应的抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现目标分子的检测和定位。
以下是常用的免疫标记技术原理：1.免疫荧光染色：该技术利用荧光标记的二抗与目标抗体结合，通过检测荧光染色来观察目标蛋白在组织或细胞中的表达和分布。
2.酶标记技术：该技术利用酶标记的抗体或抗原，在加入底物后通过酶的催化作用产生染色反应，从而可定量分析目标蛋白的含量和活性。
3.放射性标记技术：该技术利用放射性同位素标记的抗体或抗原，通过检测放射性同位素的辐射来实现对目标分子的定量检测。
4.磁性标记技术：该技术利用磁性颗粒标记的抗体或抗原，通过磁场的作用将目标分子分离或聚集，从而实现对目标分子的检测和分析。
免疫标记技术的优势和局限性免疫标记技术具有以下优势：•高度特异性：免疫标记技术基于抗体和抗原之间的特异性结合，具有较高的检测灵敏度和特异性。
流式细胞术的基本原理及其应用
流式细胞术的基本原理及其应用流式细胞术的基本原理是通过将携带荧光标记物的细胞单个穿过一个经过纳米级微孔的流动细胞仪中，在仪器静止状态下，用激光束照射细胞，测量细胞散射光强度和荧光素（荧光标记物）发射光强度，并对荧光标记物进行定量和定性分析。
流式细胞术有多个功能模块来实现这些原理，包括样本处理和采集、检测光源、光学系统、示波器、计算机控制和数据分析软件等。
应用方面，流式细胞术在免疫学、细胞生物学和药物研发等领域具有广泛的应用。
以下是几个流式细胞术的应用举例：1.免疫细胞表型分析：可以通过流式细胞术对白细胞表面的特定抗体标记物进行检测和分析，了解免疫细胞的分布、组成和功能状态。
这种技术在临床用于诊断和监测疾病，例如血液肿瘤的分型和监测、感染和免疫疾病的诊断。
2.DNA细胞周期分析：流式细胞术可以通过染色体分析来检测细胞周期的不同阶段，并评估细胞的增殖和DNA损伤。
通过分析细胞周期，可以确定干细胞、肿瘤细胞和其他细胞类型的比例，从而研究生物学和疾病发展过程中的细胞生长和增殖。
3.细胞凋亡分析：流式细胞术可以用荧光标记物来检测和分析细胞凋亡（程序性细胞死亡）的过程。
凋亡是正常生理和病理过程中的重要事件，例如生长发育和肿瘤发生。
通过分析细胞表面和内部标记物的表达和活性变化，可以了解细胞凋亡的诱导和调控机制。
4.细胞分选和分离:流式细胞术可以通过荧光标记物和细胞大小、复杂性等参数来识别和分选特定类型的细胞。
这种细胞分选技术在基因表达、单细胞转录组学、干细胞研究等领域具有重要应用，可以帮助研究者对细胞进行单个细胞水平的分析。
5.离子指示染料测定：通过使用与细胞膜融合的离子指示染料，流式细胞术可以测定细胞内离子浓度和动态变化。
例如，钙离子（Ca2+）作为重要的细胞信号分子，流式细胞术可以实时监测细胞内钙浓度的变化，并研究其与细胞功能和相应生理过程的关联。
总之，流式细胞术作为一种高通量、高灵敏度和多参数的细胞分析技术，在免疫学、细胞生物学和疾病研究中起着至关重要的作用，不仅可以提供定量的细胞信息，还可以为深入理解细胞生命活动和机制提供有效的实验手段。
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术在免疫学中的应用
一、流式细胞免疫学样品制备的基本原理
• 流式免疫技术是研究以单细胞或单细胞核为基础，并结 合传统的免疫学方法，其基本原理是细胞上的抗原(或 细胞膜受体)与相关的单克隆抗体结合，形成带有荧光 的抗原抗体复合物，通过流式细胞术测定其特定荧光量。
二、流式免疫学染色方法
流式免疫样品的染色: 1)直接免疫标记法 2)间接免疫标记法
FCM检测T细胞亚群的参考值
细胞表面抗原
CD3 CD4 CD8 CD56 CD4/CD8
正常人参考范围
61.1%－77.0 % 35.4 % －52.0 % 18.4 % －31.2 % 10.4 % －19.8 % 0.98 －1.94
四、流式细胞术分析细胞因子及其受体
细胞因子为一组蛋白性介质,在机体发育、功能、调控免疫系统和其它 系统等方面起重要作用。细胞因子在免疫反应或炎症过程或其它病理过程 中起重要作用,细胞被激活后产生细胞因子,参与跨膜信息传递。细胞因子 的所有成员被称为细胞因子家族。
…
谢谢！
原理：用包被有细胞因子特异性抗体的微球（代替
某细胞因子的抗原）捕获血清、血浆、体液或体外培 养上清液中的细胞因子，再用荧光标记的抗细胞因子 单抗来和被捕获的细胞因子结合，然后通过流式细胞 仪检测微球上荧光强度，用已知的标准品和对照标准 曲线就可得出溶液中的细胞因子浓度。
五、FCM白血病免疫分型的临床意义
细胞因子的分类
细胞因子（cytokine,CK）的分类至今尚未统一，主要的分类法为：
按产生细胞因子的细胞类型分类 1.淋巴因子（lymphokine） 主要由淋巴细胞产生，包括 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、 IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF等。 2、单核细胞因子（monokine） 主要由单核/巨噬细胞产生，包括 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、 IFN-α、G-CSF和 M-CSF等。 3、其他细胞产生的 CK 主要由上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、骨髓及胸腺基质细胞 等产生，如IL-11、IL-8、SCF和IFN-β等。
流式细胞术技术在免疫细胞研究中的应用
流式细胞术技术在免疫细胞研究中的应用随着科技的不断进步，人们对生物学学科的研究也更加深入。
免疫细胞作为人体防御系统的重要组成，其研究一直备受关注。
而流式细胞术技术的出现，为免疫细胞研究带来了新的突破和希望。
一、流式细胞术技术的基本原理流式细胞术技术是一种基于光学原理的单细胞分析技术。
其基本原理是利用激光束对通过流式系统中的细胞进行高速扫描，对细胞信息进行收集和分析，从而实现多参数鉴定和分析单个细胞的功能、表型和状态。
二、流式细胞术技术在免疫细胞研究中的应用1. 免疫表型分析免疫表型是免疫细胞的重要特性之一，其决定了免疫细胞的功能、状态和特性。
流式细胞术技术能够以高通量和多参数分析的方式对免疫细胞表面分子进行鉴定和分析，从而了解免疫细胞的功能、状态和特性。
2. 細胞凋亡研究细胞凋亡是细胞自我调节程序的一部分，是机体对有害因素自我防御的重要形式之一。
流式细胞术技术通过分析细胞凋亡的相关分子信号，可以了解细胞凋亡的程度、过程以及相关的调控因素等。
3. 細胞周期研究细胞周期是细胞生命生长的基本规律，也是细胞分化、增殖、发育以及恶性肿瘤的形成发展过程中的重要参数。
流式细胞术技术可以通过分析细胞周期相关的标记和信号，了解细胞周期各阶段及过程的变化和调控机制。
4. 分泌物分析免疫细胞的重要功能之一是释放各类分泌物。
而流式细胞术技术可以通过检测细胞内的相应分泌物、细胞表面受体和相关信号通路的活性等，揭示其分泌物的功能、产生调控以及调控反馈等方面的信息。
三、流式细胞术技术的发展趋势在免疫细胞研究中，流式细胞术技术的应用不断涌现。
随着技术的不断发展和改进，未来流式细胞术技术的应用将更加方便快捷，分析深度和准确度将大大提升。
同时，与其他生物学技术的配合操作，也将使流式细胞术技术在更广泛的免疫细胞研究领域得到应用。
总之，流式细胞术技术在免疫细胞研究中的应用，将极大地促进对免疫细胞的了解和深入。
相信在未来的研究中，流式细胞术技术会有更加丰富的应用场景。
流式细胞术检测表面抗原原理
流式细胞术检测表面抗原原理流式细胞术检测表面抗原原理介绍流式细胞术（Fluorescence-activated cell sorting，简称FACS）是一种广泛应用于细胞学、免疫学和生物医学研究的技术。
它通过标记细胞表面的抗原，并利用流式细胞仪对细胞进行高效、快速、准确地检测和分选。
FACS的基本原理1.标记细胞表面的抗原：FACS首先需选择一个特定的抗原，用于标记目标细胞的表面。
这通常通过所谓的免疫荧光染色来实现，即将特异性抗体与荧光染料结合，形成免疫荧光复合物。
2.细胞悬浮液的制备：细胞需要先经过胰蛋白酶消化等步骤，使其成为单个的细胞悬浮液。
这样可以保证每个细胞被充分检测和分离。
3.流式细胞仪的工作原理：流式细胞仪通过一个细长的玻璃管道，称为流式细胞仓，使细胞逐个通过。
此时，细胞悬浮液被以一定速率注入细胞仓中，并聚焦在其中。
而激光器产生的强烈光束，则照射到细胞上。
4.激光器的作用：激光器将光束聚焦在细胞仓中，使其与细胞接触。
被标记的细胞表面抗原在激光照射下会发射出与荧光染料相关的特定光信号。
FACS的工作流程1.激光照射和信号接收：经过激光照射后，细胞表面标记的抗原会产生荧光信号，并快速被流式细胞仪的接收系统接收。
接收系统通过特定的光学镜片，将信号转换为电信号。
2.光信号分析：电信号进入流式细胞仪的电子学装置，被放大和数字化。
流式细胞仪软件可以实时监测来自每个细胞的荧光信号，并为其分配特定的数值。
3.数据收集和分析：荧光信号与每个细胞的特定抗原有关联，可以使研究人员对样本中的细胞进行分类和计数。
数据可以以直方图、散点图、表格等形式展示，并可以通过专门的软件进行详细的分析和解读。
应用领域和优势1.细胞免疫表型：FACS可用于研究细胞免疫表型，并在癌症、自身免疫疾病等领域中发现特定的表面抗原。
2.细胞分选：FACS可根据细胞表面抗原的特异性进行高效、准确地细胞分离，用于获取特定表型的细胞亚群。
流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用
流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。
随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。
本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。
关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。
其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。
流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。
近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。
流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。
随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。
1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。
医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位 • ……
用 BrdU. Annexin V 和其他方法检测 增殖和凋亡
FCM Applications
Flow Cytometry Principles
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观
的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定 量的技术。
检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这
是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速 率进行测量。
Flow Cytometry Applications
流式细胞仪四色分析造血干细胞
Flow Cytometry Applications
胞内磷酸化流式Phosflow
Fix
Permeabilize
Stain
Analyze
Flow Cytometry Applications
BD Phosflow —— 精准
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 • • 细胞表面积 • • 核浆比例
• • DNA含量与细 胞周 期
c-Myc
Klf4
Oct3/4
Sox2
小鼠巨噬细胞流式标记
小鼠巨噬细胞流式标记你知道小鼠巨噬细胞吗？说起这个，可能大多数人都会一头雾水。
别急，今天我们就来聊聊这个看起来很高大上的话题。
简单说，小鼠巨噬细胞就是在小鼠体内担任“垃圾清理工”的细胞，它们负责清除细菌、病毒、坏死细胞等等，简直就是免疫系统中的超级英雄，谁敢惹它们，谁就要倒霉。
不过，我们要做的不是单纯了解它们，而是通过流式细胞术给它们“打上标签”，来更好地研究它们。
听起来有点复杂，但别担心，咱们一步一步来，包你听了就懂。
流式细胞术是什么呢？嗯，简单来说，它就像是一条高速公路，让咱们的小鼠巨噬细胞“跑”得又快又准。
这个技术能让我们以非常高的速度、非常精准地观察到每个细胞的“身份”。
不过，问题来了，怎么让我们的小鼠巨噬细胞在人群中脱颖而出呢？就得靠流式细胞术中的一种神奇的标记——抗体。
通过这些抗体，我们就能给细胞贴上“名字标签”，告诉它们，“嘿，你是巨噬细胞，你来这里就对了！”然后，再用流式细胞术快速检测出标记的细胞，从而准确判断它们的数量、大小和状态。
简直就是给细胞做身份证一样，谁不爱呢？你可能会问，标记细胞有啥好处？哎，真的是大有可为。
你想象一下，咱们要研究巨噬细胞在免疫反应中的作用，怎么知道它们到底在哪儿、做了啥呢？直接去看？那就像在茫茫人海中找一个熟人一样难。
可是有了流式细胞术加上这些抗体标记，咱们就能精准定位，轻松看到它们每一个细胞的动态。
要是想研究它们是不是有异常，或者跟其他细胞是不是有某种特殊的互动，流式细胞术的标记功能可真是帮了大忙。
简单说，就像你戴上了夜视镜，能清楚看到别人看不见的东西，精准又高效。
那你是不是觉得流式细胞术好像就像是“看电影”一样简单？它背后可有不少技术含量，光是给小鼠巨噬细胞贴上标签，咱们就得考虑到很多因素。
比如说，抗体的选择得合适，这就像你选鞋子，得选合脚的；再比如说，标记的浓度、时间等细节，每一步都需要精确控制，不然就容易“打错标签”，搞得乱七八糟的，完全不能信。
流式细胞术免疫标记简介(完整)
T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
表面标志需经历一定的变化过程。
如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。
流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、实验原理：
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
B细胞上的CD抗原分为：
①B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、 CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。
（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞， 继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激 活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相 关 抗 原 如 CD25 、 CD26 、 CD30 、 CD69 、 CD70 、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。
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（ 6 ） 造 血 干 、 祖 细 胞 抗 原 有 ： CD34 和 CD90 。 CD34 除表达在早期造血干、祖细 胞外，还表达在约 40% 的 AML 和 60% 的 ALL 上 （7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要 存在于其他系细胞上，但在某些髓系细 胞上也有表达，如：CD4、CD7、CD9、 CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、 CD38等。
进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能
正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti）， 占T细胞总数的60%~70%； CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc ） ， 20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。 前 三 种 表 型 细 胞 的 TCR 主 要 为 TCRα β ， 而 CD4CD8- T 细胞主要表达 TCRγ δ ，他们都执行细胞免 疫功能。
检测细胞表面蛋白抗原
检测细胞胞浆内蛋白性抗原
检测细胞内细胞因子
优势：在同一细胞上同时检测 多种标志
血液系统各型细胞免疫标志
造祖/干细胞
CD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着 细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。 CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一， 并随一定的分化过程表达上调 最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞 标志 结合多种分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育 阶段的标志。 如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标 志； CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。 CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向 的祖细胞。
CD7+、CD2-、C#43;、CD3+、CD4-、CD8-、TCR（即CD4、CD8双阴性） CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性） CD7+、CD2+、 CD3+、CD4+、 CD8-、TCR+ CD7+、CD2+、 CD3+、CD4-、 CD8+、TCR+
二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： • 标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 • A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； • A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 • A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 • 置室温，避光孵育15min。 • 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 • 300g离心5min，弃上清液。 • PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 • 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
（ 4 ）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗 原有： CD14 和 CD33 。 CD14 主要强表达在单核 巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布 只限于造血系统内，表达在髓系祖细胞 CFUGEMM 、 CFU-GM 、 CFU-G 、CFU-M 以及相应的白血 病细胞上。 （5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、 CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目 前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞 系统的特异标志。
B细胞上的CD抗原分为： ① B 细胞限制性（特异性）抗原： CD19 、 CD20 、 CD21 、 CD22 、 CD77 和 CD79 ， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。 ② B 细胞相关性抗原： CD5 、 CD9 、 CD10 、 CD23 、 CD24 、 CD37 、 CD40 、 CD53 、 CD72 、 CD73 、 CD74 、 CDw75 、 CDw76 、 CDw78 、 CD81 、 CD82 、 CD83 、 CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。 B 细胞表面的受体 SIg ，是 B 细胞特异性识别抗原 的受体，也是B细胞重要的特征标志。
CD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相 关抗原-2（LFA-2），表达于人95%T细胞、 50%～70％胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞 （LGL／NK）的表面。 CD3是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细 胞、静息和激活的的外周血T细胞，是鉴定 T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3是早期 和普通型T细胞白血病的主要分型标记。
流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择
有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总 T细胞； 没有明显的特异性标志：可以采用不同抗体组 合，标记某种细胞。如Treg细胞公认的标志为 CD4+CD25+FoxP3+. 表面分子标记可以与胞内分子标记相结合； 免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合： 如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。
B细胞标记
B 细胞 B 细胞的分化主要分为 B 祖细胞、前 B 细 胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细 胞6个阶段。 （1）B祖细胞（pro-B）：此期最早表达的B细胞 特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、 HLA-DR、CD40、CyCD22。 （2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现 CyCD79 、 CD10 、 CD20 、 CD9 、 CDw78 、 CD74 ， cμ + （胞浆IgM重链）。
流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序 一、实验原理： 人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
FACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧 光（Fluorescence）信号
FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）
双色直接染色
流式细胞术免疫荧光标记的应用
（ 3 ） 未 成 熟 （ 早 期 ） B 细 胞 （ immature B cell ）： CD9 、 CD10 消失，出现 SIgM 、 CD22 。 CD20 、 CD24 、 CD40 、 CD72 、 CD74 、 CDw78 、 CD79 表达增加。其他新的 B 抗原 CD37 、 CD2、 CDw75、 CDw76相继出现。 （ 4 ）成熟 B 细 胞（ mature B cell ）： SIgM 和 IgD同时表达，并出现CR、FcR和丝裂原受体，上 述B细胞抗原继续存在。
流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
2009-12-03
上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构
细胞功能
细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量
细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性 抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度
免疫标记技术
免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位 素、酶、发光剂或电子致密物质等作为 示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗 体反应。 流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光 标记技术
T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、 CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志， 且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞 表面标志需经历一定的变化过程。
CD5、CD7是T细胞白血病较特异的标记， 也是髓系白血病时最常见的伴随标记。 CD45则是白细胞的共同标记抗体 CD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表 面，为活化T淋巴细胞标志。胸腺细胞、静 止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表 达。
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和II类人类 白细胞抗原（HLA-DR）的阳性表达对早期 T细胞白血病的诊断有重要价值。 80％～90％和95％以上的NK细胞表达CD16 和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定义NK 细胞。
髓系细胞标记
包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、 CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、 CD61、CD63和CD117等。 这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏 感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。