流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述近年来白血病的免疫分.doc
基于白血病分类的流式细胞术数据分析
基于白血病分类的流式细胞术数据分析白血病是一种相对较为常见的恶性血液病，其患者人数逐年增加。
其中，淋巴细胞白血病与骨髓增生性疾病的鉴别诊断，尤其是B-淋巴细胞白血病与慢性淋巴细胞白血病的鉴别诊断是白血病分类中最为困难的问题之一。
液体肿瘤的流式细胞术可以快速、准确地定量观察肿瘤细胞的表型及其分布状态，从而为诊断、分型、危险分层、疗效评估和指导个性化治疗提供了重要的参考依据。
一、流式细胞仪及其原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种分析生物颗粒的现代化仪器，通过微细水在单细胞水平上分离、激发、检测、采集和分析细胞，使得我们可以从样品中快速、可靠地获得多参数荧光信息。
其主要原理是实现细胞的有效分离、定量、激发和检测，并将其表型指纹信息记录下来，以便科研人员和医生进一步分析和诊断相关问题。
二、流式细胞仪的前处理前处理是流式细胞术的关键环节之一，目的是获得高纯度的单细胞悬液，以方便后续的分离、激发和检测。
其主要包括样本采集、样品制备和细胞洗涤三个方面。
1. 样本采集样本采集是前处理的第一步，样本的质量和数量对后续的分离、检测和数据分析具有重要的影响。
在样本采集过程中，需要注意避免样本污染、细胞凋亡、氧化等对样本品质的影响。
2. 样品制备样品制备是前处理的重要环节之一，主要包括细胞裂解、滤过、质量检测、细胞染色和标记等步骤，在操作过程中，需要严格按照流程要求，精细化操作。
3. 细胞洗涤细胞洗涤是前处理的最后一步，其主要目的是从制备好的样品中，去除多余的细胞碎片、溶质和垃圾等杂质，得到纯净的单细胞悬液。
三、数据分析和诊断数据分析和诊断是液体肿瘤流式细胞术的重要环节之一，通过细胞表型相关分析等手段，展开进一步的诊断、分型以及疾病危险评估。
1. 后续生物信息学分析后续生物信息学分析可以对流式细胞术得到的多参数荧光信息进行进一步的解析和比对，方便分析人员和医生从中挖掘更多的疾病相关指标。
2. 诊断和分型诊断和分型是流式细胞术的重要应用之一，其主要基于患者血液中病理细胞的表型学特征，进一步进行疾病的分类和诊断。
流式细胞术系列之-白血病免疫分型
CD13和/或CD33阳性 HLA-DR阳性 CD34阳性 CD11B，CD15等(+/-) >3%的幼稚细胞表达
MPO。
AML-M2（急性粒细胞白血病部分成熟型）
• 此类型白血病细胞除了占优势的幼稚细胞外还存在已 明显分化的细胞群体，至少已分化至早幼粒细胞或粒 细胞水平。
(immunology， I ) ( cytogenetics，C )
WHO分型(2001)
（MICM）
(morphology，M ) (immunology， I ) ( cytogenetics，C)
(molecular biology, M)
L1型
急淋
急
性
（ALL）
白
L2型 L3型
细 胞
M0: 微分化型髓系白血病；
标本来源
（1）外周血 （2）骨髓穿刺液， （3）骨髓活检标本 （4）淋巴组织穿刺
样本保存
要 求： •室温条件(16℃ -28℃ )存放； • 如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液 体（如 生理盐水或组织培养液）。
保存时间
1. 肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为48～72小时； 2. EDTA抗凝标本，存放时限只有12 ～ 24小时，因为髓细胞
胞内染色 CD3\CD79a\MPO
可以确定白血病分CD7
B系：CD10、CD19、CD20 表面染色 髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33
非系列特异的抗体：CD34、HLA-DR 泛白细胞标志：CD45
进一步 细分
其它 CD4、CD8、CD61、CD56、CD38 必要时可以加用
白血病免疫分型测定
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11 Nhomakorabea上机测样
报告结果
报告百分数
操作性能
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。
采集部位腰穿采骨髓
抗凝剂肝素抗凝
要求1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4：鞘液液体20L室温
5：清洗液液体5L室温
应用流式细胞仪对176例急性白血病进行免疫表型分析
应用流式细胞仪对176例急性白血病进行免疫表型分析急性白血病是一种由于造血干细胞发生异常增殖或分化障碍而引起的血液系统恶性肿瘤疾病。
精准的免疫表型分析可以为临床诊断、疾病分型和治疗选型提供准确的基础数据，流式细胞仪作为一种先进的免疫学检测技术，能够敏锐的分辨各种细胞的表型特征，因此成为研究、诊断急性白血病的重要方法之一。
本文通过分析176例患者的免疫表型，探讨了流式细胞仪在急性白血病诊断中的应用。
在分析过程中，我们首先采用流式细胞仪检测患者血液中的白细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的表型特征，发现不同类型的急性白血病白细胞的表型特征差异显著。
以AML-M1型急性髓系白血病为例，该型白血病细胞通常表现为CD33、CD13、CD14、CD15等多种粒细胞系标记阳性，而CD34、CD41等为幼稚血细胞标志物阳性。
而ALL-T2型急性淋巴系白血病的淋巴母细胞往往表现为CD10、CD19、CD34、CD45、CD123等标记阳性。
通过这些特征的分析，我们可以对不同类型的急性白血病进行准确的诊断、分类。
同时，我们还应用流式细胞仪检测了患者白细胞的CD34+和CD117+细胞数量，发现在急性髓系白血病中，CD34+和CD117+细胞较高，而在急性淋巴系白血病中，这两种细胞的数量明显降低。
基于这些数据，我们可以更精确地评估患者的病情严重程度和预后。
此外，我们还对患者骨髓中的淋巴细胞进行了CD45RA和CD45RO的表型分析，发现在某些淋巴系急性白血病中，CD45RA+淋巴细胞数量降低，而CD45RO+淋巴细胞数量增多。
这一结果提示了CD45RA和CD45RO在急性白血病中具有重要的临床应用价值，可以用于病情的评估和疾病类型的判断。
综上所述，流式细胞仪具有高灵敏度、高分辨率，能够对患者血液中各种细胞的表型特征进行快速、准确的检测，对急性白血病的诊断、分类、评估病情严重程度和预后等方面具有重要的应用价值。
随着流式细胞仪技术的不断发展，相信在未来，它将在临床急性白血病诊断、治疗中发挥着越来越重要的作用。
流式细胞术在急性白血病免
流式细胞术在急性白血病免疫分型中的应用中山大学附属第三医院血液内科胡元医师•流式细胞术工作原理•流式细胞术的应用•白细胞分化抗原与白血病•白血病细胞的免疫分型1)急性髓系白血病2)急性淋巴细胞白血病3)急性混合细胞白血病4)急性未分化细胞白血病5)慢性粒细胞白血病6)慢性淋巴细胞白血病What Is Flow Cytometry（FCM）?l Flow ~ cells in motionl Cyto~ celll Metry~ measurel Measuring properties of cells while in a fluid stream流式细胞仪结构•液流系统依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。
•光路系统细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。
•电系统把光信号转换为电信号。
•分选系统对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。
工作流程•待测细胞标记(荧光素,荧光+单抗,荧光+双抗)，制成单细胞悬液•待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域•激光与荧光素标记的待测细胞相交，激发荧光素产生荧光信号•激光光束与经过荧光素标记的细胞相交，荧光素受激发后产生荧光信号，通过对荧光信号的检测和定量分析，从而得到细胞相关参数的定性、定量测定。
前向角散射（FSC）：反应被测细胞的大小（直径）FSCDetector侧向角散射(SSC)：细胞内精细结构、细胞内颗粒信息激光束SSC DetectorFSCDetectorFCM光电系统何为“设门”？通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
正常骨髓CD45/SSC 流式细胞图FSCS S CGranulocytesMonocytesLymphocytesRBCs , Debris,Dead CellsSSC/FSC 设门二维散点图流式细胞术的应用•免疫细胞的检测、定量、分选（胞内外CD分子）•血小板（CD41.42b.61.63,网织血小板,PA-IgG）•DNA、RNA及染色体检测(DNA倍体异质性)•细胞凋亡与增殖（半胱氨酸蛋白酶;DNA含量,Ki-67,CD71）•造血干细胞检测、定量、分选（CD34，磁珠分选）•细胞内蛋白检测(癌基因蛋白,抑癌基因蛋白,P170)•等等白血病相关分化抗原•系列相关性抗原1)T CD2、(m/Cy)CD3、CD4、CD5、CD7、CD82)B CD10、CD19、CD20、(Cy)CD22、(Cy)CD79a3)NK CD16,CD56,CD3-4)浆细胞5)髓系：CD13、CD33、CD14、CD15、CD117、CD11b、MPO6)红细胞：Gly-A7)巨核细胞系：CD41，CD42b，CD61，CD 63白血病相关分化分化抗原•非系列相关性抗原CD34、CD45、HLA-DR、CD38、CD71、TdT•白细胞共同抗原CD45结果判断CD45 /SSC设门MPO≥10%为阳性，CD34 > 10%，其他CD≥20%为阳性急性白血病细胞的免疫分型FCM实例Mü至少表达1个髓系特异性CD，如CD33，CD117，CD13，MPOü可表达CD7或CD4M1ü表达MPO，CD13，CD33，CD117，CD15，HLA-DR。
流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述近年来白血病的免疫分
一、流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。
早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。
国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
1．流式细胞仪诊断白血病的依据⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。
⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。
即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。
这群细胞充盈于骨髓。
正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。
因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。
白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。
2．流式细胞仪诊断白血病的意义⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。
②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。
③混合性白血病。
④部分髓系白血病。
目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。
⑤慢性淋巴细胞白血病。
⑥微小残留白血病。
⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。
髓系白血病免疫分型
髓系白血病免疫分型髓系白血病是一种以骨髓中白血病细胞异常增殖为主要特征的恶性肿瘤。
随着医学技术的不断进步，对于髓系白血病的免疫分型也越来越重要。
免疫分型可以帮助医生更准确地确定疾病的类型和预后，指导治疗方案的制定。
免疫分型是通过检测患者的免疫系统反应，来帮助区分病情的一种方法。
在髓系白血病中，免疫分型可以帮助确定白血病细胞的类型，进而指导治疗方案的选择。
免疫分型主要通过检测白血病细胞的表面标志物来实现，这些标志物在不同类型的白血病中表达不同。
在髓系白血病的免疫分型中，常用的方法包括流式细胞术和免疫组织化学染色。
流式细胞术可以通过检测白血病细胞的表面标志物，帮助确定其免疫分型。
而免疫组织化学染色则可以通过染色白血病组织，来帮助确定其类型。
免疫分型在髓系白血病中的应用已经成为临床诊断和治疗的重要手段。
通过免疫分型，医生可以更准确地确定疾病的类型，有效评估预后，并制定个性化的治疗方案。
免疫分型在临床实践中的应用，为患者提供了更加精准和有效的治疗手段，提高了治疗效果和生存率。
在不同类型的髓系白血病中，免疫分型的方法和意义也有所不同。
例如，在急性淋巴细胞白血病中，免疫分型可以帮助确定细胞的来源，进而指导治疗方案的选择。
而在慢性髓样白血病中，免疫分型可以帮助确定疾病的分期和预后。
除了帮助确定病情和制定治疗方案外，免疫分型还可以帮助监测疾病的进展和治疗效果。
通过定期的免疫分型检测，医生可以及时发现疾病的变化，调整治疗方案，提高治疗效果和生存率。
在髓系白血病免疫分型的研究中，还存在许多挑战和问题需要解决。
例如，如何准确识别白血病细胞的表面标志物，如何区分不同类型的白血病，如何提高免疫分型的准确性和可靠性等。
未来的研究应该致力于解决这些问题，进一步完善髓系白血病的免疫分型方法，提高其在临床实践中的应用价值。
让我们让我们总结一下，髓系白血病免疫分型是一种重要的临床诊断和治疗手段，对于指导治疗方案的选择、提高治疗效果和生存率都具有重要意义。
流式细胞术(FCM)在急性白血病免疫分型中的临床意义研究
流式细胞术（FCM）在急性白血病免疫分型中的临床意义研究发表时间：2016-11-22T17:22:49.410Z 来源：《航空军医》2016年第21期作者：王红艳1 许兴路2 [导读] 白血病是严重威胁人类生命健康的恶性疾病之一，是造血干细胞的恶性克隆性疾病。
1哈尔滨市红十字中心医院黑龙江哈尔滨 150000；2黑龙江省医院黑龙江哈尔滨 150000 【摘要】目的：分析流式细胞术在急性白血病免疫分型中的临床意义。
方法：采用流式细胞术对急性白血病细胞进行免疫分型结合传统细胞形态学检查，对2种检测结果进行分析。
结果：1、临床初诊52例白血病患者中，FAB分型AML27例，ALL25例。
流式细胞术检出单纯型AML19例，伴淋系6例；单纯型ALL14例，伴髓系10例；双表型2例，未分化型1例。
2、AML 形态学分型与免疫分型完全符合率66.7%、部分符合率22.2 %；ALL 形态学分型与免疫分型完全符合率56 %，部分符合率40%。
结论：利用流式细胞术，识别白血病细胞分化抗原（CD）系列的特异性荧光素标记的McAb鉴别膜、浆与核的抗原，对白血病的诊断及分型具有重要作用，是FAB分型的重要补充，两者结合可提高诊断准确率。
【关键词】流式细胞术（FCM）；急性白血病；免疫分型Reserch on the clinical significance of flow sytometry in the classification of acute leukemia 1Wang Hongyan，2Xu Xinglu（1Ha Erbinred cross center hospital，Hei Longjiang，Ha Erbin150000；2Hei Longjiang Provincial Hospital，Hei Longjiang，Ha Erbin150000）【Abstract】 Objective：Analyze the clinical significance of flow cytometry in the classification of acute leukemia.Methods：2 kinds of detection results were analyzed by using flow cytometry to detect the expression of ALL cells in combination with traditional cell morphology.Results：1、52 cases diagnosed leukemia patients，among these，FAB typing AML27 cases，ALL25cases，detect by flow cytometry，AML19 cases，Ly +AML6 cases；ALL14 cases，My +ALL10 cases；HAL2 cases，UAL1 cases. 2、In AML the accordance rate and part accordance rate of the two phenotypes was 66 .7% and 22 .2%.In ALL the accordance rate was and part accordance rate was 56% and 40%.Conclusion：Using flow cytometry，identification of a series of leukemia cell differentiation antigen （CD）- specific fluorescein labeled McAb to identify the membrane，cytoplasm and nuclear antigen，plays an important role in leukemia diagnosis and typing，and also is an important supplement of FAB typing，the combination can improve the accuracy of diagnosis.Key words：flow cytometry；acte leukemia；immunophenotype白血病是严重威胁人类生命健康的恶性疾病之一，是造血干细胞的恶性克隆性疾病，因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育不同阶段，白血病细胞大量增殖积聚，致使造血功能不能正常进行[ 1]。
急性白血病系别判断的流式细胞免疫分型
三、急性白血病系别诊断标准
• EGIL诊断标准缺点： • （1）关于阳性定义，因为影响因素众多，有时存在歧义； • （2）对于某些覆盖率低、特异性高的标志，给予分值低或者未纳入，如CD64、CD14； • （3）对某些常见伴系表达标志予以极低分值，如CD7，未考虑荧光强度的差异； • （4）对于相对特异、在某系别易于伴发的标志，未考虑差异对待，如cCD79a、CD10
三、急性白血病系别诊断标准
• 鉴于几乎没有任何标志是绝对敏感和特异的，做全标志有助于降低误诊风险，因此 在系别筛查时如果出现系别标志表达过多或者过少，或者伴系表达标志的强度超过 标本中残留的正常细胞时，首先应该做全两个诊断标准涉及的相关系别标志，必要 时甚至需要增加CD371等新的髓系标志。
• 在此过程中可以选择一步法或者两步法。选择一步法的实验室，以目前常用3激光8 色机型为例，可供参考的5管法见表3；选择两步法的实验室，第一步进行系别筛查， 包括髓系MPO（或者CD33）和CD117，T系CD7和cCD3、B系CD19和CD22，根据 采用仪器型号不同可能有差异，4色方案可以参考2015年4色流式细胞术中国专家共 识，3激光8色推荐方案见表3。
三、急性白血病系别诊断标准
三、急性白血病系别诊断标准
• 注意几个标志的FCM检测： • （1）MPO：使用克隆号8E6、MPO-7的抗体需要小心，因为均有在B-ALL表达的
报道；阳性阈值虽然大多数沿用10%，但是建议结合荧光强度，并且不典型病例应 该做全其他髓系标志，并结合细胞化学和免疫组化MPO检测结果；FCM破膜处理 可能会使粒细胞的侧向角光散射（side scatter，SSC）降低，从而影响CD45/SSC设 原始细胞门的精确度，导致假阳性结果，正确的方法应结合原始细胞标志修订设门。
流式细胞术免疫分型在急性髓细胞白血病诊断中的应用何文英
·综述·流式细胞术免疫分型在急性髓细胞白血病诊断中的应用江西省抚州市医学科学研究所（344000）何文英南昌大学第一附属医院彭宽流在医学研究领域中，流式细胞仪（flow cytometer，FCM）能够快速分析单个细胞的多种特性，它既可以定性也可以定量，适用于大量标本的检测。
流式细胞仪可以为全血、骨髓、渗出液、脑脊液、尿液和固体组织等很多的样本进行免疫分型，并可检测细胞大小、胞质内容物、DNA、RNA及大量的膜蛋白和胞内蛋白。
临床上采用的急性白血病法，美、英协作组分类标准（FAB）分类方法是基于形态与细胞学检查基础，但这种方法对于来源于同一系列的急性白血病间的鉴别不甚理想，甚至有时对于不同系列的白血病鉴别也较困难[1]。
对伴有髓系抗原表达的急性淋巴细胞白血病（ALL）、伴有淋系抗原表达的急性髓细胞白血病（AML）、区分T-ALL和B-ALL、急性混合型以及细胞形态特征不典型的白血病等的诊断也较困难。
自从Foon与Todd在1986年提出白血病免疫分型以来，FCM已成为诊断血液系统恶性肿瘤不可缺少的重要工具，广泛应用于白血病的临床检测[2]。
其突出的优势是能在分子水平对细胞的理化性质和免疫学特征进行简单、快捷、定性、定量分析，且能够检测残存白血病或标本中幼稚细胞低于50%的白血病[3]。
精确的流式细胞仪技术免疫分型通过分析白血病细胞群中特异抗原（CD）的表达特点，不仅能够给诊断提供客观的指标，而且能够根据某些抗原表达的情况来研究疾病的发展和判断预后[4]。
以下阐述流式细胞仪技术免疫分型在急性髓细胞白血病诊断中的应用。
1流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的结构一般可分为5个部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测与存储、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
流式细胞仪可以检测单个细胞的可见光和荧光特性。
通过检测细胞大小和内容物等物理特性可以对细胞进行分群。
白血病流式免疫分型
白血病流式免疫分型白血病是一种造血系统恶性肿瘤，由于白细胞数量和质量的异常增加，导致机体免疫功能下降，造成多种系统和器官功能异常。
白血病的治疗首先需要确定其类型和分型，以便制定有效的治疗方案。
流式免疫分型作为一种先进的白血病诊断技术，已被广泛应用于临床实践中。
白血病流式免疫分型是将细胞标记物与荧光标记结合，通过流式细胞术对细胞进行定量、定性的分析，进而确定白血病的类型、分型。
它可以快速、灵敏地检测单个细胞，检测出极低浓度的异常白细胞，并对相关疾病进行准确的诊断和分类，特别是对淋巴瘤和白血病的鉴别诊断。
流式免疫分型在白血病治疗诊断中的应用既可以确定疾病的类型，也可以指导治疗方案的制定。
对于急性白血病的治疗而言，流式免疫分型可以评估化疗药物敏感性、预测预后，以及指导骨髓移植的实施，从而提高治疗的效果和疗效。
对化疗失败的慢性淋巴细胞白血病患者进行流式免疫分型，可以确定其恶性程度、预测预后及制定诊断治疗方案，如靶向药物治疗等新的治疗手段。
不过，需要指出的是，流式免疫分型虽然是一种有效的白血病诊断技术，但其存在一定的局限性。
例如，对于某些罕见的白血病类型，目前流式免疫分型无法完成准确的分类，需要结合其他诊断手段进行综合判断。
同时，由于流式免疫分型涉及大量的细胞学和生化实验，其实验成本也比较高，还需要一定的技术开销和专业操作的知识。
综上所述，白血病流式免疫分型作为一种先进的白血病诊断技术，已经逐步成为临床实践中的标准操作。
它可以对白血病患者进行准确的分类和疾病诊断，指导治疗方案的制定，同时也为临床科研提供了有力的手段和工具。
但需要注意的是，流式免疫分型还需要不断探索和深入，结合其他先进技术和诊疗方法，共同提高白血病治疗的水平和效果。
流式细胞术在急性白血病免疫分型中的应用探讨
流式细胞术在急性白血病免疫分型中的应用探讨目的应用多参数流式细胞术检测急性白血病细胞表面CD抗原分子的表达水平，探讨AML和ALL中CD抗原的表达规律，为临床个体化治疗累积分子机制研究材料。
方法应用流式细胞术检测44例急性髓细胞白血病患者和18例急性淋巴细胞白血病患者，以CD45/SSC设门，应用13种单克隆抗体对CD45弱表达的细胞群进行免疫分型，测定多种CD分子的表达率，并通过χ2检验比较不同的高表达CD分子的相关性。
结果44例AML患者中表达且高表达CD33（79.6%），CD38（70.5%），CD117（52.3%），cyt-MPO（50.0%）；16例B-ALL 患者中CD10（75.0%），CD19（81.25%）以及CD22（81.25%）阳性表达率较高；比较AML患者高表达CD抗原，结果显示CD33/CD38、CD33/cyt-MPO的抗原表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。
结论不同的CD分子在急性白血病细胞上表达有差异性，或将为靶向治疗和临床个体化治疗提供有用的线索。
[Abstract] Objective To detect the expression level of CD antigen on the surface of acute leukemia cell by multiparameter flow cytometry，and to explore the expression principle of CD antigens in AML and ALL，so as to accumulate molecular mechanism research materials for clinical individualized treatment. Methods 44 patients with acute myeloid leukemia and 18 patients with acute lymphoblastic leukemia were detected by flow cytometry. Based on CD45/SSC，13 types of monoclonal antibodies were used to carry out immunophenotype of the cell population with weak expression of CD45，and expression rate of various CD molecules was determined. The χ2 test was used to compare the correlation of different highly expressed CD molecules. Results CD33（79.6%），CD38（70.5%），CD117（52.3%）and cyt-MPO （50.0%）were highly expressed in 44 patients with AML；the positive rate of CD10（75.0%），CD19（81.25%）and CD22（81.25%）was higher in 16 patients with B-ALL；the high expression of CD antigens in the patients with AML were compared. The results showed that there was a statistically significant difference in the antigen expression of CD33/CD38 and CD33/cyt-MPO（P ＜0.05）. Conclusion Different CD molecules are differentially expressed on acute leukemia cells，or they will provide useful clues for targeted therapy and clinical individualized treatment.[Key words] Flow cytometry；Acute leukemia；Immunophenotype；CD molecules；Expression correlation急性白血病（acute leukemia，AL）根據FAB协作组（French-American-British Group）将AL分为两类，分别是急性髓系细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴系细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）[1]。
免疫分型 基础介绍
近年来白血病得免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少得重要标准之一、早年曾用过得荧光显微镜或APAAＰ方法基本被废弃。
国际上公认得通用得方法就是流式细胞术(FCM)。
流式细胞术白血病免疫分型就是利用荧光素标记得单克隆抗体(McAb)作分子探针,多参数分析白血病细胞得细胞膜与细胞浆或细胞核得免疫表型,由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
ﻫ1、流式细胞仪诊断白血病得依据⑴FＣM能快速,多参数,客观得定性又定量测定细胞膜、浆、核得抗原表达ﻫ⑵至今尚未发现白血病得特异抗原。
ﻫ⑶能用正常血细胞得单抗来进行免疫分型就是基于白血病形成得分化阻断学说。
即白血病细胞基因异常,分化受阻于某阶段形成不同亚型得白血病、这群细胞充盈于骨髓。
正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞得过程中,细胞膜、细胞浆或胞核抗原得出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞得分化发育阶段密切相关,而且表现出与细胞系列及其分化程度相关得特异性。
因此,这些抗原得表达与否可作为鉴别与分类血细胞得基础。
白血病就是造血系统得恶性肿瘤,在形态上变化虽相当大,但仍能表达正常血细胞所具有得抗原,因而仍可依据其抗原得表达谱对白血病进行免疫分型。
2、流式细胞仪诊断白血病得意义ﻫ⑴骨髓血细胞就是形态学分型得基础,FCＭ白血病免疫分型就是对形态学分型得重要补充与进一步深化,国际白血病MIＣ分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都就是必不可少得,对下列情况意义更大:①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源得白血病。
②形态学为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性未分化白血病(AUL)但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。
③混合性白血病。
④部分髓系白血病。
目前,免疫分型对粒细胞与单核细胞白血病得鉴别尚有一定困难。
⑤慢性淋巴细胞白血病。
⑥微小残留白血病、⑵临床预测;可根据抗原得表达情况预测病情得预后:如白血病患者有ＣD7+与CＤ3４+共表达,预后不好。
⑶疾病监测:可监测病程得发展,疗效,可进行微小残留白血病得检测。
流式细胞术系列之-白血病免疫分型
CD13和/或CD33阳性， CD34、HLA-DR通常阳 性，缺乏髓系成熟分化 抗原：CD11B，CD15等， 有时会表达CD7或CD4； MPO阳性率一般小于 3%。
AML-M1
• CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD15与CD11B可以阳性， 血型糖白A阳性，MPO阳性/阴性。
• 本例中可见两群幼稚细胞，M6的定义是红系祖细胞占骨髓幼 稚细胞群体的50%强，而其他系别的幼稚细胞可占30%以上。
• 固诊断M6时要依据形态学红系细胞的数量来确定，如仅根据 免疫分型很难得出正确诊断，必须结合形态计数幼稚细胞数 量来确定。以上是典型的M6免疫分型图，出现两群幼稚细胞。
• 根据骨髓细胞CD45/SSC 图中 分布情况设门圈定各类细胞
• R1 门为成熟淋巴细胞 • R2 为正常单核细胞位置 • R3 门正常粒细胞位置 • R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置 • R5 门为有核红细胞或细胞碎片
位置 • R6 门为幼稚髓细胞出现位置 • 白血病细胞通常会在R4 R6 两
胞内染色 CD3\CD79a\MPO
可以确定白血病分别属于T/B/髓系
全
套
T系：CD2、CD5、CD7
B系：CD10、CD19、CD20 表面染色 髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33
非系列特异的抗体：CD34、HLA-DR 泛白细胞标志：CD45
进一步 细分
其它 CD4、CD8、CD61、CD56、CD38 必要时可以加用
B-ALL
在CD45/SS点图中，幼稚细胞群体低SSC信号，与成熟淋 巴细胞比较CD45弱表达
流式细胞基本原理和在白血病中应用课件
• T lineage
– Cytoplasmic CD3 (flow cytometry with antibodies to CD3 epsilon chain; immunohistochemistry using polyclonal anti-CD3 antibody zeta chain, which is not T-cell specific) or
分子生物学
急性白血病免疫分型的价值
• 区分淋系、髓系白血病 • 区分淋系白血病中的T、B-ALL • 鉴定混合细胞性白血病的类型：
T-M、B-M、T-B、T-B-M
• 治疗过程中监测MRD，评价疗效 • 提示某些遗传学异常：
CD19+AML---t(8;21)； CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)
• AML
CD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO – 怀疑M6加做CD71、GPA – 怀疑M7加做CD61、CD41、CD42
• B-ALL
CD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79a
• T-ALL
CD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、 CD1a、cCD3
– Surface CD3 (rare in mixed phenotype acute leukemia)
• B lineage
– Strong CD19 with at least 1 of the following strongly expressed:CD79a,cytoplasmic CD22, CD10 or
白血病淋巴瘤免疫分型 (2)
Burkitt 淋巴瘤和滤泡淋巴瘤
2019年3月20日星期三6时4分52秒
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评估慢性淋巴增殖性疾病(CLD)的抗体
First: CD5、CD19、kappa、lamda
CD3、CD20、CD23、CD10、CD45
B-cell：CD22、FMC7、CD11c、CD103、CD138 CD38、CD25、CD79b (约12-15Ab)
CD13/CD33；
结合临床情况，符合原始巨核细胞 的免疫表型。
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急性巨核细胞白血病
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初治急淋分型
Acute Leukemia – Blasts Present >20%
CD7+ and/or CD2+
T-Lineage
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FACS在血液病诊断中的应用
FACS在白血病MRD检测中的应用
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血病。
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急性单核细胞白血病
从左图 CD45 和 SSC 二维散点图中，可 以看出 R1 为成熟淋巴细胞， R3 为粒系， R4 为红系（ CD36+ 、 GLyA+ ） R5 为原始细胞 区域比例较低。而 R2 所占比例较大，通过 分析得出： 1、 CD45表达较强， SSC较大，为单核系的 特点。 2、 R2表达HLA-DR、CD4和CD14（部分表 达）、CD36、CD38、CD13/CD33； 3、不表达CD8，GLyA。 结合临床情况，符合急性单核细胞白血 病。 2019年3月20日星期三6时4分52秒
白血病免疫分型
白血病免疫分型白血病的免疫分型主要是根据造血干细胞再分化发育过程中，不同的阶段，细胞表面的分子标记也不同这一规律，反推出细胞是处于哪个阶段以及细胞属于哪个系别来源。
一般使用流式细胞仪去检测细胞上面表达的抗原，通过检测，我们可以判断出白血病细胞属于哪个系列来源以及处于分化的哪个阶段，最终来确诊白血病的类型。
此种白血病的分型即为免疫分型。
白血病免疫分型是诊断白血病的重要标准，对于白血病选择化疗药物以及估计预后是非常重要的。
白血病的免疫分型最早由欧洲提出来，它主要是根据造血干细胞再分化发育过程中，不同的阶段，细胞表面的分子标记也不同这一规律，反推出细胞是处于哪个阶段以及细胞属于哪个系别来源。
一般使用流式细胞仪去检测细胞上面表达的抗原，通过检测从而判断出，白血病细胞属于哪个系列来源以及处于分化的哪个阶段，最终来确诊白血病的类型。
此种白血病的分型即为免疫分型。
白血病免疫分型一般是对白血病细胞表面表达的分子进行相关检测。
1、白血病的诊断需要骨髓穿刺、骨髓液免疫分型、染色体和基因检查以进一步诊断，骨髓细胞学诊断白血病的准确性仅为70%左右。
如果同时增加白血病的免疫分型，白血病的明确诊断准确率可以接近100%。
2、白血病免疫分型是指对白血病细胞表面表达的分子进行相关检测，可以进一步区分急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和慢性髓系白血病等类型。
同时还需要检查融合基因的染色体，以便对白血病诊断后的预后进行分层，并制定个性化的化疗方案。
建议平时多进行体育锻炼，增强自身免疫力。
急性白血病是造血干细胞的克隆性恶性疾病，发病时骨髓中异常的原始细胞大量增殖并浸润各种器官组织，正常造血受到抑制。
急性白血病分为急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病，这两类还可分成多种亚型。
白血病的分型采用MIC分型，即形态学、免疫学和细胞遗传学结合的分型。
根据白血病细胞免疫学标志，不仅可将急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病进行区别，而且还可将T细胞和B细胞急性淋巴细胞白血病加以区别。
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一、流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。
早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。
国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
1．流式细胞仪诊断白血病的依据⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。
⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。
即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。
这群细胞充盈于骨髓。
正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。
因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。
白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。
2．流式细胞仪诊断白血病的意义⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。
②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。
③混合性白血病。
④部分髓系白血病。
目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。
⑤慢性淋巴细胞白血病。
⑥微小残留白血病。
⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。
⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。
二、免疫分型常用的免疫标志及其意义1．白血病系列分化抗原T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。
B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。
NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。
髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。
红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。
巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。
2．白血病系列非特异性抗原CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。
一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－D R＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－D R－、CD38＋。
3．白血病分化阶段抗原T细胞抗原CD4、CD8。
B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。
4．白细胞共同抗原CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts ）依次减弱。
红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。
用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。
用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC 、McAb2-PE、CD45PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。
三、白血病及淋巴瘤免疫分型1．AMLM O：有低的SSC和FSC。
在CD45－SSC图上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD116，但MPO比CD13与CD33更灵敏。
一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4。
一般HLA－DR、CD34阳性，有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。
M1：流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－D R－，但CD34表达少于M0，可能表达部分CD15。
M2：M0 与M1的主要区别是成熟度增加，blasts 减少，CD15较M1较显著，CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLA－D R（-）。
CD45－SSC图显示从髓系blast 区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45－SSC图有助于确定blasts 比例。
M3、高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟C少，多数情况HLA－D R（- ）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表达。
M4与M5：两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34（＋），较之M0、M1，M4与M5有更大的FSS和SSC，CD45－SSC图上，成熟C出现在单核区，重要的表型为CD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（＋）。
M6：M6 较少见且特征不明显，一般HLA－D R，CD34、CD13、CD33阳性，CD45－SSC图显示主要为红系成份。
M7：巨核细胞白血病，在AML中少于1％。
一般CD61（GpⅢa）和/ 或CD41（GpⅡb- Ⅲa）阳性，而注意由于血小板粘附在blasts 上造成的假阳性，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测G pⅡb/ Ⅲa与CD34以减少激活血小板的粘附。
2．ALL：ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25％，在成人，ALL约占急性白血病的25％，我们将ALL分为 B 祖细胞型，CD10＋或CD10－，前 B 细胞型，B细胞型，T 细胞型。
B祖细胞型ALL：在幼儿约占ALL 的65％～70％，青少年为55％～60％，成人为50％。
在儿童，约90％病例CD10＋，在幼儿只有少于50％病例CD10＋，blasts 一般FSC、SSC很少，是FAB标准的L1或L2，一般TdT(+)HLA-DR(+) ，CD19(+)，此型又分为 2 个亚型，CD10＋和CD10－，前者预后好，多数病例CD24＋，CD34＋，CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg- 。
前B 细胞型ALL：此亚型约占儿童ALL的25％，细胞一般为CD19＋，CD24，HLA－D R＋，胞浆CD22＋，CD10＋，TdT 随CD20变化，CD34多为阴性，前 B 亚型被认为比 B 祖型预后更差，这与t(1 ；19)出现相关并由此产生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型为CD19＋、CD10＋、CD9＋，不同程度CD20表达，CD34－，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。
B细胞型ALL：成熟B细胞型ALL约占ALL2％～5％，B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45－SSC图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多数为IGM）多数病例CD10＋。
但成熟抗原及sIg 使之区别于更早的 B 系ALL，极少数成熟 B 细胞ALL无FAB－L3 形态。
T－ALL：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8双阳与极少膜表面CD3、TdT多为阳性。
另一常见亚型为皮质早期表达CD2、CD5、CD7、TdT强表达。
髓质期亚型表达CD2、CD5、CD7、与CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少见TdT表达。
前T 细胞亚型，表达CD7胞浆CD3＋且无其它T 细胞抗原，T 细胞肿瘤的特征是丧失T 细胞抗原而表现出其它异常抗原组合。
杂合型白血病：随着流式技术的广泛应用，我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t(9 ；22) 或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。
最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强调弱的非特异性结合，忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B系、T 系、髓系分别为CD22、CD3和MPO。
3．CML：由于慢性期显著的细胞分化，在CD45－SSC图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CML可确诊，CML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续 1 年左右最终发展为加速期和急变期。
流式细胞技术对急变期亚型的诊断具有极高价值。
直接影响到治疗效果。
急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。
淋性急变具典型形态特征，为CD10＋B 祖细胞ALL 极少有T 细胞型ALL。
4．CLL：CLL细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。
免疫分型主要为：SIgM、SIgD 弱表达，B系抗原为CD19、CD20、CD43、CD79a与CD5共表达，CD23表达使得CLL 区别于帽细胞淋巴癌MU，即（CLL：CD23＋，MCL：CD23－），CD10－、CD23－、CD11c和CD25、CD20常弱表达，尽管CLL起病慢，但CLL病人的生存率变化很大，有染色体异常的病预后不良，最常见的三联体trisony12 、14q、13q、11q，免疫表型上没有特异的变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常。
最近，有研究表明，三联体trisony12 与SIg、CD20表达量高度相关，与CD23－相关与FMC7相关。
B型前淋巴细胞白血病（B－DLL）较CLL更为严重，流式细胞技术在区分B－DLL和CLL上发挥很大作用，B－DLL多为CD5－，CD22＋，表达更强的sig 。
MU病人平均生存率不超过 5 年，与CLL在形态上很难区分，与CLL相似有CD5＋B 祖细胞，但Sig 表达强于CLL，且CD22－。
另一与CLL难于区分的是FCC，细胞为强Sig 、CD5－、CD10＋、CD23＋，具 B 系表型：对于诊断为CLL，CD5、FMC7、CD22与SIg ，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为DLL、MCC或CLL的亚型（trisomy12 ）因为它们危险性更大。
四、流式细胞仪免疫分型实验1．样本采集、运输、保存和操作⑴样本类型：适用于多种临床标本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、淋巴样组织活检物、浆液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。
⑵抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。
如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝。
骨髓穿刺可用肝素。
其他体液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的样本活性可能会降低，EDTA的优点是成熟髓性细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小，但细胞散射光特征丢失较肝素标本快；由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD做骨髓穿刺抗凝剂。